本發(fā)明涉及生物工程，具體涉及基于生物膜生產(chǎn)人表皮生長因子的重組釀酒酵母菌及其構(gòu)建方法與應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、人表皮生長因子(human?epidermal?growth?factor,hegf)在刺激細(xì)胞生長、增值和分化起重要作用，能促進(jìn)表皮傷口，角膜損傷和灼傷的愈合，還可以促進(jìn)神經(jīng)組織和鼓膜再生，對肝損傷和眼損傷有一定的修復(fù)作用。hegf在已經(jīng)被大量應(yīng)用在各種急性和慢性傷口，同時在美妝行業(yè)用于膚質(zhì)改善，前景十分巨大。

2、天然來源的hegf十分有限，分離步驟十分繁瑣，收率很低，不能滿足當(dāng)前的市場需求。目前，hegf的需求是基于微生物宿主的生物生產(chǎn)來滿足，已經(jīng)在大腸桿菌、釀酒酵母、中國卵巢細(xì)胞(cho)等多宿主中成功表達(dá)，但是不同的宿主有自身的局限性，大腸桿菌沒有翻譯后修飾功能，無法直接得到擁有生物活性的hegf，而cho細(xì)胞的培養(yǎng)成本較高，釀酒酵母存在過度糖基化，不易實(shí)現(xiàn)高密度發(fā)酵等特點(diǎn)，無論是何種宿主在生產(chǎn)hegf的過程中，一般采用間歇式發(fā)酵或者是連續(xù)發(fā)酵模式，也存在了環(huán)境耐受性差，生產(chǎn)細(xì)胞的流失等問題，從而導(dǎo)致hegf的生產(chǎn)效率較低。

3、生物膜是微生物細(xì)胞粘附在生物或非生物表面，形成嵌入細(xì)胞外聚合物中的微生物聚集體，具有保護(hù)細(xì)胞免受滲透壓、熱休克、氧化應(yīng)激和營養(yǎng)缺乏等惡劣環(huán)境條件的影響?；谏锬さ陌l(fā)酵是一種基于生物膜特性開發(fā)的技術(shù)，與其他細(xì)胞固定化技術(shù)(如包埋、交聯(lián)、吸附和共價結(jié)合)有很大不同。與在載體材料成本、性能和細(xì)胞固定方面受到限制的傳統(tǒng)細(xì)胞固定化方法有較大區(qū)別，生物膜發(fā)酵提供了優(yōu)越的發(fā)酵潛力、環(huán)境耐受性、效率和穩(wěn)定性。盡管基于生物膜的固定化發(fā)酵已成功應(yīng)用于生物乙醇等小分子的生產(chǎn)，但其在蛋白質(zhì)生產(chǎn)中的應(yīng)用仍不廣泛，相關(guān)研究也很少，而對于被fda認(rèn)證的一般安全性的釀酒酵母基于生物膜生產(chǎn)hegf的報道，迄今為止，尚未見到。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種基于生物膜生產(chǎn)人表皮生長因子的重組釀酒酵母菌。

2、本發(fā)明還要解決的技術(shù)問題是，提供一種基于生物膜生產(chǎn)人表皮生長因子的構(gòu)建方法。

3、本發(fā)明最后要解決的技術(shù)問題是，提供上述重組釀酒酵母菌在發(fā)酵制備人表皮生長因子中的應(yīng)用。

4、為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：

5、基于生物膜生產(chǎn)人表皮生長因子的重組釀酒酵母菌，以釀酒酵母s.cerevisiae為出發(fā)菌株，通過缺失蛋白酶編碼基因和/或過表達(dá)分子伴侶基因、過表達(dá)生物膜成膜基因，介導(dǎo)人表皮生長因子hegf的表達(dá)，構(gòu)建得到所述重組釀酒酵母菌。

6、一種基于生物膜生產(chǎn)人表皮生長因子的構(gòu)建方法，以釀酒酵母s.cerevisiae為出發(fā)菌株，通過缺失蛋白酶編碼基因和/或過表達(dá)分子伴侶、過表達(dá)生物膜成膜基因，介導(dǎo)人表皮生長因子hegf的表達(dá)。

7、進(jìn)一步的，將啟動子、融合多肽鏈和信號肽中的任意一種或幾種的組合導(dǎo)入出發(fā)菌株中。

8、優(yōu)選的，將啟動子、信號肽的組合或融合多肽鏈、信號肽的組合導(dǎo)入出發(fā)菌株中。

9、其中，所述啟動子為誘導(dǎo)型啟動子或組成型啟動子。

10、優(yōu)選的，所述誘導(dǎo)型啟動子為gal1，所述組成型啟動子為tef1、tpi1、tdh3中的任意一種。

11、其中，所述融合多肽鏈為hl28；所述信號肽為mfα或ta57。

12、具體的，所述gal1，其核苷酸序列如seq?id?no.12所示；所述tef1，其核苷酸序列如seq?id?no.9所示；所述tpi1，其核苷酸序列如seq?id?no.10所示；所述tdh3，其核苷酸序列如seq?id?no.11所示；所述hl28，其氨基酸序列如seq?id?no.23所示，對應(yīng)的核苷酸序列如seq?id?no.24所示；所述mfα，其氨基酸序列如seq?id?no.3所示，對應(yīng)的核苷酸序列如seq?id?no.4所示；所述ta57，其氨基酸序列如seq?id?no.7所示，對應(yīng)的核苷酸序列如seqid?no.8所示。

13、其中，所述出發(fā)菌株包括但不限于釀酒酵母530-1c、釀酒酵母2-1c、釀酒酵母by4741、釀酒酵母by4742或釀酒酵母w303-1a，現(xiàn)有技術(shù)中只要能夠作為本發(fā)明出發(fā)菌株的釀酒酵母均在本發(fā)明所保護(hù)的范圍之內(nèi)。

14、優(yōu)選的，所述的出發(fā)菌株為釀酒酵母by4742或釀酒酵母530-1c。

15、其中，所述蛋白酶編碼基因包括pep4、prb1、yap3、prc1、cmy1中的任意一種或幾種的組合。

16、優(yōu)選的，蛋白酶編碼基因包括pep4、prb1、yap3中的任意一種或幾種的組合，更優(yōu)選為pep4和prb1。

17、具體的，所述蛋白酶編碼基因pep4、prb1、yap3，其氨基酸序列依次如seq?idno.13、seq?id?no.15、seq?id?no.17所示，對應(yīng)的核苷酸序列依次如seq?id?no.14、seq?idno.16、seq?id?no.18所示。

18、其中，所述分子伴侶基因包括kar2、pdi1、hac1、der1、sec24、srp54、ero1、erv29中的任意一種或幾種的組合。

19、優(yōu)選的，分子伴侶基因包括pdi1、kar2、hac1中的任意一種或幾種的組合，更優(yōu)選為pdi1或kar2。

20、具體的，所述kar2、pdi1，其氨基酸序列依次如seq?id?no.19、seq?id?no.21所示，對應(yīng)的核苷酸序列依次如seq?id?no.20、seq?id?no.22所示；所述hac1、der1、sec24、srp54、ero1和erv29基因，其氨基酸序列依次如seq?id?no.25、seq?id?no.27、seq?idno.29、seq?id?no.31、seq?id?no.33、seq?id?no.35所示，對應(yīng)的核苷酸序列依次如seq?idno.26、seq?id?no.28、seq?id?no.30、seq?id?no.32、seq?id?no.34、seq?id?no.36所示。

21、其中，所述過表達(dá)分子伴侶，基于質(zhì)粒過表達(dá)分子伴侶或?qū)⒎肿影閭H整合到釀酒酵母菌基因組中過表達(dá)。

22、優(yōu)選的，在以釀酒酵母530-1c為最原始的出發(fā)菌株時，通過將分子伴侶基因pdi1、kar2和hac1整合到釀酒酵母菌基因組中進(jìn)行過表達(dá)。

23、具體的，所述pdi1基因的整合基因位點(diǎn)為1309a，所述kar2基因的整合基因位點(diǎn)為911b，所述hac1基因的整合基因位點(diǎn)為hac1。

24、其中，所述生物膜成膜基因包括als3和flo11中的任意一種或兩種的組合。

25、進(jìn)一步的，所述als3基因來源于白色念珠菌candida?albicans，所述flo11基因?yàn)獒劸平湍竷?nèi)源。

26、優(yōu)選的，所述生物膜成膜基因?yàn)閍ls3或flo11，更優(yōu)選為als3。

27、具體的，所述als3、flo11，其氨基酸序列依次如seq?id?no.37、seq?id?no.39所示，對應(yīng)的核苷酸序列如seq?id?no.38、seq?id?no.40所示。

28、其中，所述過表達(dá)生物膜成膜基因，是將生物膜成膜基因整合到釀酒酵母菌基因組中過表達(dá)。

29、具體的，所述flo11基因的整合基因位點(diǎn)為1622b，所述als3基因的整合基因位點(diǎn)為106a。

30、在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，當(dāng)以釀酒酵母by4742作為hegf的表達(dá)菌株時，重組釀酒酵母菌具體的構(gòu)建如下：以釀酒酵母by4742作為出發(fā)菌株，以啟動子tef1、tpi1、tdh3、gal1中的任意一種和信號肽ta57構(gòu)建hegf質(zhì)粒表達(dá)體系，通過缺失蛋白酶編碼基因pep4、prb1、yap3中的任意一種或幾種的組合和/或過表達(dá)分子伴侶基因pdi1、kar2中的任意一種或兩種的組合，并將絮凝蛋白編碼基因flo11或als3整合至基因組中，構(gòu)建基于生物膜生產(chǎn)人表皮生長因子的重組釀酒酵母菌。

31、在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，當(dāng)釀酒酵母530-1c作為hegf的表達(dá)菌株時，重組釀酒酵母菌具體的構(gòu)建如下：以釀酒酵母530-1c為出發(fā)菌株，以信號肽和融合多肽hl28構(gòu)建hegf質(zhì)粒表達(dá)體系，通過缺失pep4、prb1中的任意一種或兩種的組合和/或過表達(dá)分子伴侶基因kar2、pdi1、hac1、der1、sec24、srp54、ero1、erv29中的任意一種或幾種的組合，并將絮凝蛋白編碼基因flo11或als3整合至基因組中，構(gòu)建基于生物膜生產(chǎn)人表皮生長因子的重組釀酒酵母菌。

32、重組釀酒酵母菌在發(fā)酵制備人表皮生長因子中的應(yīng)用也在本發(fā)明所保護(hù)的范圍之內(nèi)。

33、其中，所述發(fā)酵為游離發(fā)酵或固定化發(fā)酵。

34、優(yōu)選的，所述游離發(fā)酵為補(bǔ)料發(fā)酵，所述固定化發(fā)酵為固定化連續(xù)發(fā)酵。

35、其中，所述固定化連續(xù)發(fā)酵，其固定化載體包括但不限于棉纖維，現(xiàn)有技術(shù)中能夠作為固定化載體的材料，均可以用于本發(fā)明固定化發(fā)酵中，如玻璃片、聚酯纖維、尼龍纖維、木漿棉、聚乳酸、活性炭、聚乙烯、聚乙烯醇、聚氨酯、粘土、金屬和陶瓷中的任意一種。

36、優(yōu)選的，所述棉纖維，其含量為2.5～60g/l。

37、其中，所述補(bǔ)料發(fā)酵，具體是將種子液接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中，當(dāng)發(fā)酵18～24h，流加補(bǔ)料培養(yǎng)基，維持葡萄糖濃度為0.5～3g/l，總發(fā)酵時長為120～144h；其中，所述發(fā)酵，其發(fā)酵條件為：溫度28～32℃，初始攪拌轉(zhuǎn)速500rpm，通氣速率1～3vvm，維持溶氧值20～30％，ph?6.0～6.5。

38、其中，所述固定化連續(xù)發(fā)酵，具體是將種子液接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵，當(dāng)發(fā)酵至18～24h，流加補(bǔ)料培養(yǎng)基，維持葡萄糖濃度為0.5～3g/l，當(dāng)發(fā)酵至24～60h時，結(jié)束第一批次發(fā)酵，排出20～100％v/v的發(fā)酵液，補(bǔ)入等量的新鮮補(bǔ)料培養(yǎng)基，重復(fù)所述發(fā)酵、流加補(bǔ)料培養(yǎng)基、排出20～100％v/v的發(fā)酵液的操作。

39、優(yōu)選的，當(dāng)發(fā)酵至48h時，結(jié)束第一批次發(fā)酵。

40、具體的，所述發(fā)酵，其發(fā)酵條件為：溫度28～32℃，初始攪拌轉(zhuǎn)速500rpm，通氣速率1～3vvm，維持溶氧值20～30％，ph?6.0～6.5。

41、在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，所述重復(fù)所述發(fā)酵、流加補(bǔ)料培養(yǎng)基、排出20～100％v/v的發(fā)酵液的操作，可以操作2～15批次。

42、其中，所述補(bǔ)料發(fā)酵和固定化連續(xù)發(fā)酵的發(fā)酵培養(yǎng)基組成如下：葡萄糖30～50g/l、酵母提取物8～10g/l、胰蛋白胨15～20g/l，溶劑為去離子水；所述補(bǔ)料培養(yǎng)基組成如下：酵母提取物8～10g/l、胰蛋白胨15～20g/l、葡萄糖60～100g/l、kh2po4?2～5g/l、mgso4?2～5g/l、cacl2?1～2g/l、bsa?1～3g/l、消泡劑1～2ml/l。

43、有益效果：

44、(1)本發(fā)明篩選得到了兩個表達(dá)宿主by4742和530-1c用于表達(dá)hegf，從基因?qū)用妫簩π盘栯膍fα、ta57，啟動子gal1、tef1、tpi1、tdh3以及融合多肽片段hl28，進(jìn)行了篩選和組合優(yōu)化，使hegf的產(chǎn)量從μg級別(80μg/l)提升至mg級別(50mg/l)。

45、(2)本發(fā)明優(yōu)化了釀酒酵母分泌蛋白通路中對hegf起到調(diào)控作用的相關(guān)節(jié)點(diǎn)基因和對hegf有降解作用的蛋白酶。增強(qiáng)了蛋白分泌途徑、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(er)中相關(guān)元件對hegf的加工水平，使釀酒酵母生產(chǎn)hegf的水平顯著提升，使hegf的產(chǎn)量50mg/l提升至140mg/l，提升了180％。

46、(3)本發(fā)明通過引入了生物膜成膜基因flo11和als3，使釀酒酵母的表型發(fā)生了變化，從而可以吸附在載體中，實(shí)現(xiàn)了釀酒酵母固定在載體中生產(chǎn)hegf的發(fā)酵模式。

47、(4)本發(fā)明通過構(gòu)建成功的生物膜菌株，在發(fā)酵罐上成功實(shí)現(xiàn)了連續(xù)發(fā)酵的模式，且產(chǎn)量穩(wěn)定在300mg/l之上，生產(chǎn)效率6.25mg/l/h大于游離發(fā)酵的4.52mg/l/h。