本發(fā)明屬于生物質(zhì)能源領(lǐng)域，具體涉及一種組合抑制劑協(xié)同等離子體誘變篩選產(chǎn)油微藻的方法。

背景技術(shù)：

1、生物質(zhì)能源相較傳統(tǒng)化石能源在環(huán)保性和經(jīng)濟(jì)性上有得天獨厚的優(yōu)勢，以微藻為原料制備的生物柴油在燃燒性能上與化石燃油具有相似的物理化學(xué)性質(zhì)（碳鏈長度、能量密度等），但燃燒效率和減少sox、nox等有毒氣體排放方面均優(yōu)于化石燃油，更趨于可持續(xù)發(fā)展理念。目前利用微藻制備生物柴油仍面臨許多限制和挑戰(zhàn)，最大的困難是原料藻種油脂產(chǎn)率相對較低導(dǎo)致下游加工成本（如提純、轉(zhuǎn)化等）居高不下。

2、通過育種能有效提高微藻油脂產(chǎn)率，降低后續(xù)加工的經(jīng)濟(jì)成本。等離子體誘變育種在操作上較為簡單的同時還具有杰出的誘變效率，是一種應(yīng)用前景廣闊的育種技術(shù)。另一方面，誘變具有隨機(jī)性，以往特征微藻誘變的篩選包括直接指標(biāo)（如油脂含量、比生長率等）、直接指標(biāo)組合對比或表型功能性篩選，存在測試量大、篩選周期長、效率低下的問題。近年來也出現(xiàn)利用自動化設(shè)備高通量篩選的方法，盡管此類方法篩選速度快、效率高，但其昂貴的設(shè)備成本是廣泛應(yīng)用的最大阻礙。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的在于提供一種組合抑制劑協(xié)同等離子體誘變篩選產(chǎn)油微藻的方法，解決了現(xiàn)有的高產(chǎn)油微藻的篩選方法存在效率低或成本高的缺陷。

2、為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：

3、本發(fā)明提供的一種組合抑制劑協(xié)同等離子體誘變篩選產(chǎn)油微藻的方法，?包括以下步驟：

4、步驟1，將待誘變藻液培養(yǎng)至對數(shù)期，得到藻液培養(yǎng)液，將得到的藻液培養(yǎng)液依次進(jìn)行離心、重懸處理，得到藻液；

5、步驟2，利用等離子體將藻液進(jìn)行誘變，得到誘變藻落；

6、步驟3，將得到的誘變藻落進(jìn)行稀釋，得到稀釋后的藻液；

7、步驟4，將得到的稀釋后的藻液均勻涂布于含有抑制劑的固體培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，得到突變藻株；

8、步驟5，從得到的突變藻株中篩選得到高產(chǎn)油突變藻株；

9、其中，含有抑制劑的固體培養(yǎng)基制備方法是：

10、將碘乙酸、精喹禾靈和芝麻酚添加至液體培養(yǎng)基中，形成含有抑制劑的固體培養(yǎng)基。

11、優(yōu)選地，步驟1中，藻液的濃度為（1～2）×106個/ml。

12、優(yōu)選地，步驟2中，利用等離子體將藻液進(jìn)行誘變，得到誘變藻落，具體方法是：

13、將藻液放入等離子體反應(yīng)釜中，以設(shè)定的輸入電壓、電流和空氣流量對藻液進(jìn)行不同時間的誘變，得到不同時間對應(yīng)的初始誘變藻液；

14、計算不同時間對應(yīng)的初始誘變藻液的致死率；

15、從致死率大于設(shè)定閾值的初始誘變藻液中獲取得到誘變藻落。

16、優(yōu)選地，步驟3中，將得到的誘變藻液進(jìn)行稀釋，得到稀釋后的藻液，具體方法是：

17、將得到的誘變藻落放置滅菌后的甘油保護(hù)液中進(jìn)行暗適應(yīng)，得到稀釋后的藻液，其中，稀釋后的藻液濃度為（0.5～1）×104個/ml。

18、優(yōu)選地，所述甘油保護(hù)液由甘油和bg-11液體培養(yǎng)基組成，其中，甘油保護(hù)液中的甘油體積分?jǐn)?shù)為10%。

19、優(yōu)選地，碘乙酸、精喹禾靈和芝麻酚添加至液體培養(yǎng)基后分別濃度為0.001?mm/l、0.2mm/l和0.12?mm/l。

20、優(yōu)選地，步驟5，從得到的突變藻株中篩選得到高產(chǎn)油突變藻株，具體方法是：

21、將得到的突變藻株接種于bg-11液體培養(yǎng)基中并置于恒溫光照培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行分批培養(yǎng)，在對突變藻株進(jìn)行培養(yǎng)過程中，利用三指標(biāo)篩選原則篩選得到高產(chǎn)油突變藻株。

22、優(yōu)選地，三指標(biāo)篩選原則具體是：

23、以比生長速率大于正常株的10%，且以相對熒光值大于正常株20%為第一篩選原則；

24、以比生長速率和相對熒光值的乘積值大于對照株的35%為第二篩選原則。

25、一種產(chǎn)油微藻，基于所述方法篩選得到。

26、一種用于篩選產(chǎn)油微藻的組合抑制劑，包括碘乙酸、精喹禾靈和芝麻酚，其中，碘乙酸、精喹禾靈和芝麻酚添加至液體培養(yǎng)基后濃度分別為0.001?mm/l?、0.2mm/l和0.12mm/l。

27、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是：

28、本發(fā)明提供的一種組合抑制劑協(xié)同等離子體誘變篩選產(chǎn)油微藻的方法，通過dbd等離子體對藻液進(jìn)行誘變，并利用添加組合抑制劑的固體培養(yǎng)基進(jìn)行初篩和三指標(biāo)篩選原則復(fù)篩的方法，在提高篩選效率、減少測試工作量的前提下能保證篩選的準(zhǔn)確性，對篩選設(shè)備的要求較低，使該發(fā)明的適用性廣泛，任何實驗室均可完成。

29、進(jìn)一步的，碘乙酸、精喹禾靈和芝麻酚三種酶抑制劑組合添加至bg-11培養(yǎng)基作為初篩能過濾掉一部分特征油脂積累潛力弱的藻株（能在抑制劑固體平板上長出的藻落，說明誘變提高了相應(yīng)酶活性，突破了抑制，具有強(qiáng)大的特征油脂積累潛力）。

30、進(jìn)一步的，本發(fā)明利用dbd等離子體先通過致死率獲得最佳誘變時間，同時根據(jù)抑制劑液體培養(yǎng)和固體培養(yǎng)效果確定組合添加至固體篩選培養(yǎng)基的濃度，建立組合抑制劑固體培養(yǎng)基初篩平臺。在此基礎(chǔ)上對最佳誘變時間下的突變藻株進(jìn)行抑制劑初篩和綜合指標(biāo)精確篩選，獲得了最終高產(chǎn)油突變藻株。相比較目前已有的篩選方法，該篩選辦法可以減少指標(biāo)測試帶來的工作量，節(jié)省篩選時間，可以更有效地篩選出目標(biāo)藻株。

技術(shù)特征：

1.一種用于篩選產(chǎn)油微藻的組合抑制劑，其特征在于，包括碘乙酸、精喹禾靈和芝麻酚，其中，碘乙酸、精喹禾靈和芝麻酚添加至液體培養(yǎng)基后濃度分別為0.001?mm/l?、0.2mm/l和0.12?mm/l。

2.一種組合抑制劑協(xié)同等離子體誘變篩選產(chǎn)油微藻的方法，其特征在于，包括以下步驟：

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種組合抑制劑協(xié)同等離子體誘變篩選產(chǎn)油微藻的方法，其特征在于，步驟1中，藻液的濃度為（1～2）×106個/ml。

4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種組合抑制劑協(xié)同等離子體誘變篩選產(chǎn)油微藻的方法，其特征在于，步驟2中，利用等離子體將藻液進(jìn)行誘變，得到誘變藻落，具體方法是：

5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種組合抑制劑協(xié)同等離子體誘變篩選產(chǎn)油微藻的方法，其特征在于，步驟3中，將得到的誘變藻液進(jìn)行稀釋，得到稀釋后的藻液，具體方法是：

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種組合抑制劑協(xié)同等離子體誘變篩選產(chǎn)油微藻的方法，其特征在于，所述甘油保護(hù)液由甘油和bg-11液體培養(yǎng)基組成，其中，甘油保護(hù)液中的甘油體積分?jǐn)?shù)為10%。

7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種組合抑制劑協(xié)同等離子體誘變篩選產(chǎn)油微藻的方法，其特征在于，碘乙酸、精喹禾靈和芝麻酚添加至液體培養(yǎng)基后分別濃度為0.001?mm/l、0.2mm/l和0.12?mm/l。

8.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種組合抑制劑協(xié)同等離子體誘變篩選產(chǎn)油微藻的方法，其特征在于，步驟5，從得到的突變藻株中篩選得到高產(chǎn)油突變藻株，具體方法是：

9.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種組合抑制劑協(xié)同等離子體誘變篩選產(chǎn)油微藻的方法，其特征在于，三指標(biāo)篩選原則具體是：

10.一種產(chǎn)油微藻，其特征在于，基于權(quán)利要求2所述方法篩選得到。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明提供的一種組合抑制劑協(xié)同等離子體誘變篩選產(chǎn)油微藻的方法，包括以下步驟：步驟1，將待誘變藻液培養(yǎng)至對數(shù)期，得到藻液培養(yǎng)液，將得到的藻液培養(yǎng)液依次進(jìn)行離心、重懸處理，得到藻液；步驟2，利用等離子體將藻液進(jìn)行誘變，得到誘變藻落；步驟3，將得到的誘變藻落進(jìn)行稀釋，得到稀釋后的藻液；步驟4，將得到的稀釋后的藻液均勻涂布于含有抑制劑的固體培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，得到突變藻株；步驟5，從得到的突變藻株中篩選得到高產(chǎn)油突變藻株；本發(fā)明相比較目前已有的篩選方法，該篩選辦法可以減少指標(biāo)測試帶來的工作量，節(jié)省篩選時間，可以更有效地篩選出目標(biāo)藻株。

技術(shù)研發(fā)人員：李鵬飛,鄒濤圳,張卓婷,何緒豪,李瑞丹
受保護(hù)的技術(shù)使用者：江西理工大學(xué)
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/12/30