本發(fā)明屬于植物基因工程，具體地說(shuō)，涉及一種在單子葉c4植物中表達(dá)外源基因的病毒載體及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、在全球范圍內(nèi)，玉米（ zea?maysl.）和高粱[ sorghum?bicolor（l.）moench]是廣泛種植的禾本科c4作物，它們不僅是重要的糧食作物，而且還是生產(chǎn)牲畜飼料和制造生物燃料的重要原材料。由于現(xiàn)階段針對(duì)玉米和高粱的遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)存在周期長(zhǎng)、成本高和效率低下等問(wèn)題，限制了對(duì)它們基因功能的大規(guī)模、快速研究；同時(shí)這一技術(shù)限制也阻礙了在玉米和高粱等c4植物中快速、高通量地表達(dá)異源的功能性蛋白，如抗性相關(guān)蛋白、小肽、抗原決定簇和抗體等的研究。因此，開(kāi)發(fā)穩(wěn)定轉(zhuǎn)基因技術(shù)的替代方法具有必要性。

2、研究表明，由病毒介導(dǎo)的過(guò)表達(dá)（virus-mediated?overexpression，vox）技術(shù)可用于在植物中高通量、瞬時(shí)和快速表達(dá)蛋白，從而促進(jìn)對(duì)植物基因功能的研究（gleba，klimyuk，&marillonnet，2007）。目前，在玉米中已報(bào)道了七種病毒可作為vox載體。這些病毒包括大麥條紋花葉病毒（barley?stripe?mosaic?virus）（cheuk&houde，2018）、大麥黃條紋花葉病病毒（barley?yellow?striate?mosaic?virus）（gao?et?al.,?2019）、狐尾草花葉病毒（foxtail?mosaic?virus,?fomv）（bouton?et?al.,?2018）、玉米矮花葉病毒（maizedwarf?mosaic?virus,?mdmv）（xie?et?al.,?2021）、玉米花葉病毒（maize?mosaic?virus）（kanakala?et?al.,?2023），小麥條紋花葉病毒（wheat?streak?mosaic?virus，wsmv）（tatineni?et?al.,?2011）和甘蔗花葉病毒（sugarcane?mosaic?virus，scmv）（mei?etal.,?2019），但這些病毒均引起嚴(yán)重的花葉癥狀，甚至引起壞死，對(duì)研究基因功能非常不利。高粱具有廣泛的適應(yīng)性和良好的抗逆性，隨著全球氣候變暖和極端氣候頻發(fā)，快速篩選和挖掘高粱中的抗逆基因，對(duì)禾本科作物的遺傳改良和分子育種具有指導(dǎo)意義。盡管高粱基因組已經(jīng)完成了測(cè)序，但是針對(duì)高粱測(cè)序品種btx623，仍舊沒(méi)有用于研究其基因功能的vox載體。

3、馬鈴薯y病毒屬病毒?(potyviruses,?分類(lèi)地位屬于 potyvirus屬， potyviridae科)?是已知的最大的一類(lèi)侵染植物的rna病毒，其自然寄主范圍廣泛，其中有一些種類(lèi)僅侵染單子葉植物，包括玉米、甘蔗和高粱等在內(nèi)的多種作物。該類(lèi)病毒的基因組為正義單鏈rna，其與病毒編碼的外殼蛋白一起組裝形成長(zhǎng)線(xiàn)狀的病毒粒體。potyviruses作為vox載體具有以下優(yōu)點(diǎn)：（1）相對(duì)于球狀的病毒粒體，彎曲、長(zhǎng)線(xiàn)狀的病毒粒體能夠通過(guò)適當(dāng)?shù)卦黾恿ｓw長(zhǎng)度，而實(shí)現(xiàn)在基因組rna中裝載較大的外源插入片段；（2）由于potyviruses僅具有一條rna基因組，因此在構(gòu)建vox載體時(shí)，只需考慮將異源基因編碼區(qū)插入到病毒rna的編碼框中即可；（3）研究表明，potyviruses的基因組中至少有六個(gè)不同位置可用于表達(dá)異源蛋白，其中p1/hc-pro和nib/cp連接處的位點(diǎn)是最常用于設(shè)計(jì)外源基因的插入位點(diǎn)，這也為通過(guò)一個(gè)載體表達(dá)多個(gè)蛋白提供了可能（mei?et?al.,?2019；xie?et?al.,?2021）。

4、鑒于potyviruses作為vox載體的這些優(yōu)勢(shì)，雖然已經(jīng)開(kāi)發(fā)了多種用于在雙子葉植物中進(jìn)行基因功能分析的病毒載體，如蕪菁花葉病毒、煙草蝕紋病毒、李痘病毒和煙草脈帶花葉病毒等（dolja?et?al.,?1992；fernández-fernández?et?al.,?2001；beauchemin?etal.,?2005；gao?et?al.,?2012；xie?et?al.,?2021），但能用于單子葉植物的potyviruses載體罕見(jiàn)報(bào)道。近期，盡管在玉米中scmv-mdmv-b分離物可改造為vox載體，但scmv-mdmv-bvox載體接種玉米幼苗需要借助于基因槍轟擊技術(shù)（mei?et?al.,?2019）。而基因槍轟擊技術(shù)需要昂貴的金顆粒，并且需要特定的精密設(shè)備，接種效率低；而且，包括scmv-mdmv-b在內(nèi)的大部分scmv分離物在玉米上會(huì)引起嚴(yán)重的花葉和植株矮化等癥狀，不利于對(duì)其介導(dǎo)的過(guò)表達(dá)基因后植物表型的觀察和測(cè)定。因此，鑒定和改造引起輕微花葉癥狀的scmv分離物，以及擺脫基因槍轟擊技術(shù)的限制將更適用于在玉米和高粱中vox載體的開(kāi)發(fā)和基因功能的研究。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的是提供一種在單子葉c4植物中表達(dá)外源基因的病毒載體及應(yīng)用。

2、為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，第一方面，本發(fā)明提供一種在單子葉c4植物中表達(dá)外源基因的病毒載體，其構(gòu)建方法包括以下步驟：

3、（1）以大范圍田間病毒病調(diào)查中偶然發(fā)現(xiàn)的侵染玉米僅引起輕花葉癥狀的甘蔗花葉病毒分離物scmv-mdu（其在ncbi中的登錄號(hào)為oq948124）的基因組rna為模板，經(jīng)rt-pcr擴(kuò)增得到其基因組rna的全長(zhǎng)cdna，然后克隆至pcb301載體中，構(gòu)建得到侵染性克隆pscmdu；

4、（2）將侵染性克隆pscmdu中第10153-10179位核苷酸對(duì)應(yīng)的nib（核內(nèi)含體蛋白b）和cp（外殼蛋白）之間的蛋白酶切割位點(diǎn)對(duì)應(yīng)的核苷酸序列進(jìn)行加倍，且在加倍的序列之間插入了帶 blni和 stui單酶切位點(diǎn)（ blni、 stui可被 apai, aflii, kpni, paci, smai, stui中任意2個(gè)酶切位點(diǎn)替代）的預(yù)期表達(dá)基因或報(bào)告基因編碼區(qū)序列，得到在單子葉c4植物中表達(dá)外源基因的病毒載體。

5、優(yōu)選地，所述報(bào)告基因?yàn)? gfp，所構(gòu)建的在單子葉c4植物中表達(dá)外源基因的病毒載體為pscmdu::gfp。

6、進(jìn)一步地，本發(fā)明病毒載體的全序列由seq?id?no:1~2依次連接而成。

7、第二方面，本發(fā)明提供含有所述病毒載體的生物材料，所述生物材料包括表達(dá)載體、工程菌或宿主細(xì)胞。

8、第三方面，本發(fā)明提供一種單子葉c4植物外源基因表達(dá)系統(tǒng)（scmv-mdu?vox系統(tǒng)），所述表達(dá)系統(tǒng)是將外源基因的編碼區(qū)插入經(jīng) blni和 stui線(xiàn)性化的所述病毒載體中，并轉(zhuǎn)化土壤桿菌得到的。

9、第四方面，本發(fā)明提供所述病毒載體或所述生物材料或所述表達(dá)系統(tǒng)的以下任一應(yīng)用：

10、1）用于基因表達(dá)；

11、2）用于研究基因、蛋白、多肽功能；

12、3）用于構(gòu)建轉(zhuǎn)基因植物。

13、進(jìn)一步地，所述植物為單子葉植物。

14、優(yōu)選單子葉c4植物，如玉米、高粱。

15、借由上述技術(shù)方案，本發(fā)明至少具有下列優(yōu)點(diǎn)及有益效果：

16、本發(fā)明構(gòu)建的scmv-mdu?vox系統(tǒng)適用于在單子葉c4植物（如玉米和高粱）中高效表達(dá)蛋白，且scmv-mdu侵染玉米和高粱引起的癥狀輕微，對(duì)研究過(guò)表達(dá)蛋白后的植物表型干擾小。scmv-mdu?vox系統(tǒng)在使用時(shí)僅需要將待研究基因的編碼區(qū)插入載體即可用于基因的高效表達(dá)，本發(fā)明方法簡(jiǎn)便、快速、高效、低成本、無(wú)需遺傳轉(zhuǎn)化，在植物種質(zhì)資源的改良及遺傳育種領(lǐng)域，具有良好的市場(chǎng)應(yīng)用前景。