本發(fā)明屬于細(xì)胞工程領(lǐng)域，具體涉及一種提高雜交瘤細(xì)胞單克隆抗體產(chǎn)量的培養(yǎng)方法。

背景技術(shù)：

1、單克隆抗體已成為許多疾病診斷和治療的重要手段，如癌癥、自身免疫性疾病、感染性疾病等。它們可以特異性地結(jié)合到病原體或病變細(xì)胞上，從而達(dá)到治療或診斷的目的。在生物學(xué)研究中，單克隆抗體被廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)功能研究、細(xì)胞信號傳導(dǎo)研究、免疫學(xué)研究等領(lǐng)域。它們可以作為探針、標(biāo)記物或抑制劑，幫助科學(xué)家更深入地了解生物體的奧秘。單克隆抗體也是藥物研發(fā)的重要工具。它們可以作為藥物的載體或靶標(biāo)，幫助開發(fā)新的藥物或改進(jìn)現(xiàn)有藥物。

2、隨著生物學(xué)和生物制藥領(lǐng)域的快速發(fā)展，雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)也在不斷優(yōu)化和拓展其應(yīng)用領(lǐng)域。隨著分子生物學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)的發(fā)展，雜交瘤細(xì)胞技術(shù)的各個環(huán)節(jié)都得到了優(yōu)化，包括融合方法的改進(jìn)、篩選技術(shù)的提高、培養(yǎng)條件的優(yōu)化等，從而提高了雜交瘤細(xì)胞的穩(wěn)定性和單克隆抗體的特異性。

3、雖然雜交瘤細(xì)胞可以穩(wěn)定地生產(chǎn)單克隆抗體，但其產(chǎn)量往往較低，難以滿足大規(guī)模生產(chǎn)和應(yīng)用的需求。雜交瘤細(xì)胞的生長動力學(xué)研究是了解細(xì)胞生長規(guī)律和優(yōu)化培養(yǎng)條件的基礎(chǔ)。然而，在實(shí)際操作中，由于細(xì)胞生長環(huán)境的復(fù)雜性和細(xì)胞株的差異性，往往難以準(zhǔn)確預(yù)測和控制細(xì)胞的生長速度。此外，細(xì)胞生長過程中還可能出現(xiàn)停滯、衰老等現(xiàn)象，進(jìn)一步增加了實(shí)驗(yàn)的難度。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明旨在克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種提高雜交瘤細(xì)胞單克隆抗體產(chǎn)量的培養(yǎng)方法。

2、為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供的技術(shù)方案為：

3、所述提高雜交瘤細(xì)胞單克隆抗體產(chǎn)量的培養(yǎng)方法包括如下步驟：

4、(1)將凍存的雜交瘤細(xì)胞接種至初始培養(yǎng)基中活化(15ml試管中裝10ml培養(yǎng)基)，然后于37℃、轉(zhuǎn)速30rpm、5％co2環(huán)境下培養(yǎng)(25ml通風(fēng)蓋小燒瓶)，待培養(yǎng)基變黃時進(jìn)行傳代培養(yǎng)；所述初始培養(yǎng)基是至少添加有碳源、維生素、細(xì)胞生長因子、抗生素的完全培養(yǎng)基，所述碳源在完全培養(yǎng)基中的濃度為2mm-6mm，維生素、細(xì)胞生長因子、抗生素在完全培養(yǎng)基中的體積百分比濃度均為0.5％-1.5％；所述完全培養(yǎng)基中還添加有血清，所述血清在完全培養(yǎng)基中的體積百分比濃度為20％；在傳代培養(yǎng)時，逐級降低培養(yǎng)基中的血清含量至0％，傳代培養(yǎng)得到無血清培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞；

5、(2)預(yù)裝無血清培養(yǎng)基至發(fā)酵罐中，然后接種步驟(1)所得的無血清培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞至發(fā)酵罐，于轉(zhuǎn)速90rpm、37℃、ph值6.9-7.4、80％-90％po2環(huán)境下進(jìn)行初始階段的培養(yǎng)1-2d，至細(xì)胞豐度為1x?105/ml-2x?105/ml；所述無血清培養(yǎng)基的組分與步驟(1)中不含血清的初始培養(yǎng)基組分相同；所述發(fā)酵罐中，接種的無血清培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞與預(yù)裝的無血清培養(yǎng)基的體積比為0.1:4；

6、(3)向發(fā)酵罐中補(bǔ)料無血清培養(yǎng)基，于轉(zhuǎn)速120rpm、37℃、ph值6.9-7.4、60％-80％po2環(huán)境下進(jìn)行生長階段的培養(yǎng)1-2d，至細(xì)胞豐度為5x?105/ml-7x?105/ml，然后于轉(zhuǎn)速120rpm、37℃、ph值6.9-7.4、40％-60％?po2環(huán)境下進(jìn)行指數(shù)階段的培養(yǎng)24h-36h，至細(xì)胞豐度為2x?106/ml-5x?106/ml，再進(jìn)入20％-40％?po2環(huán)境下穩(wěn)定培養(yǎng)階段，穩(wěn)定培養(yǎng)末期細(xì)胞豐度為1.6x?107/ml；所述補(bǔ)充的無血清培養(yǎng)基與預(yù)裝的無血清培養(yǎng)基的體積比為3:2；

7、(4)檢測發(fā)酵罐中細(xì)胞死亡率達(dá)50％-60％時，收集細(xì)胞懸液進(jìn)行抗體純化，即得純化后的雜交瘤細(xì)胞單克隆抗體。

8、優(yōu)選地，步驟(1)中所述完全培養(yǎng)基為hybridoma?sfm、cd?hybridoma?medium、medium?nctc-109、pfhm-iiprotein-free?hybridoma?medium培養(yǎng)基中的任意一種，所述血清是無igg血清，所述碳源為glutamax、l-谷氨酰胺、葡萄糖中的任意一種，所述維生素為mem，所述細(xì)胞生長因子為b-27，所述抗生素為青霉素-鏈霉素。

9、更優(yōu)選地，所述無igg血清為胎牛血清。

10、優(yōu)選地，所述方法步驟(4)之后還包括如下步驟：收集細(xì)胞懸液后再向發(fā)酵罐中補(bǔ)入無血清培養(yǎng)基，然后重復(fù)步驟(3)和(4)，實(shí)現(xiàn)無需再次接種雜交瘤細(xì)胞的分批培養(yǎng)。

11、下面對本發(fā)明作進(jìn)一步地說明：

12、本發(fā)明通過在傳代過程中逐級降低培養(yǎng)基中血清的水平至無血清培養(yǎng)基，達(dá)到雜交瘤細(xì)胞在無血清培養(yǎng)基中的耐受能力和提高存活率，進(jìn)一步在分批發(fā)酵培養(yǎng)過程中，通過分批補(bǔ)料的方式進(jìn)行培養(yǎng)基的補(bǔ)充，來提高細(xì)胞豐度；通過在不同培養(yǎng)階段調(diào)節(jié)生物反應(yīng)器po2，攪拌轉(zhuǎn)速等參數(shù)，改善了細(xì)胞狀態(tài)以及活力，提高了單克隆抗體的產(chǎn)量和實(shí)現(xiàn)分批培養(yǎng)。

13、1、本發(fā)明通過間斷補(bǔ)料的方式使活化細(xì)胞充分適應(yīng)培養(yǎng)基獲得更高細(xì)胞豐度

14、先活化凍存雜交瘤細(xì)胞，然后轉(zhuǎn)移到通風(fēng)蓋小燒瓶中，保持搖床速度30rpm，在37℃的培養(yǎng)箱中，5％的二氧化碳環(huán)境中培養(yǎng)。當(dāng)培養(yǎng)基變黃時，進(jìn)行傳代，逐級降低培養(yǎng)基中血清含量，將血清降至5％，2％最后降至0。實(shí)現(xiàn)了雜交瘤細(xì)胞在培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞馴化，避免了外源抗體和雜蛋白的干擾，培養(yǎng)方法簡單高效，細(xì)胞存活率高。為發(fā)酵接種提供了高質(zhì)量的雜交瘤細(xì)胞，接種前雜交瘤細(xì)胞的細(xì)胞豐度達(dá)到2x?105/ml。

15、然后預(yù)裝4l新鮮無血清培養(yǎng)基至infors生物發(fā)酵罐中。接種100ml無血清培養(yǎng)基雜交瘤細(xì)胞至發(fā)酵罐，保持?jǐn)嚢杷俣?0rpm，溫度37℃，ph值控制范圍6.9-7.4，控制po2濃度為80％-90％，培養(yǎng)1-2天至發(fā)酵罐內(nèi)細(xì)胞豐度達(dá)到1x?105/ml-2x?105/ml，再次補(bǔ)料6l新鮮無血清培養(yǎng)基至infors生物發(fā)酵罐中，保持?jǐn)嚢杷俣?20rpm，溫度37℃，ph值控制范圍6.9-7.4，以此實(shí)現(xiàn)間斷補(bǔ)料的培養(yǎng)方式，使細(xì)胞充分適應(yīng)培養(yǎng)基和平緩度過發(fā)酵過程的細(xì)胞初始階段。

16、通過本發(fā)明中所述的間斷補(bǔ)料方式，通過在細(xì)胞初始階段和生長階段補(bǔ)料新鮮培養(yǎng)基，可以有效提升整體發(fā)酵罐內(nèi)生長階段細(xì)胞豐度，細(xì)胞活力升高，同時可以延長細(xì)胞培養(yǎng)時間，在培養(yǎng)末期可以獲得多至1.6x?107/ml細(xì)胞，且存活率超過60％，為雜交瘤細(xì)胞的抗體生產(chǎn)提供了有效的細(xì)胞豐度保證。

17、2、本發(fā)明通過不同培養(yǎng)階段降低po2誘導(dǎo)雜交瘤細(xì)胞生產(chǎn)抗體

18、一個正常的培養(yǎng)有四個階段:初始階段，生長階段，指數(shù)階段，穩(wěn)定階段。雜交瘤細(xì)胞發(fā)酵的初始階段為第一次接種后1-2d，細(xì)胞數(shù)約為1x?105/ml-2x?105/ml，需氧量不高，保持po2濃度控制在80％-90％；生長階段約1-2d，細(xì)胞數(shù)在5x105/ml-7x105/ml左右，耗氧量開始增加，需氧量為0.05l/min～0.08l/min，將po2濃度控制在60-80％；指數(shù)生長階段，細(xì)胞密度在24h-36h內(nèi)急劇增加，達(dá)到約2x?106/ml-5x?106/ml，需要大量的o2，po2濃度控制在40％-60％；穩(wěn)定階段，細(xì)胞可增長至細(xì)胞數(shù)量保持不變，耗氧量下降到初始階段的水平，上清抗體水平在此階顯著增加，po2濃度需要保持在20％-40％以獲得最佳培養(yǎng)氧分壓。

19、雜交瘤細(xì)胞生產(chǎn)抗體需要在缺氧環(huán)境下進(jìn)行，在培養(yǎng)過程中，并逐級降低po2的水平，不影響雜交瘤細(xì)胞的細(xì)胞增殖，也使在平穩(wěn)期的高峰度細(xì)胞處于低氧脅迫，從而大量分泌目的抗體，可以將發(fā)酵培養(yǎng)的上清液抗體生產(chǎn)水平提升至約200-300mg/l，所述培養(yǎng)方法簡單有效，保持了高細(xì)胞活力也提高抗體生產(chǎn)效率。

20、3、在特定化培養(yǎng)階段收獲細(xì)胞補(bǔ)料新鮮培養(yǎng)基實(shí)現(xiàn)分批培養(yǎng)

21、在穩(wěn)定生長階段，細(xì)胞大量分泌抗體，但由于營養(yǎng)物質(zhì)的不足，細(xì)胞死亡率開始增加。在此階段，檢測細(xì)胞死亡率在50％-60％，直接收獲細(xì)胞。此時infors生物發(fā)酵罐中為10l細(xì)胞培養(yǎng)懸液，從安全取樣器中收集細(xì)胞或培養(yǎng)基樣品約9l，再注入3l新鮮無血清培養(yǎng)基，重復(fù)進(jìn)行本發(fā)明中所述的間斷補(bǔ)料方式進(jìn)行培養(yǎng)，以此實(shí)現(xiàn)分批培養(yǎng)無需額留種接種。

22、本發(fā)明所述提高雜交瘤細(xì)胞單克隆抗體產(chǎn)量的培養(yǎng)方法，適合于大量生產(chǎn)抗體，通過此種方式可以連續(xù)進(jìn)行雜交瘤細(xì)胞發(fā)酵長達(dá)半年之久。保證了生產(chǎn)的連續(xù)性，也提高了抗體生產(chǎn)的效率。