本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，更具體的說是涉及一種游離alu115和alu247完全抗原、單克隆抗體及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

0、技術(shù)背景

1、游離核酸dna(cfdna)由血液中的核dna片段組成，起源于體內(nèi)的各種細(xì)胞。從凋亡細(xì)胞釋放的dna片段通常長度為185至200個(gè)堿基對(bp)。相反，來自壞死細(xì)胞或者腫瘤細(xì)胞的cfdna片段更長，表明dna的無序分解更多。因此，高水平的長dna片段可以作為疾病潛在的標(biāo)志。來自壞死的長dna片段(alu247)與代表總cfdna的短凋亡片段(alu115)的比值代表cfdna完整性的水平。因此，該比率越高，越有利于疾病發(fā)生和發(fā)展，成為可用于臨床應(yīng)用(非侵入性評估的新興領(lǐng)域)的合適候選生物標(biāo)志物，如產(chǎn)前診斷、癌癥、糖尿病、心血管和神經(jīng)系統(tǒng)疾病。

2、cfdna序列內(nèi)含有大量的alu序列，alu序列是高度豐富的靈長類動物特異性短散布核元件，約占人類基因組的10％。由于它們優(yōu)先位于基因豐富的區(qū)域，特別是在內(nèi)含子和3'utr中，alu元件可以對宿主基因和鄰近基因的表達(dá)發(fā)揮調(diào)節(jié)作用，其中aul115和alu247有利于成為疾病發(fā)生發(fā)展有效的標(biāo)志基因。alu序列不直接編碼蛋白質(zhì)，但在基因表達(dá)調(diào)控、細(xì)胞增殖、分化、凋亡等生命過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。近年來，隨著高通量測序技術(shù)的飛速發(fā)展，越來越多的alu序列被發(fā)現(xiàn)并證實(shí)與多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。因此，開發(fā)針對alu序列的高效研究工具顯得尤為重要，其中非編碼alu序列特異性抗體是不可或缺的一部分。

3、目前檢測aul115和alu247的基因序列一般通過傳統(tǒng)紫外分光光度計(jì)、凝膠電泳方法檢測，這種方法靈敏度低，操作繁瑣。此外熒光pcr反應(yīng)進(jìn)行檢測是目前常用于疾病檢測的手段，其方法靈敏度高，但是測試成本也較高。免疫學(xué)檢測法作為一種快速、特異和靈敏的檢測技術(shù)，被廣泛應(yīng)用于小分子含量的檢測。由于alu序列屬于半抗原物質(zhì)，不能刺激機(jī)體產(chǎn)生相應(yīng)抗體，只有與大分子蛋白偶聯(lián)制備alu完全抗原后才能刺激動物產(chǎn)生免疫反應(yīng)，才具有免疫原性。因此，合成具有強(qiáng)免疫原性的alu是獲得抗alu單克隆抗體的關(guān)鍵。

4、目前常用的蛋白偶聯(lián)技術(shù)有生物素/鏈霉親和素、dcc/nhs(二環(huán)己基碳二亞胺/n-羥基琥珀酰亞胺)和edc/nhs(1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽/n-羥基琥珀酰亞胺)法，以下是這幾種方法的優(yōu)缺點(diǎn)比較：

5、dcc方法：dcc是一種強(qiáng)效的羧基活化劑，能夠高效地促進(jìn)酰胺鍵的形成。dcc在有機(jī)溶劑中溶解度較好，適用于在有機(jī)相中的反應(yīng)。dcc反應(yīng)后生成的dcu(二環(huán)己基脲)雖然在一些溶劑中析出，但溶解度較高，難以完全去除，可能影響后續(xù)步驟。dcc不溶于水，限制了其在水性環(huán)境中的應(yīng)用。

6、生物素/鏈霉親和素(biotin/streptavidin)化學(xué)結(jié)合系統(tǒng)在生物化學(xué)和分子生物學(xué)中具有廣泛的應(yīng)用，生物素和鏈霉親和素之間的結(jié)合具有極高的特異性，解離常數(shù)非常低(約為10^-14摩爾/升)，這種緊密而特異性的結(jié)合是快速的，并且能夠承受ph、溫度、有機(jī)溶劑和變性劑的極端作用。但其成本較高，樣本中高濃度的生物素可能會對基于生物素/鏈霉親和素系統(tǒng)的檢測方法產(chǎn)生干擾和干擾免疫應(yīng)答的產(chǎn)生，影響檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。

7、本發(fā)明通過篩選edc/nhs方法的條件來制備蛋白偶聯(lián)物，首先edc易溶于水也溶于有機(jī)溶劑，避免了dcc水溶性差造成偶聯(lián)效率低的問題，edc反應(yīng)后產(chǎn)生的副產(chǎn)物相對容易通過水洗去除，從而得到較純的產(chǎn)物，避免了dcc水溶性差造成污染和生物素/鏈霉親和素造成的結(jié)果的干擾。nhs的存在可以穩(wěn)定edc活化羧基后生成的中間體，從而提高偶聯(lián)效率。

8、本發(fā)明通過雜交瘤技術(shù)開發(fā)出針對特定非編碼alu115和alu247的高效特異性抗體，aul115和alu247抗體成功制備有望在免疫發(fā)光、elisa(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn))以及免疫膠體金等技術(shù)中具有重要的意義。高質(zhì)量的抗體制備可以確保檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性，為疾病的診斷、預(yù)防和控制提供重要依據(jù)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的在于提供一種游離核酸alu115和alu247完全抗原、利用該完全抗原獲得alu115和alu247單克隆抗體及其應(yīng)用，為臨床產(chǎn)前診斷、癌癥、糖尿病、心血管和神經(jīng)系統(tǒng)疾病提供了準(zhǔn)確抗體。

2、實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的具體技術(shù)方案如下：

3、一方面，本發(fā)明提供了一種游離核酸alu115和alu247完全抗原，所述完全抗原為alu半抗原與蛋白質(zhì)載體偶聯(lián)后形成，所述alu半抗原為含有氨基標(biāo)記的alu115和alu247核酸片段。完全抗原的結(jié)構(gòu)如圖1所示，alu的模板序列如seq?id?no.1所示。

4、所述alu115和alu247完全抗原的制備方法，包括以下步驟：

5、(1)將含有氨基標(biāo)記的dutp的sybr?greenⅰbufferamix(成份組成包括：

6、20mm?tris-so4、100mm?kcl、0.3mm甜菜堿、20％甘油、0.2mm?dntp、sybr?greenⅰ和0.5mm?mgcl2)通過引物擴(kuò)增引入到alu115基因序列中，alu115的擴(kuò)增體系如下：

7、

8、擴(kuò)增程序如下：

9、

10、優(yōu)選地，aul115基因的特異性引物序列如seq?id?no.2～3所示。

11、將含有氨基標(biāo)記的dutp的sybr?greenⅰbufferamix，通過引物擴(kuò)增引入到alu247基因序列中，alu247的擴(kuò)增體系和擴(kuò)增程序同alu115。

12、優(yōu)選地，aul247基因的特異性引物序列如seq?id?no.4～5所示。

13、(2)通過膠回收試劑盒純化alu115和alu247核苷酸序列，，要求經(jīng)過紫外分光光度計(jì)檢測后，要求dna濃度不低于40ng/μl，od260/od280比值不低于1.80。

14、(3)采用edc/nhs法將牛血清白蛋白偶聯(lián)alu115和alu247核酸片段，稱取20mgbsa，40mg?edc，使之充分溶解于2ml?0.1m?mes?ph5.0緩沖液中，加入20mg?nhs，4℃避光攪拌反應(yīng)15min后調(diào)至ph?8得到反應(yīng)液為a液；分別將4mg純化獲得的alu115和alu247擴(kuò)增產(chǎn)物逐滴加入到a液中(邊加邊攪拌)，密封，避光，在4℃下攪拌過夜；待上述反應(yīng)完后，將反應(yīng)液轉(zhuǎn)移到透析袋中，4℃，用pbs透析2天，透析完成后保存?zhèn)溆谩?/p>

15、另一方面，本發(fā)明提供了由所述完全抗原免疫得到的單克隆抗體。

16、所述alu115和alu247單克隆抗體的制備方法，具體步驟如下：

17、(1)選擇為4-6周齡的5只balb/c小鼠免疫動物進(jìn)行免疫，將alu115-bsa和alu247-bsa作為免疫抗原，分別稱取100μg抗原與等體積弗氏完全佐劑乳化后(抗原濃度為1mg/ml)，背部皮下注射；2周后換用弗氏不完全佐劑等量乳化抗原，背部皮下注射；間隔2周后三免，100μg/只，同樣使用不完全佐劑乳化。

18、(2)在三免2周后，通過眼眶采血分離血清，用間接elisa測定小鼠免疫血清效價(jià)，并選擇具有高效價(jià)的小鼠。

19、優(yōu)選地，取未免疫/免疫的spf級balb/小鼠眼眶放血處死，血液收集。將處死的小鼠放置于75％酒精中浸泡移入超凈臺中，無菌取小鼠脾臟后出脾臟，先用rpmi?1640不完全培養(yǎng)液研磨再用細(xì)胞濾器過濾多余組織。1000rpm/min離心10min后棄上清，用rpmi1640hat培養(yǎng)基重懸細(xì)胞沉淀，每個(gè)孔100μl加入96孔板在細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

20、(3)高效價(jià)的小鼠脾細(xì)胞與sp2/0骨髓瘤細(xì)胞融合。按照比例，把sp/20加入到脾細(xì)胞中，離心4min，棄上清。把有細(xì)胞沉淀進(jìn)行懸浮，并加入1ml?peg1500融合劑，靜止90s，使融合劑起作用。向離心管中加入rpmi?1640終止融合。用hat培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，取出96孔板，每孔加200ml上述細(xì)胞液，每天觀察雜交瘤細(xì)胞的生長情況。

21、(4)融合5d后，用hat/ht培養(yǎng)基換液，換出來的培養(yǎng)基用于間接elisa實(shí)驗(yàn)，進(jìn)行陽性克隆的初篩。最少篩選兩次，將經(jīng)過兩次檢測后均為陽性的雜交瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移到24孔板內(nèi)培養(yǎng)，再轉(zhuǎn)移到t25cm細(xì)胞瓶內(nèi)擴(kuò)繁，經(jīng)檢測后凍存細(xì)胞，稱為陽性克隆細(xì)胞。

22、(5)選擇初篩陽性克隆細(xì)胞，細(xì)胞計(jì)效后吸取100個(gè)細(xì)胞到20mlht培養(yǎng)基中，混勻后，取出96孔板，每孔加100μl進(jìn)行培養(yǎng)，第8-10d對交瘤細(xì)胞的了進(jìn)行檢測，挑選陽性克隆繼續(xù)進(jìn)行亞克隆，直至最終所有孔檢測為陽性。

23、(6)將篩選到的雜交瘤細(xì)胞株轉(zhuǎn)移至細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，并用rpmi?1640/10完全培養(yǎng)基在細(xì)胞培養(yǎng)瓶內(nèi)擴(kuò)大培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞達(dá)到對數(shù)增長狀態(tài)時(shí)，向石蠟致敏的經(jīng)產(chǎn)母鼠腹腔中注射每毫升1×106個(gè)細(xì)胞，約10天后小鼠腹部腫脹，收集腹水，離心收取上清液。按照生工的protein?g?sefinosetm?resin(settled?resin)說明書進(jìn)行腹水純化。

24、本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明首次公開了一種alu115和alu247完全抗原及其免疫獲得的單克隆抗體，完全抗原的免疫效果較好，且獲得的單克隆抗體具有較強(qiáng)的特異性，為推進(jìn)臨床上alu115和alu247檢測提供了可靠的方法；本發(fā)明的單克隆抗體可高靈敏度地檢測alu115和alu247的存在。