本發(fā)明屬于微生物工程領(lǐng)域，具體地涉及一種生產(chǎn)3-脫氫莽草酸大腸桿菌重組菌株、構(gòu)建方法及應(yīng)用

背景技術(shù)：

1、3-脫氫莽草酸(3-dehydroshikimate,dhs)是微生物體內(nèi)芳香族氨基酸生物合成代謝途徑中的一種重要中間產(chǎn)物，對(duì)維系細(xì)胞正常生長(zhǎng)、完成代謝過(guò)程具有重要作用。其進(jìn)一步加工可以合成原兒茶酸(protocatechuate)、香草醛(vanillin)、兒茶酚(catechol)、沒(méi)食子酸(gallate)等一系列重要化工產(chǎn)品。利用dhs合成這些化工產(chǎn)品可以避免有毒的苯和甲苯等原料的使用，減少對(duì)人體和環(huán)境的影響。此外，dhs還是一種十分有效的抗氧化劑，其活性?xún)?yōu)于沒(méi)食子酸、丙基沒(méi)食子酸(propyl?gallate)、bhq(tertbutylhydroquinone)、丁羥甲苯(butylatedhydroxytoluene，bht)和生育酚(α-tocopherol)等一些商品化的抗氧化劑，具有重要的應(yīng)用價(jià)值。另外，dhs作為一種小分子手性化合物，還可以作為藥物合成中非常有潛力的合成中間體。因此，研究dhs的生產(chǎn)具有重要的應(yīng)用前景。

2、3-脫氫莽草酸生物合成所需的前體物質(zhì)磷酸烯醇式丙酮酸(pep)和4-磷酸赤蘚糖(e4p)，分別是中心代謝途徑中糖酵解途徑(tca)和磷酸戊糖途徑(hmp)的中間代謝產(chǎn)物。大腸桿菌胞外的葡萄糖在經(jīng)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)磷酸化的同時(shí)被轉(zhuǎn)運(yùn)到胞內(nèi)，此過(guò)程需要pep的參與。

3、芳香族氨基酸公共途徑又稱(chēng)莽草酸途徑，此途徑起于兩大前體物質(zhì)pep和e4p的縮合，縮合產(chǎn)物為3-脫氧-d-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸(n-palmalkyl-1-3-propanediamine，dahp)，dahp的生成是三大芳香族氨基酸公共途徑的第一步，也是3-脫氫莽草酸生物合成途徑中的第一個(gè)限速反應(yīng)。dahp合酶作為芳香族氨基酸生物合成共同途徑中的第一個(gè)酶，其活性決定了直接進(jìn)入dhs合成的細(xì)胞碳量。歷史上，芳香族氨基酸對(duì)dahp合酶的轉(zhuǎn)錄抑制和反饋抑制一直被認(rèn)為是控制該酶體內(nèi)催化活性的調(diào)控機(jī)制。3-脫氧-d-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸合成酶arog影響dahp的合成，其突變體arogfbr(杜麗紅.(2024).大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)l-酪氨酸研究進(jìn)展.發(fā)酵科技通訊.doi:10.16774/j.cnki.issn.1674-2214.2024.02.010)增強(qiáng)了對(duì)代謝終產(chǎn)物芳香族氨基酸的抗反饋抑制抗性，可以促進(jìn)dahp的合成，從而影響dhs的生成。dahp合酶過(guò)表達(dá)的誘導(dǎo)是通過(guò)在發(fā)酵過(guò)程中增加添加異丙基-β-d-硫代半乳糖苷來(lái)完成的。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題在于提供一種生產(chǎn)3-脫氫莽草酸大腸桿菌重組菌株及應(yīng)用。徐慶陽(yáng)等(酪氨酸生產(chǎn)菌株的定向改造方法及生產(chǎn)菌株與酪氨酸發(fā)酵方法，申請(qǐng)?zhí)?02310280671.7)公開(kāi)了一種改造后的生產(chǎn)酪氨酸的大腸桿菌重組菌株tp06，本發(fā)明是在大腸桿菌重組菌株tp06的基礎(chǔ)上進(jìn)一步改進(jìn)。得到一種生產(chǎn)3-脫氫莽草酸大腸桿菌重組菌。

2、本發(fā)明是通過(guò)如下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的：

3、一種生產(chǎn)3-脫氫莽草酸大腸桿菌重組菌株，以大腸桿菌重組菌株tp06為出發(fā)菌株，敲除其上的丙酮酸脫氫酶基因(poxb基因)、負(fù)調(diào)控轉(zhuǎn)錄抑制因子tyrr和莽草酸脫氫酶aroe基因；過(guò)表達(dá)抗反饋抑制的dahp合成酶基因arogfbr，過(guò)表達(dá)磷酸烯醇式丙酮酸合酶ppsa、轉(zhuǎn)酮醇酶tkta和轉(zhuǎn)醛縮酶tala。

4、基因arogfbr為3-脫氧-d-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸合成酶基因arog中第436位的堿基g突變?yōu)閍形成突變基因arogfbr，在其上游插入ptrc啟動(dòng)子。

5、本發(fā)明還提供所述重組菌株的制備方法，所述方法如下：

6、步驟1、以e.coli?tp06菌株為出發(fā)菌株，制備e.coli?tp06感受態(tài)，加入pkd46質(zhì)粒，制備e.coli?tp06-pkd46菌株；

7、步驟2、獲得3-脫氧-d-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸合成酶基因，簡(jiǎn)稱(chēng)為arog基因，并將arog基因中第436位的堿基g突變?yōu)閍形成突變基因arogfbr后待用，使用含酶切位點(diǎn)ecori/bamhi引物進(jìn)行擴(kuò)增，pcr純化后的產(chǎn)物與同樣使用ecori/bamhi雙酶切過(guò)的ptrc99a質(zhì)粒進(jìn)行融合，轉(zhuǎn)化到e.coli?dh5a感受態(tài)后，提質(zhì)粒dna，將ptrc::arogfbr片段擴(kuò)增下來(lái)進(jìn)行純化，然后進(jìn)行下一步的操作。

8、將片段ptrc::arogfbr轉(zhuǎn)化到e.coli?tp06-pkd46感受態(tài)，獲得大腸桿菌工程菌株tp06-dhs01；

9、步驟3、以上述獲得工程菌株tp06-dhs01為出發(fā)菌株，敲除負(fù)調(diào)控轉(zhuǎn)錄抑制因子tyrr，獲得大腸桿菌工程菌株tp06-dhs02；

10、步驟4、以上述獲得工程菌株tp06-dhs02為出發(fā)菌株，敲除莽草酸脫氫酶基因aroe，獲得大腸桿菌工程菌株tp06-dhs03；

11、步驟5、以上述獲得工程菌株tp06-dhs03為出發(fā)菌株，敲除轉(zhuǎn)酮醇酶基因tkta，獲得大腸桿菌工程菌株tp06-dhs04；

12、步驟6、以上述獲得工程菌株tp06-dhs04為出發(fā)菌株，敲除轉(zhuǎn)醛縮酶基因tala，獲得大腸桿菌工程菌株tp06-dhs05。

13、最終實(shí)現(xiàn)敲除大腸桿菌重組菌株tp06的丙酮酸脫氫酶基因(poxb基因)、負(fù)調(diào)控轉(zhuǎn)錄抑制因子tyrr和莽草酸脫氫酶aroe基因；過(guò)表達(dá)抗反饋抑制的dahp合成酶基因arogfbr，過(guò)表達(dá)磷酸烯醇式丙酮酸合酶ppsa、轉(zhuǎn)酮醇酶tkta和轉(zhuǎn)醛縮酶tala。

14、本發(fā)明還提供所述重組菌株的應(yīng)用，所述應(yīng)用方法為利用所述的重組菌株通過(guò)發(fā)酵生產(chǎn)3-脫氫莽草酸。

15、作為優(yōu)選的實(shí)施方式，在發(fā)酵過(guò)程中通過(guò)分批補(bǔ)料發(fā)酵。

16、一種生物制劑，所述生物制劑中含有所述重組菌株。所述生物制劑能夠通過(guò)發(fā)酵生產(chǎn)3-脫氫莽草酸。

17、本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比的有益效果：

18、本發(fā)明以大腸桿菌重組菌株tp06為出發(fā)菌株，敲除莽草酸脫氫酶aroe基因，過(guò)表達(dá)大腸桿菌內(nèi)源的ppsa、轉(zhuǎn)醛縮酶tala和tkta基因，增加了莽草酸途徑的前提供應(yīng)，提高dhs的合成通量；表達(dá)來(lái)自大腸桿菌的arog突變體arogfbr，該突變體解除了芳香族氨基酸反饋抑制的3-脫氧-d-阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸合成酶。然后，通過(guò)red同源重組基因敲除技術(shù)敲除副產(chǎn)物合成途徑中的關(guān)鍵基因poxb，減少了發(fā)酵過(guò)程中的乙酸積累，實(shí)現(xiàn)高葡萄糖濃度發(fā)酵，進(jìn)一步提高了dhs產(chǎn)量。最后，通過(guò)分批補(bǔ)料發(fā)酵使工程菌株實(shí)現(xiàn)了較高的dhs生產(chǎn)。

技術(shù)特征：

1.一種生產(chǎn)3-脫氫莽草酸大腸桿菌重組菌株，其特在于在于，所述重組菌株是以大腸桿菌重組菌株tp06為出發(fā)菌株，敲除其上的丙酮酸脫氫酶基因poxb、負(fù)調(diào)控轉(zhuǎn)錄抑制因子tyrr和莽草酸脫氫酶aroe基因；過(guò)表達(dá)抗反饋抑制的dahp合成酶基因arogfbr，過(guò)表達(dá)磷酸烯醇式丙酮酸合酶ppsa、轉(zhuǎn)酮醇酶tkta和轉(zhuǎn)醛縮酶tala。

2.權(quán)利要求1所述重組菌株的制備方法，其特征在于，所述方法如下：

3.權(quán)利要求1所述重組菌株活權(quán)利要求2所述方法制備的重組菌株的應(yīng)用，其特征在于，所述應(yīng)用方法為利用所述的重組菌株通過(guò)發(fā)酵生產(chǎn)3-脫氫莽草酸。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于，在發(fā)酵過(guò)程中通過(guò)分批補(bǔ)料發(fā)酵。

5.一種生物制劑，所述生物制劑中含有權(quán)利要求1所述重組菌株或權(quán)利要求2所述方法制備的重組菌株；所述生物制劑能夠通過(guò)發(fā)酵生產(chǎn)3-脫氫莽草酸。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明涉及一種生產(chǎn)3?脫氫莽草酸大腸桿菌重組菌株、構(gòu)建方法及應(yīng)用，屬于酶工程領(lǐng)域，本發(fā)明以大腸桿菌重組菌株TP06為出發(fā)菌株，敲除莽草酸脫氫酶AroE基因，過(guò)表達(dá)大腸桿菌內(nèi)源的ppsA、轉(zhuǎn)醛縮酶talA和tktA基因，增加了莽草酸途徑的前提供應(yīng)，提高DHS的合成通量；表達(dá)來(lái)自大腸桿菌的aroG突變體aroG<supgt;FBR</supgt;，該突變體解除了芳香族氨基酸反饋抑制的3?脫氧?D?阿拉伯庚酮糖酸?7?磷酸合成酶。然后，通過(guò)Red同源重組基因敲除技術(shù)敲除副產(chǎn)物合成途徑中的關(guān)鍵基因poxB，減少了發(fā)酵過(guò)程中的乙酸積累，實(shí)現(xiàn)高葡萄糖濃度發(fā)酵，進(jìn)一步提高了DHS產(chǎn)量。最后，通過(guò)分批補(bǔ)料發(fā)酵使工程菌株實(shí)現(xiàn)了較高的DHS生產(chǎn)。

技術(shù)研發(fā)人員：姜麗敏,于添池,劉冬冬,陳正,劉常樂(lè)
受保護(hù)的技術(shù)使用者：山東陽(yáng)成協(xié)盈生物技術(shù)有限責(zé)任公司
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/12/30