本發(fā)明屬于植物病原菌檢測，具體涉及一種基于rpa-crispr/cas12a檢測麥角病菌的引物、試劑盒及檢測方法。

背景技術(shù)：

1、麥角病是由麥角菌clavicepspurpurea引起的一種嚴(yán)重危害小麥的病害，被侵染的小花會分泌含有大量分生孢子的黃色蜜露狀黏液，隨后形成堅(jiān)硬的、紫黑色、長約0.2～0.5厘米的角狀組織，即為菌核(麥角)。麥角菌不僅會導(dǎo)致小麥大幅減產(chǎn)，其產(chǎn)生的麥角生物堿，如麥角堿(ergostine)、麥角胺(ergotamine)和麥堿(ergine)等，具有高度毒性，人或牲畜誤食含有麥角的糧食或飼料，可引發(fā)壞疽性和痙攣性麥角中毒。我國進(jìn)口小麥的主要來源地如美國、加拿大、澳大利亞等均為麥角病的流行區(qū)。根據(jù)國家標(biāo)準(zhǔn)gb2715-2006《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)糧食》規(guī)定，小麥中麥角的檢出限量為0.01％，而在大米、玉米、豆類中則不得檢出。然而，全國各口岸多次出現(xiàn)進(jìn)口小麥中麥角超標(biāo)問題，毗鄰我國的中亞和東亞國家已有麥角菌分布信息，2022年我國云南小麥中首次發(fā)現(xiàn)了麥角病。該病對小麥生產(chǎn)構(gòu)成潛在威脅，因此開發(fā)快速、靈敏的病原菌檢測技術(shù)對于麥角病的監(jiān)測至關(guān)重要。

2、目前，常用的病原菌鑒定方法主要有傳統(tǒng)鑒定方法和分子鑒定方法。傳統(tǒng)鑒定方法如柯赫氏法則等檢測和診斷過程周期長、工作量大、結(jié)果有誤差。隨著分子檢測技術(shù)的發(fā)展和更新，新的恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)如lamp及rpa等極大地簡化了檢測的操作流程，并降低了設(shè)備要求；在crispr基因編輯系統(tǒng)中，cas12a蛋白在指導(dǎo)rna的引導(dǎo)下切割靶標(biāo)dna，激活其側(cè)向裂解活性，從而無差別地裂解周圍單鏈dna報(bào)告探針，該技術(shù)可作為dna核酸檢測工具。然而，目前這種技術(shù)尚未應(yīng)用于麥角病菌的快速檢測中。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于針對上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種基于rpa-crispr/cas12a檢測麥角病菌的引物、試劑盒及檢測方法，該方法具有用時(shí)短、特異性強(qiáng)、靈敏度高、結(jié)果準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)。

2、為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：

3、一種基于rpa-crispr/cas12a檢測麥角病菌的引物，所述麥角病菌的拉丁學(xué)名為clavicepspurpurea，所述檢測麥角病菌的引物包括rpa上游引物、rpa下游引物和crrna引物及通用引物，

4、所述rpa上游引物為mj-rpa-f，核苷酸序列如seq?id?no.1所示；

5、所述rpa下游引物為mj-rpa-r，核苷酸序列如seq?id?no.2所示；

6、所述crrna引物為mj-crrna，核苷酸序列如seq?id?no.3所示；

7、所述通用引物的核苷酸序列如seq?id?no.4所示。

8、本發(fā)明還提供了一種基于rpa-crispr/cas12a檢測麥角病菌的試劑盒，該試劑盒包括所述基于rpa-crispr/cas12a檢測麥角病菌的引物。

9、優(yōu)選地，所述試劑盒還包括cas12a蛋白、t7轉(zhuǎn)錄酶、dna聚合酶、緩沖液、cas12/13專用核酸檢測試紙條。

10、本發(fā)明還提供了一種基于rpa-crispr/cas12a檢測麥角病菌的方法，包括以下步驟：

11、s1、提取待測樣本dna；

12、s2、rpa擴(kuò)增：利用rpa上、下游引物對s1中提取的待測樣本dna在溫度為37℃的條件下進(jìn)行恒溫?cái)U(kuò)增10～20min，得到rpa擴(kuò)增產(chǎn)物；

13、所述擴(kuò)增反應(yīng)體系為：待測樣品dna?2μl、10μm的rpa上游引物2μl、10μm的rpa下游引物2μl、反應(yīng)酶3μl、rapid緩沖液25μl、無酶水補(bǔ)足至50μl；

14、s3、crrna模板的合成：用crrna引物和通用引物進(jìn)行pcr擴(kuò)增，得到crrna的dna模板；

15、所述pcr擴(kuò)增體系為：10×pfu?buffer?5μl、dntp?mix?4μl、10μm?crrna引物3μl、10μm通用引物3μl、4000u/ml?pfu?dna聚合酶0.25μl、無酶水補(bǔ)足至50μl；所述dntp?mix為datp、dgtp、dctp和dutp的混合物，所述datp、dgtp、dctp和dutp的濃度均為2.5mm；

16、所述pcr擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃3min；95℃15s，55℃15s，72℃20s，35個(gè)循環(huán)；72℃10min；16℃保存；

17、s4、crrna的合成：將s3中得到的crrna的dna模板在溫度為37℃的條件下進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄3～4h，合成crrna；

18、所述體外轉(zhuǎn)錄合成的反應(yīng)體系為：200ng/μl?crrna的dna模板5μl、40u/μl?rnaseinhibitor?1μl、10×transcription?buffer?2μl、1000u/ml?t7?rna聚合酶2μl、ntp混合物4μl、無酶水補(bǔ)足至20μl；所述ntp混合物為atp、gtp、ctp和utp各1μl；

19、s5、rpa-crispr/cas12a檢測體系的建立：使用s2所述的rpa擴(kuò)增產(chǎn)物和s4中得到的crrna建立rpa-crispr/cas12a檢測體系，在溫度為37℃的條件下反應(yīng)5～15min，得到rpa-crispr/cas12a反應(yīng)產(chǎn)物；

20、所述rpa-crispr/cas12a檢測體系為：10×neb?cutsmart?buffer?6μl、200ng/μlcas12a?6μl、40u/μl?rnase?inhibitor?1.5μl、4.25ng/μl?crrna?18μl、10μm?fb探針1.2μl、rpa擴(kuò)增產(chǎn)物2μl，無酶水補(bǔ)足至60μl；

21、所述fb探針的核苷酸序列如seq?id?no.5所示，5’端用fam羧基熒光素修飾，3’端用生物素biotin修飾；

22、s6、檢測結(jié)果的判讀：將s5中得到的rpa-crispr/cas12a反應(yīng)產(chǎn)物用cas12/13專用核酸檢測試紙條檢測，2～3min后觀察所述cas12/13專用核酸檢測試紙條檢測線的顏色變化：當(dāng)試紙條檢測線(t)出現(xiàn)紅色條帶、質(zhì)控線(c)不顯色，或質(zhì)控線(c)和檢測線(t)顏色均出現(xiàn)紅色條帶，則說明cas12/13可以進(jìn)行有效切割，并激活報(bào)告基團(tuán)顯色，結(jié)果判定為陽性；當(dāng)只有質(zhì)控線(c)出現(xiàn)一條紅色條帶，檢測線(t)不顯色，則判定為陰性。

23、本發(fā)明由具有以下顯著的技術(shù)效果：

24、1、特異性強(qiáng)。本發(fā)明基于rpa-crispr/cas12a檢測麥角病菌的檢測體系在目的基因保守區(qū)域的特異性片段的特異性位點(diǎn)進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，可實(shí)現(xiàn)麥角病菌的精準(zhǔn)、快速鑒定。

25、2、靈敏度高。本發(fā)明對麥角病菌的檢測靈敏度極高，每個(gè)反應(yīng)可檢測低至10個(gè)拷貝靶標(biāo)dna。

26、3、結(jié)果準(zhǔn)確。本發(fā)明通過rpa引物擴(kuò)增和cas12a/crrna的靶向裂解，確保了檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。

27、4、用時(shí)短。整個(gè)檢測技術(shù)方法只需要在恒溫(37℃)條件下進(jìn)行，檢測流程<1h。

28、5、實(shí)用性好。本發(fā)明通過一次合成crrna，可長期使用，降低了對儀器設(shè)備的要求，結(jié)果可直接通過側(cè)流層析試紙條反應(yīng)來判斷，可用于麥角病菌的田間檢測和進(jìn)出口岸檢測。

29、下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明。