本發(fā)明屬于生物，具體涉及一種位于6號(hào)染色體上與紫花苜?？购迪嚓P(guān)的indel分子標(biāo)記及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

0、技術(shù)背景

1、在育種過(guò)程中，對(duì)目標(biāo)性狀的選擇，深受基因型和表型的影響。傳統(tǒng)育種依賴(lài)于對(duì)植物外觀特征的識(shí)別和評(píng)估，但其受到一定的限制。傳統(tǒng)方法所需的時(shí)間較長(zhǎng)，需要經(jīng)過(guò)多年的觀察和繁育，方可確定目標(biāo)性狀的遺傳穩(wěn)定性。此外，外觀特征容易受到環(huán)境的影響，導(dǎo)致結(jié)果不確定。而分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)在育種實(shí)踐中表現(xiàn)出獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。通過(guò)利用遺傳標(biāo)記與目標(biāo)性狀之間的關(guān)聯(lián)進(jìn)行選擇，可以更加準(zhǔn)確、更加快速地鑒定具有目標(biāo)性狀的個(gè)體或基因型。通過(guò)分析基因組中的分子標(biāo)記，育種者更能了解基因型與性狀之間的關(guān)系，從而更精準(zhǔn)地選拔具有卓越性狀的個(gè)體進(jìn)行繁殖。

2、全基因組關(guān)聯(lián)分析在育種領(lǐng)域中備受關(guān)注，通過(guò)分析大量的遺傳標(biāo)記與目標(biāo)性狀之間的關(guān)聯(lián)，可以識(shí)別出與性狀相關(guān)的關(guān)鍵基因或位點(diǎn)。這項(xiàng)技術(shù)的研發(fā)和應(yīng)用已經(jīng)成為當(dāng)前育種領(lǐng)域的重要熱點(diǎn)和競(jìng)爭(zhēng)領(lǐng)域之一。紫花苜蓿(medicago?sativa?l.)抗旱育種對(duì)于提高作物耐旱性、增加產(chǎn)量、降低資源消耗至關(guān)重要。在氣候變化和水資源日益緊缺的背景下，開(kāi)發(fā)抗旱品種能夠提高農(nóng)作物在干旱條件下的生長(zhǎng)適應(yīng)能力，減少災(zāi)害風(fēng)險(xiǎn)，維護(hù)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)穩(wěn)定性，促進(jìn)農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展，同時(shí)為農(nóng)民增加經(jīng)濟(jì)效益，對(duì)于保障糧食安全和生態(tài)環(huán)境的持續(xù)改善具有重要意義。紫花苜蓿的育種起步晚，結(jié)合全基因組關(guān)聯(lián)分析進(jìn)行抗旱相關(guān)標(biāo)記開(kāi)發(fā)與定位的報(bào)道非常有限。因此，進(jìn)行紫花苜蓿抗旱相關(guān)分子標(biāo)記的開(kāi)發(fā)，對(duì)于構(gòu)建輔助選擇育種體系、種質(zhì)資源的改良、新品種選育等具有重要的意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的之一在于提供了一種與紫花苜?？购迪嚓P(guān)的indel分子標(biāo)記。

2、本發(fā)明的目的之二在于提供上述與紫花苜?？购迪嚓P(guān)的indel分子標(biāo)記的應(yīng)用。

3、為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取如下技術(shù)方案：

4、本發(fā)明公開(kāi)的抗旱性相關(guān)的indel分子標(biāo)記，位于紫花苜蓿第6號(hào)染色體上，所述分子標(biāo)記命名為ms_chr6_52997265。

5、擴(kuò)增與紫花苜?？购敌韵嚓P(guān)的indel分子標(biāo)記的引物對(duì)，所述分子標(biāo)記ms_chr6_52997265對(duì)應(yīng)的引物對(duì)序列為：

6、ms_chr6_52997265-f：cgtgcaacgaacaagccac(seq?id?no.1所示)；

7、ms_chr6_52997265-r：ggatcaaatacatatttaacattcaaatataa(seq?id?no.2所示)。

8、本發(fā)明還公開(kāi)了上述分子標(biāo)記引物對(duì)在紫花苜蓿抗旱輔助育種中的應(yīng)用。也就是說(shuō)本發(fā)明的分子標(biāo)記可用于今后的分子標(biāo)記輔助育種中，通過(guò)苗期提取葉片的dna，檢測(cè)是否存在本發(fā)明的分子標(biāo)記，進(jìn)而來(lái)鑒定紫花苜蓿品種的抗旱相關(guān)性狀。所述檢測(cè)可以使用pcr檢測(cè)的方法，具體可以使用上述的分子標(biāo)記引物對(duì)，所述檢測(cè)還可以通過(guò)測(cè)序方法進(jìn)行。

9、本發(fā)明還公開(kāi)了上述分子標(biāo)記在鑒定紫花苜?？购敌誀钪械膽?yīng)用，尤其是在篩選和鑒定紫花苜蓿抗旱性高低中的應(yīng)用，具體地，用于鑒定紫花苜蓿是否具有抗旱性狀具體步驟如下：

10、(1)以供試種質(zhì)的dna為pcr擴(kuò)增的模板，以上述分子標(biāo)記ms_chr6_52997265對(duì)應(yīng)的引物對(duì)進(jìn)行pcr擴(kuò)增，pcr擴(kuò)增的反應(yīng)體系如表1：

11、表1?pcr擴(kuò)增的反應(yīng)體系

12、

13、94℃預(yù)變性4min；94℃變性30s，59℃退火30s，72℃延伸20s，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min；4℃保存。

14、(2)pcr產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)：取3μl，根據(jù)條帶的結(jié)果判斷紫花苜?？购档慕Y(jié)果。

15、利用引物對(duì)ms_chr6_52997265-f、ms_chr6_52997265-r進(jìn)行pcr擴(kuò)增，如果pcr擴(kuò)增產(chǎn)物僅有一條如seq?id?no.4所示的長(zhǎng)度為300bp的特征條帶，則紫花苜蓿為敏旱類(lèi)型；如果pcr擴(kuò)增產(chǎn)物既有一條如seq?id?no.4所示的長(zhǎng)度為300bp的特征條帶，又有一條如seqid?no.5所示的長(zhǎng)度為257bp的特征條帶，則紫花苜蓿為抗旱類(lèi)型。

16、另外，本發(fā)明還保護(hù)一種用于鑒定紫花苜?？购敌誀畹脑噭┖校鲈噭┖兄邪飳?duì)ms_chr6_52997265-f、ms_chr6_52997265-r。所述試劑盒的其它成分均屬于常規(guī)的試劑。具體還包括10×pcr?buffer、dntp和taq?dna聚合酶。本發(fā)明對(duì)所述引物對(duì)的濃度沒(méi)有特殊限制，采用本領(lǐng)域所熟知的引物濃度即可。本發(fā)明對(duì)所述10×pcr?buffer、dntp和taq?dna聚合酶的來(lái)源沒(méi)有特殊限制，采用本領(lǐng)域所熟知的普通pcr擴(kuò)增用試劑即可。

17、采用本發(fā)明的試劑盒可以快速的鑒定紫花苜蓿的抗旱性狀，還可以快速的鑒定紫花苜蓿的抗旱基因型。具體方法參照鑒定紫花苜蓿是否具有抗旱性狀具體步驟，通過(guò)對(duì)pcr擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)和/或測(cè)序，如果pcr擴(kuò)增產(chǎn)物僅有一條如seq?id?no.4所示的長(zhǎng)度為300bp的特征條帶，則紫花苜蓿為純合敏旱基因型；如果pcr擴(kuò)增產(chǎn)物既有一條如seq?idno.4所示的長(zhǎng)度為300bp的特征條帶，又有一條如seq?id?no.5所示的長(zhǎng)度為257bp的特征條帶，則紫花苜蓿為雜合抗旱基因型。

18、本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)：

19、(1)本發(fā)明的發(fā)明人篩選出了一個(gè)與紫花苜?？购迪嚓P(guān)的分子標(biāo)記ms_chr6_52997265，該分子標(biāo)記位于6號(hào)染色體上，采用本發(fā)明的分子標(biāo)記ms_chr6_52997265可以快速的對(duì)紫花苜蓿的抗旱性狀進(jìn)行準(zhǔn)確的鑒定。

20、(2)用與抗旱性狀的連鎖的標(biāo)記來(lái)進(jìn)行篩選，有利于分子標(biāo)記輔助選擇育種，其方法簡(jiǎn)單可行，有利于提高效率，節(jié)省成本。

21、(3)本發(fā)明的分子標(biāo)記具有檢測(cè)方便、擴(kuò)增產(chǎn)物穩(wěn)定、特異性高的特點(diǎn)，可以簡(jiǎn)便、快速、高通量地應(yīng)用于紫花苜?？购涤N實(shí)踐及品種鑒定。

技術(shù)特征：

1.位于6號(hào)染色體上與紫花苜蓿抗旱相關(guān)的分子標(biāo)記，所述分子標(biāo)記命名為ms_chr652997265，其特征在于，所述分子標(biāo)記ms_chr652997265對(duì)應(yīng)的引物對(duì)序列為：

2.權(quán)利要求1所述的分子標(biāo)記在紫花苜蓿分子標(biāo)記輔助育種中的應(yīng)用。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于，所述分子標(biāo)記用于鑒定或輔助鑒定紫花苜蓿的抗旱性狀。

4.一種紫花苜?？购敌誀铊b定方法，其特征在于，所述方法包括如下步驟：

5.一種用于紫花苜?？购敌澡b定的試劑盒，其特征在于，包含權(quán)利要求1中所述的引物對(duì)。

6.權(quán)利要求5所述的試劑盒在鑒定紫花苜?？购祷蛐头矫娴膽?yīng)用。

7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于，利用試劑盒對(duì)紫花苜?？购祷蛐瓦M(jìn)行鑒定的方法為：

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明提供了一種位于6號(hào)染色體上與紫花苜?？购迪嚓P(guān)的分子標(biāo)記及應(yīng)用，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。所述分子標(biāo)記位于紫花苜蓿第6號(hào)染色體上，插入或缺失片段的核苷酸序列如序列表SEQ?ID?NO.3所示。用于擴(kuò)增InDel分子標(biāo)記的引物對(duì)，其核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1～2所示。本發(fā)明所述InDel分子標(biāo)記及其引物對(duì)能夠鑒定或輔助鑒定紫花苜?？购敌誀睢Ｍ瑫r(shí)本發(fā)明還提供了利用所述InDel分子標(biāo)記快速鑒定紫花苜?？购敌缘姆椒ǎ摲椒ê?jiǎn)便快捷，鑒定結(jié)果準(zhǔn)確，具有良好的推廣應(yīng)用前景。

技術(shù)研發(fā)人員：劉文獻(xiàn),隋超,劉曉玲,劉志鵬
受保護(hù)的技術(shù)使用者：蘭州大學(xué)
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/11/4