本發(fā)明涉及細胞組織庫構(gòu)建的，具體涉及一種循環(huán)腫瘤細胞建庫過程中的培養(yǎng)方法和循環(huán)腫瘤細胞的建庫方法。

背景技術(shù)：

1、循環(huán)腫瘤細胞(circulating?tumor?cells，簡稱ctcs)是指從原發(fā)腫瘤或轉(zhuǎn)移性病灶中脫落并進入外周血液循環(huán)的腫瘤細胞。這些細胞有可能通過血液循環(huán)到達身體其他部位，并在那里形成新的腫瘤，即轉(zhuǎn)移灶。ctcs的數(shù)量極少，循環(huán)腫瘤細胞在血液中含量極少，約每10毫升血液含有1-10個循環(huán)腫瘤細胞，甚至在每107個血液細胞中僅含有1個循環(huán)腫瘤細胞。ctcs的重要性在于它們與腫瘤的進展和預(yù)后密切相關(guān)。能夠成功進入血液循環(huán)并存活下來的ctcs往往具有高度的活力和轉(zhuǎn)移潛能。由于這些特性，ctcs成為了研究腫瘤生物學(xué)和開發(fā)新型診斷工具的重點對象之一。ctcs的捕獲和分析有助于理解腫瘤的異質(zhì)性、轉(zhuǎn)移機制以及耐藥性的發(fā)展，為開發(fā)新型治療方法提供信息。由于ctcs的數(shù)量非常稀少，通常每毫升血液中只有幾個至幾十個，因此其檢測是一項技術(shù)挑戰(zhàn)，但同時也為臨床提供了寶貴的液體活檢(liquid?biopsy)手段，即無需侵入性地獲取組織樣本即可獲得有關(guān)腫瘤的信息。通過構(gòu)建文庫，進行基因表達分析或者基因組變異分析，可揭示細胞的異質(zhì)性和復(fù)雜性。

2、然而，目前循環(huán)腫瘤細胞的大批量全長建庫并測序目前還處于較為不成熟的階段，可以被捕獲并且成功建庫測序的循環(huán)腫瘤細胞比較少，同時也存在如下問題：(1)目前，研究人員一般通過微流控裝置對血液中的循環(huán)腫瘤細胞進行陰性或者陽性篩選，篩選后利用流式細胞儀等設(shè)備將細胞分選并進行后續(xù)實驗。陽性篩選一般是選用epcam陽性對循環(huán)腫瘤細胞進行分選，但是大量文獻研究表明，循環(huán)腫瘤細胞異質(zhì)性較大，部分循環(huán)腫瘤細胞并沒有epcam陽性，這導(dǎo)致在分選過程中會出現(xiàn)循環(huán)腫瘤細胞的丟失，準確率低，無法解決epcam陽性識別逃逸問題。陰性篩選則會導(dǎo)致有較多白細胞等其他細胞參與干擾，篩選難度大，后續(xù)如何高效快速的將分選出的細胞分開并進行培養(yǎng)和建庫仍然是難點。(2)目前大多數(shù)研究是在循環(huán)腫瘤細胞剛剛從血液中被分選出來后立即進行監(jiān)測和建庫實驗，此時循環(huán)腫瘤細胞在分選過程中遭受重創(chuàng)甚至導(dǎo)致其rna降解，此時測序無法反應(yīng)循環(huán)腫瘤細胞的真實狀態(tài)。然而本領(lǐng)域技術(shù)人員往往并未意識到循環(huán)腫瘤細胞測序時機對測序結(jié)果的影響，而即便意識到該問題也因分選出來的ctcs的狀態(tài)極差和難以存活而不得不在獲得ctcs后立即進行相關(guān)實驗。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、(一)要解決的技術(shù)問題

2、鑒于現(xiàn)有技術(shù)的上述缺點、不足，本發(fā)明提供一種循環(huán)腫瘤細胞建庫過程中的培養(yǎng)方法和循環(huán)腫瘤細胞的建庫方法；一方面，本發(fā)明提供了一種ctcs的培養(yǎng)方法，可在體外對循環(huán)腫瘤細胞進行培養(yǎng)，使分選出來的ctcs能夠在進行一段時間的狀態(tài)恢復(fù)甚至增殖后再進行檢測，使檢測結(jié)果更能反應(yīng)ctcs的真實狀態(tài)并獲取更多的檢測樣本；另一方面，本發(fā)明進一步優(yōu)化了ctcs的分選及擴增后的樣本純化和片段化處理等過程，節(jié)省細胞挑選成本和提高分選精準度和成功率，提高樣本純度，使樣本片段化更加均勻，提升后續(xù)測序的數(shù)據(jù)質(zhì)量。

3、(二)技術(shù)方案

4、第一方面，本發(fā)明提供一種循環(huán)腫瘤細胞建庫過程中的培養(yǎng)方法，其包括：將分選得到的循環(huán)腫瘤細胞置于缺氧培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，氧氣濃度控制在4-5％；培養(yǎng)溫度為37±0.5℃，培養(yǎng)液采用基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加神經(jīng)生長因子fgf、表皮生長因子egf、b27補充劑、l-谷氨酰胺和抗生素/抗真菌劑的雙抗組合物；基礎(chǔ)培養(yǎng)基為rpmi?1640培養(yǎng)基；培養(yǎng)時間為3-10天，培養(yǎng)期間持續(xù)觀察細胞的生長情況，一旦細胞出現(xiàn)衰老，立即將細胞挑取出來進行建庫操作。

5、根據(jù)本發(fā)明較佳實施例，抗生素/抗真菌劑的雙抗組合物為青霉素/鏈霉素或兩性霉素b。

6、根據(jù)本發(fā)明較佳實施例，所述培養(yǎng)液的制備方法為：向每500ml的rpmi?1640培養(yǎng)基中加入4-6ml的l-谷氨酰胺、9-12ml的b27補充劑、2.5-3μg的fgf，2.5-3μg的egf，10ml-12ml的雙抗組合物。

7、根據(jù)本發(fā)明較佳實施例，判斷細胞衰老的方法為：出現(xiàn)細胞核顏色加深或細胞形態(tài)發(fā)生變形，即表示細胞開始衰老。此時將細胞挑取出來，保證細胞處于生長較好狀態(tài)，有較多rna進行轉(zhuǎn)錄組建庫。

8、第二方面，本發(fā)明提供一種循環(huán)腫瘤細胞的建庫方法，其包括：從血液中分選循環(huán)腫瘤細胞，體外培養(yǎng)、單細胞挑選、建庫和測序；所述體外培養(yǎng)采用上述任一實施例中所記載的培養(yǎng)方法。經(jīng)過體外培養(yǎng)，使從血液中分選出來的循環(huán)腫瘤細胞得以狀態(tài)恢復(fù)和細胞增殖，一方面減少循環(huán)腫瘤細胞rna的降解情況，另一方面可能會使循環(huán)腫瘤細胞的數(shù)量增多，便于獲得更多細胞樣本。

9、根據(jù)本發(fā)明的較佳實施例，采用細胞淘析機從血液中分選循環(huán)腫瘤細胞。

10、根據(jù)本發(fā)明的較佳實施例，所述單細胞挑選是對經(jīng)過體外培養(yǎng)的循環(huán)腫瘤細胞，采用玻璃針管進行手動挑??；具體操作為：以酒精消毒過的毛細管為原材料，加熱變軟后拉制得到管中心為0.2mm±0.05mm的玻璃針管；提前將液氮到入保溫杯，在10×鏡下從培養(yǎng)液中挑選直徑約20μm±2μm的細胞，將玻璃針管插入口吸管的接頭處，利用口吸管提供負壓，吸取細胞及1-2μl培養(yǎng)液，將細胞轉(zhuǎn)移到玻璃針管內(nèi)后將細胞吹到含有3μl裂解液的離心管中，離心管放入裝液氮的保溫杯，保存于-80℃冰箱。

11、根據(jù)本發(fā)明的較佳實施例，所述建庫和測序的過程包括如下步驟：

12、(1)裂解和反轉(zhuǎn)錄：將盛裝細胞和裂解液的離心管置于加熱條件下裂解，得到細胞裂解液，配制反轉(zhuǎn)錄液，將反轉(zhuǎn)錄液與細胞裂解液混合，在熱循環(huán)儀中孵化；

13、裂解液中加入寡核苷酸smartseq3_oli?godt30vn的序列為/5biosg/acgagcatcagcagcatacgatttttttttttttttttttttt?t?tttttttvn；反轉(zhuǎn)錄液中加入寡核苷酸smartseq3_n?8_tso的序列為/5biosg/agagacagattgcgcaat?gnnnnnnnnrgrgrg；

14、(2)預(yù)擴增：

15、配制預(yù)擴增體系，將預(yù)擴增體系加到步驟(1)處理的離心管中，混勻后將離心管放入熱循環(huán)儀中進行預(yù)擴增；正向擴增引物fwd為tcgtcggcagcgtcagatgtgtataagagacagattgcgcaa*t*g；反向擴增引物rev為acgagcatcagcagcatac*g*a；

16、(3)純化：預(yù)擴增結(jié)束后，向預(yù)擴增樣本的離心管中加入超純水稀釋,再加入dna純化磁珠，dna純化磁珠的加入體積與加入前離心管內(nèi)液體的體積比為35:50，用超純水洗脫cdna；

17、(4)cdna質(zhì)量檢查：利用qubit?dsdna?hs檢測試劑盒檢測cdna文庫質(zhì)量，使用標準卡夾測量dna片段大小，保留片段大小900-1100kb的片段；

18、(5)cdna片段化：按照每1ng的cdna加入1μl?amplicon?tagmentation?mix(tn5)的比例得到片段化混合液，放置到恒溫金屬浴中55℃處理5min；然后室溫下加入0.2％的sds，放置恒溫金屬浴中55℃處理5min；

19、(6)純化：向步驟(5)的混合液中，按樣本總體積62.5：50的體積比例加入dna純化磁珠進行純化處理，隨后用超純水洗脫dna；

20、(7)樣本擴增：使用步驟(6)獲得的dna與nextera?index引物配制樣本擴增體系，在熱循環(huán)儀中孵育樣本；

21、(8)純化：按0.8：1的體積比例加入dna純化磁珠，最后用超純水洗脫樣本，利用qubit?dsdna?hs檢測試劑盒檢測cdna文庫質(zhì)量，用標準卡夾(c105101)測量cdna片段大小，保留分布300-500kb的片段；

22、(9)在illumina兼容的測序儀上測序并整理數(shù)據(jù)。

23、(三)有益效果

24、(1)本發(fā)明設(shè)計了適合循環(huán)腫瘤細胞生長的培養(yǎng)條件和培養(yǎng)液，使分選出來的循環(huán)腫瘤細胞先短暫培養(yǎng)一段時間，使循環(huán)腫瘤細胞的狀態(tài)得到恢復(fù)，減少rna的降解程度，恢復(fù)細胞活力，之后再進行裂解、反轉(zhuǎn)錄、擴增和測序等處理，有利于獲得更準確的循環(huán)腫瘤細胞檢測數(shù)據(jù)；對于一些惡性程度較高的循環(huán)腫瘤細胞，經(jīng)過培養(yǎng)后還能使細胞數(shù)量增加，增加可用的樣本數(shù)量。

25、(2)本發(fā)明采用細胞淘析機分選和培養(yǎng)后采用玻璃針管進行手動挑取，對循環(huán)腫瘤細胞的甄別主要依賴于人力手動挑取獲得，相比現(xiàn)有技術(shù)采用epcam陽性分選的技術(shù)，不僅成本低且準確率高、不易出現(xiàn)循環(huán)腫瘤細胞的丟失等問題，也不會出現(xiàn)陰性篩選導(dǎo)致的有大量白細胞等干擾的問題。由于循環(huán)腫瘤細胞的數(shù)量極少，國際標準上循環(huán)腫瘤細胞也是10ml有7個左右，因此手動挑取并不會增加過多勞動成本，相較于現(xiàn)有技術(shù)可顯著降低成本并提高循環(huán)腫瘤細胞獲取的成功率。

26、(3)相較于現(xiàn)有的smartseq3實驗方案，本發(fā)明進一步優(yōu)化了樣本純化的操作和條件，優(yōu)化dna片段化的混合液體系，提高最終獲得的dna純度，使dna片段更均勻，提升了后續(xù)測序的效率和數(shù)據(jù)質(zhì)量。