本發(fā)明涉及基因工程，尤其涉及一種河川沙塘鱧幾丁質(zhì)酶基因及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、河川沙塘鱧(odontobutispotamophila)是我國特有的肉食性魚類，廣泛分布于長江中下游的河流和湖泊中，主要以活體動物為食，包括蝦和浮游動物。其肉質(zhì)鮮美，可食用部分多，刺少，是一種優(yōu)良的經(jīng)濟水產(chǎn)品。然而，由于缺乏合適的飼料，河川沙塘鱧的養(yǎng)殖依賴于池塘水體中的節(jié)肢動物和小魚，其餌料中含有的幾丁質(zhì)需要其自身的消化系統(tǒng)來消化和分解，這影響了蛋白質(zhì)的利用率和消化率，進而影響了其生長性能?；谄鋽z食習(xí)性，河川沙塘鱧消化系統(tǒng)中幾丁質(zhì)酶的活性高低對生長至關(guān)重要。

2、目前有較多研究都集中在外源環(huán)境微生物產(chǎn)酶基因的克隆、酶學(xué)性質(zhì)研究以及工程菌的構(gòu)建表達(dá)，而針對河川沙塘鱧魚體自身內(nèi)源合成與分泌的幾丁質(zhì)酶的克隆、異源表達(dá)及其應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖鮮有報道。因此，篩選河川沙塘鱧自身內(nèi)源幾丁質(zhì)酶類，分析其幾丁質(zhì)酶相關(guān)基因，利用分子生物學(xué)手段對相關(guān)基因進行克隆表達(dá)，在酵母細(xì)胞表面展示蛋白質(zhì)，使幾丁質(zhì)酶基因得以表達(dá)，并應(yīng)用于河川沙塘鱧養(yǎng)殖過程中，對于提高消化能力，維護腸道健康，增強免疫力，提高生長性能等具有重要的意義。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的在于提供一種河川沙塘鱧幾丁質(zhì)酶基因及其應(yīng)用。本發(fā)明的目的是提供一種河川沙塘鱧幾丁質(zhì)酶基因的表達(dá)蛋白，在提高魚類生長性能中的應(yīng)用，所述基因及其表達(dá)蛋白可以提高河川沙塘鱧對幾丁質(zhì)的消化能力，維護腸道健康，增強免疫力，提高生長性能。

2、為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案：

3、本發(fā)明提供了一種河川沙塘鱧幾丁質(zhì)酶基因，其核苷酸序列如seq?id?no.1所示。

4、本發(fā)明還提供了所述的河川沙塘鱧幾丁質(zhì)酶基因編碼的河川沙塘鱧幾丁質(zhì)酶，所述河川沙塘鱧幾丁質(zhì)酶的氨基酸序列如seq?id?no.2所示。

5、本發(fā)明還提供了一種表達(dá)載體，包括初始載體和所述的河川沙塘鱧幾丁質(zhì)酶基因。

6、優(yōu)選的，所述初始載體為ppiczαa。

7、本發(fā)明還提供了一種宿主，轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染有所述的表達(dá)載體；所述宿主為微生物。

8、優(yōu)選的，所述微生物為酵母菌。

9、本發(fā)明還提供了所述的河川沙塘鱧幾丁質(zhì)酶基因、所述的河川沙塘鱧幾丁質(zhì)酶、所述的表達(dá)載體、所述的宿主在制備提高魚類生長性能或改善腸道健康飼料中的應(yīng)用。

10、本發(fā)明還提供了所述的河川沙塘鱧幾丁質(zhì)酶基因、所述的河川沙塘鱧幾丁質(zhì)酶、所述的表達(dá)載體、所述的宿主在制備提高魚類生長性能或改善腸道健康的飼料添加劑中的應(yīng)用。

11、本發(fā)明還提供了一種制備幾丁質(zhì)酶的方法，培養(yǎng)所述的宿主，得到幾丁質(zhì)酶。

12、優(yōu)選的，在培養(yǎng)完成后，還包括純化幾丁質(zhì)酶的步驟：將含有幾丁質(zhì)酶的上清添加至含有鎳離子填料的層析柱中，用5～7ml?lysis?buffer平衡柱子，重復(fù)3～4次；50～60ml蛋白溶液分兩次過柱；加入10～15mlwashbuffer進行洗雜，重復(fù)5～7次；加入5～7mlelutionbuffer洗脫，即得。

13、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下的有益效果：

14、本發(fā)明成功構(gòu)建了帶有幾丁質(zhì)酶基因的重組質(zhì)粒ppiczαa-opcht，再將含幾丁質(zhì)酶基因的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至畢赤酵母x-33中，得到酵母重組表達(dá)載體；將酵母重組表達(dá)載體大規(guī)模搖菌純化得到幾丁質(zhì)酶表達(dá)產(chǎn)物，對河川沙塘鱧進行56天投喂，發(fā)現(xiàn)添加3種不同濃度的幾丁質(zhì)酶均可提高河川沙塘鱧的增重率和特定生長率，降低死亡率，提高生長性能；有利于提高消化酶活力，增加了腸絨毛的寬度、高度和肌層的厚度；增加抗氧化能力，增強魚體非特異性免疫?？梢葬槍π缘貞?yīng)用于河川沙塘鱧養(yǎng)殖中，綠色高效，前景可觀。

技術(shù)特征：

1.一種河川沙塘鱧幾丁質(zhì)酶基因，其特征在于，其核苷酸序列如seq?id?no.1所示。

2.如權(quán)利要求1所述的河川沙塘鱧幾丁質(zhì)酶基因編碼的河川沙塘鱧幾丁質(zhì)酶，所述河川沙塘鱧幾丁質(zhì)酶的氨基酸序列如seq?id?no.2所示。

3.一種表達(dá)載體，其特征在于，包括初始載體和如權(quán)利要求1所述的河川沙塘鱧幾丁質(zhì)酶基因。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的表達(dá)載體，其特征在于，所述初始載體為ppiczαa。

5.一種宿主，其特征在于，轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染有如權(quán)利要求3所述的表達(dá)載體；所述宿主為微生物。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的宿主，其特征在于，所述微生物為酵母菌。

7.如權(quán)利要求1所述的河川沙塘鱧幾丁質(zhì)酶基因、如權(quán)利要求2所述的河川沙塘鱧幾丁質(zhì)酶、如權(quán)利要求3或4所述的表達(dá)載體、如權(quán)利要求5或6所述的宿主在制備提高魚類生長性能或改善腸道健康飼料中的應(yīng)用。

8.如權(quán)利要求1所述的河川沙塘鱧幾丁質(zhì)酶基因、如權(quán)利要求2所述的河川沙塘鱧幾丁質(zhì)酶、如權(quán)利要求3或4所述的表達(dá)載體、如權(quán)利要求5或6所述的宿主在制備提高魚類生長性能或改善腸道健康的飼料添加劑中的應(yīng)用。

9.一種制備幾丁質(zhì)酶的方法，其特征在于，培養(yǎng)權(quán)利要求5或6所述的宿主，得到幾丁質(zhì)酶。

10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，在培養(yǎng)完成后，還包括純化幾丁質(zhì)酶的步驟：將含有幾丁質(zhì)酶的上清添加至含有鎳離子填料的層析柱中，用5～7ml?lysis?buffer平衡柱子，重復(fù)3～4次；50～60ml蛋白溶液分兩次過柱；加入10～15mlwashbuffer進行洗雜，重復(fù)5～7次；加入5～7ml?elutionbuffer洗脫，即得。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種河川沙塘鱧幾丁質(zhì)酶基因及其應(yīng)用。一種河川沙塘鱧幾丁質(zhì)酶基因，其核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示。本發(fā)明的幾丁質(zhì)酶能明顯提高河川沙塘鱧的增重率和特定生長率，降低死亡率，提高生長性能；有利于提高消化酶活力，增加了腸絨毛的寬度、高度和肌層的厚度；增加抗氧化能力，增強魚體非特異性免疫?？梢葬槍π缘貞?yīng)用于河川沙塘以及其它魚類養(yǎng)殖中。

技術(shù)研發(fā)人員：李旭光,鹿思語,劉國興,萬金娟,丁淑燕,郝忱,鄭友,鄭嘯宇,霍春林
受保護的技術(shù)使用者：江蘇省淡水水產(chǎn)研究所
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/12/30