本發(fā)明涉及生物技術(shù)、基因工程疫苗領(lǐng)域，具體涉及基于布魯氏菌33種保護(hù)基因的重組腺病毒。

背景技術(shù)：

1、布魯氏菌病是一種由布魯氏菌屬細(xì)菌引起的人畜共患傳染病。其中羊布魯氏菌(b.melitensis)，流產(chǎn)布魯氏菌(b.abortus)和豬布魯氏菌(b.suis)被認(rèn)為是致病性最強(qiáng)的布魯氏菌，引起大多數(shù)人類和家畜布魯氏菌病，對(duì)畜牧業(yè)和公共衛(wèi)生造成嚴(yán)重影響。動(dòng)物感染布魯氏菌可引起雌性動(dòng)物流產(chǎn)和雄性動(dòng)物的不育。人感染布魯氏菌后可引起關(guān)節(jié)疼痛，影響勞動(dòng)能力及生育能力。近年來，布魯氏菌病在世界范圍內(nèi)呈反彈趨勢(shì)，由于我國豬、牛、羊飼養(yǎng)數(shù)量的增加和地域間無序調(diào)運(yùn)、檢驗(yàn)檢疫技術(shù)過時(shí)等各種原因，導(dǎo)致我國布魯氏菌病疫情尤其嚴(yán)重。目前對(duì)于布魯氏菌病的防控主要是如下兩類疫苗接種。

2、第一類：傳統(tǒng)弱毒活疫苗。傳統(tǒng)弱毒活疫苗是目前防控布魯氏菌病使用的主要疫苗，包括傳統(tǒng)的豬種s2株、牛種a19株和羊種m5(m5-90)株，以及新型的布魯氏菌基因缺失標(biāo)記活疫苗。豬種s2株是在1952年首次由中國獸醫(yī)藥品檢查所通過分離豬流產(chǎn)胚胎時(shí)獲得；牛種a19株是在上世紀(jì)50年代我國通過蘇聯(lián)獲??；羊種m5(m5-90)株是利用綿羊布魯氏菌6056菌株對(duì)鏈霉素耐藥培養(yǎng)獲得；布魯氏菌基因缺失標(biāo)記活疫苗是以羊種m5(m5-90)株為親本缺失bp26基因缺失而研制的疫苗。無論是傳統(tǒng)弱毒活疫苗還是新型布魯氏菌基因缺失疫苗均屬于弱毒活疫苗，這些疫苗都是通過體外培養(yǎng)獲得。

3、現(xiàn)有的弱毒活疫苗雖然能在防控布魯氏菌病上發(fā)揮有效作用，但其使用同時(shí)帶來以下諸多風(fēng)險(xiǎn)。(1)存在不可避免的散毒風(fēng)險(xiǎn)：弱毒疫苗株雖然毒力較弱，接種動(dòng)物機(jī)體后可以產(chǎn)生保護(hù)力，但是弱毒疫苗株還是屬于活毒，接種時(shí)和接種的動(dòng)物不可避免的會(huì)散落到環(huán)境中，對(duì)環(huán)境造成污染，且布魯氏菌弱毒株屬于細(xì)菌，可以在適宜的條件下自我繁殖，增加了疾病擴(kuò)散的風(fēng)險(xiǎn)。(2)因存在毒力重組風(fēng)險(xiǎn)，增加防控難度：無論散落在環(huán)境中還是接種到動(dòng)物體內(nèi)的弱毒疫苗都能自我復(fù)制，如果和自然界中存在野毒布魯氏菌接觸，就有可能發(fā)生基因交換而產(chǎn)生重組，產(chǎn)生變異的布魯氏菌，增加了布魯氏菌病防控的難度。(3)因存在毒力返強(qiáng)風(fēng)險(xiǎn)，增加防控難度：布魯氏菌弱毒株可以通過遺傳重組、易感動(dòng)物反復(fù)傳代等途徑，逐漸恢復(fù)甚至更強(qiáng)的毒力，進(jìn)一步增加防控難度。(4)對(duì)人類和動(dòng)物具有一定的致病性：弱毒株和基因缺失株均屬于減毒活疫苗，雖然毒力低，但依然殘留一定的毒力，導(dǎo)致人類和動(dòng)物流產(chǎn)、睪丸炎和不孕不育。另外，很難通過血清學(xué)檢測(cè)區(qū)分感染動(dòng)物和疫苗接種動(dòng)物。

4、第二類：新型疫苗

5、由于傳統(tǒng)弱毒疫苗存在自身無法克服的缺陷，所以科研工作者不對(duì)探索新型疫苗來解決這些問題，主要有dna疫苗、亞單位疫苗和重組活載體疫苗。

6、(1)dna疫苗：利用巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的pcdna3質(zhì)粒插入流產(chǎn)布魯氏菌lumazine合酶(bls)基因構(gòu)建出攜帶bls基因的pcdna-bls質(zhì)粒，免疫小鼠后，雖然降低了細(xì)菌負(fù)荷，但是沒有達(dá)到世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(oie)制定的布魯氏菌疫苗評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。(infectimmun.2002may；70(5):2507-11.doi:10.1128/iai.70.5.2507-2)。

7、(2)亞單位疫苗：將布魯氏菌一種蛋白p39接種小鼠后雖然提供了一定的保護(hù)性，但是和世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(oie)制定的布魯氏菌疫苗評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)相差甚遠(yuǎn)。(infectimmun.2001aug；69(8):4816-22.doi:10.1128/iai.69.8.4816-4822.2001.)四種蛋白aspc、dps、yaec和inpb的單亞單位疫苗可以提高其保護(hù)效果，但是也沒有達(dá)到世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(oie)制定的布魯氏菌疫苗評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。(vaccine.2018may?17；36(21):3027-3033.doi:10.1016/j.vaccine.2018.04.019.epub?2018apr17.)

8、(3)重組流感病毒載體疫苗：利用流感病毒載體表達(dá)布魯氏菌外膜蛋白(omp)16和19、核糖體l7/l12、cu-zn超氧化物歧化酶(sod)蛋白雖然可以保護(hù)小鼠免受1.6至2.97log范圍內(nèi)的布魯氏菌強(qiáng)毒攻擊，但是也沒有達(dá)到世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(oie)制定的布魯氏菌疫苗評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。(biomed?res?int.2020nov?19:2020:1438928.doi:10.1155/2020/1438928.ecollection?2020.)

9、(4)重組腺病毒載體疫苗

10、自從腺病毒發(fā)現(xiàn)以來，尤其是人5型復(fù)制缺陷型腺病毒(ad5)因多種優(yōu)點(diǎn)而成為疫苗研發(fā)的重要載體：一是改造后的腺病毒基因組非常穩(wěn)定，并且易于體外操作操作；二是腺病毒載體可以容納大片段外源基因，可以用于構(gòu)建多片段抗原表位的疫苗；三是復(fù)制缺陷型腺病毒安全性良好，復(fù)制缺陷型腺病毒只能在人胚胎腎細(xì)胞中增殖，在其他類型的細(xì)胞中只能一過性繁殖，繁殖的病毒具有缺陷性，不能再次繁殖，所以不存在常規(guī)弱毒疫苗株散毒、毒力重組和毒力返強(qiáng)的缺陷；四是腺病毒載體能對(duì)表面抗原產(chǎn)生強(qiáng)大而持久的體液和細(xì)胞免疫反應(yīng)，而且腺病毒自身六鄰體蛋白是激活先天免疫的有效佐劑，所以腺病毒載體具有高度免疫原性；五是腺病毒易于制備和儲(chǔ)存，腺病毒可以使用無血清懸浮細(xì)胞培養(yǎng)，生產(chǎn)迅速且產(chǎn)量高，可以應(yīng)對(duì)激增的市場(chǎng)需求，且用常規(guī)的凍干方法其免疫原性至少保持1年。腺病毒載體的這些優(yōu)點(diǎn)彌補(bǔ)了弱毒疫苗的缺陷。

11、一直以來，布魯氏菌的抗原都是根據(jù)經(jīng)驗(yàn)篩選出的，如omp16，omp19，omp25，omp31，sura，dnak，觸發(fā)因子(tf)，核糖體蛋白l7/l12，細(xì)菌鐵蛋白(bfr)p39和lumazine合酶bls，如公開號(hào)為cn117717611a的專利“一種布魯氏菌bp26基因重組腺病毒載體疫苗及其制備和應(yīng)用”，和公開號(hào)為cn102703505a的“共表達(dá)布魯氏菌重組腺病毒及其制備方法和用途”，表達(dá)布魯氏菌l7/l12和bcsp31基因，以及期刊表達(dá)布魯氏菌p39和lumazine基因的重組腺病毒，雖然可以減少小鼠模型中布魯氏菌的數(shù)量，但是均沒有達(dá)到世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(oie)制定的布魯氏菌疫苗評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。(https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/29492808/)

12、事實(shí)上：由于布魯氏菌基因組龐大且復(fù)雜，現(xiàn)有技術(shù)利用布魯氏菌一個(gè)或兩個(gè)抗原基因制備的疫苗無法全面中和布魯氏菌毒力基因，也就無法制備有效的疫苗；其次，根據(jù)經(jīng)驗(yàn)挑選的布魯氏菌保護(hù)基因更是不能反映布魯氏菌保護(hù)基因的本質(zhì)，其防疫有效性有待進(jìn)一步提升和驗(yàn)證。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的在于提供一種基于布魯氏菌33種保護(hù)基因的重組腺病毒，以同時(shí)提升預(yù)防布魯氏菌病的安全性和有效性，并達(dá)到世界動(dòng)物衛(wèi)生組織oie制定的布魯氏菌疫苗評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。

2、為實(shí)現(xiàn)以上目的，本發(fā)明通過基因組生物功能分析、設(shè)計(jì)、篩選和克隆33種布魯氏菌關(guān)鍵抗原基因，成功構(gòu)建了人5型復(fù)制缺陷型腺病毒載體，并進(jìn)行表達(dá)相應(yīng)的抗原蛋白；布魯氏菌主要抗原表位，是利用反向疫苗研發(fā)策略，通過計(jì)算機(jī)對(duì)布魯氏菌全基因組數(shù)據(jù)進(jìn)行分析和鑒定保護(hù)性抗原，并進(jìn)行潛在抗原評(píng)分，經(jīng)過不同的優(yōu)化組合，最終獲得33個(gè)高潛力抗原表位，并在4個(gè)腺病毒載體中串聯(lián)表達(dá)，經(jīng)動(dòng)物試驗(yàn)驗(yàn)證其保護(hù)效果和常規(guī)弱毒疫苗a19株相當(dāng)。本發(fā)明不但能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生有效的免疫反應(yīng)，而且克服了弱毒疫苗的散毒、毒力重組和毒力返強(qiáng)以及毒力殘留的問題。具體技術(shù)方案如下。

3、本發(fā)明基于布魯氏菌33種保護(hù)基因的重組腺病毒padv-mcmv-abcd，已于2024年8月27日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為cgmccno.46170，保藏地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國科學(xué)院微生物研究所。

4、所述重組腺病毒包含經(jīng)過全基因組篩選和優(yōu)化的布魯氏菌33種目的基因和線性化腺病毒表達(dá)載體；所述重組腺病毒的構(gòu)建過程如下：

5、過程一，保護(hù)基因篩選：從54個(gè)羊種布魯氏菌、17個(gè)流產(chǎn)布魯氏菌和18個(gè)豬種布魯氏菌共89個(gè)全基因組中，篩選出33種最具有潛在抗原的基因；所述抗原大多數(shù)與細(xì)菌的粘附、侵襲、逃避以及適應(yīng)巨噬細(xì)胞的內(nèi)環(huán)境相關(guān)；

6、過程二，重組腺病毒構(gòu)建，具體包括以下步驟：

7、步驟2.1，基因、表達(dá)系統(tǒng)和細(xì)胞：經(jīng)過篩選的33個(gè)布魯氏菌主要保護(hù)基因，分別進(jìn)行表達(dá)驗(yàn)證后，分為a?sequence、b?sequence、c?sequence、d?sequence四組目的基因,順序串聯(lián)并加入相應(yīng)的酶切位點(diǎn)后，克隆至pmd18-t載體中；優(yōu)化保存人5型復(fù)制缺陷型腺病毒表達(dá)系統(tǒng)和人胚胎腎細(xì)胞hek?293t細(xì)胞；

8、所述a?sequence的核苷酸序列如seq?id?no.1所示，b?sequence的核苷酸序列如seq?id?no.2所示，c?sequence的核苷酸序列如seq?id?no.3所示，dsequence的核苷酸序列如seq?id?no.4所示；

9、步驟2.2，目的基因酶切：提取含有目的基因的pmd18-t載體，用限制性內(nèi)切酶對(duì)含有目的基因的質(zhì)粒進(jìn)行酶切；對(duì)酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)酶切效果，并把目的基因條帶從瓊脂糖凝膠電泳后的膠中割下來，做膠回收，得到目的基因片段；

10、步驟2.3，線性化腺病毒表達(dá)載體：用限制性內(nèi)切酶對(duì)人5型復(fù)制缺陷型腺病毒表達(dá)載體進(jìn)行酶切，對(duì)酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)酶切效果，并把目的載體條帶從瓊脂糖凝膠電泳后的膠中割下來，做膠回收，得到線性化腺病毒表達(dá)載體padv－mcmv；

11、步驟2.4，目的基因構(gòu)建入線性化腺病毒表達(dá)載體：將目的基因片段和線性化腺病毒以摩爾比2：1加到離心管中進(jìn)行重組連接反應(yīng)，得到重組連接產(chǎn)物；

12、步驟2.5，轉(zhuǎn)化與鑒定：將重組連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌dh5α感受態(tài)細(xì)胞，pcr鑒定為陽性轉(zhuǎn)化子，并測(cè)序驗(yàn)證為正確，從而構(gòu)建得重組腺病毒表達(dá)載體padv－mcmv－asequence、padv－mcmv－bsequence、padv－mcmv－c?sequence和padv－mcmv－dsequence；

13、步驟2.6，重組腺病毒包裝及蛋白表達(dá)檢測(cè)：將重組腺病毒表達(dá)載體經(jīng)pme?i酶切得線性化重組腺病毒表達(dá)載體，將線性化重組腺病毒表達(dá)載體轉(zhuǎn)染hek?293t細(xì)胞中，包裝出重組腺病毒padv－mcmv－a、重組腺病毒padv－mcmv－b、重組腺病毒padv－mcmv－c和重組腺病毒padv－mcmv－d。

14、過程三：免疫效果驗(yàn)證

15、步驟3.1，動(dòng)物分組：將150只balb/c小鼠分成5組，分別為商品化疫苗組、腺病毒疫苗組、空腺病毒組、dmem對(duì)照和空白對(duì)照組，每組30只；

16、步驟3.2，免疫接種：商品化疫苗組按照說明書要求接種105cfu/只劑量，0.1ml；腺病毒疫苗組及空腺病毒接種為106pfu/只，0.1ml；dmem對(duì)照接種0.1ml?dmem；第一次免后21天重復(fù)免疫一次，即第二次免疫；

17、步驟3.3，強(qiáng)毒攻擊：第二次免疫后28天，用標(biāo)準(zhǔn)布魯氏菌m28強(qiáng)毒接種小鼠，接種攻毒劑量為1×104cfu/只；

18、步驟3.4，樣品采集與評(píng)價(jià)：接種強(qiáng)毒后每天觀察小鼠臨床表現(xiàn)，分別于第7、15、30、45天檢測(cè)接種的疫苗殘留情況；分別于攻毒后7天、14天和21天剖殺小鼠，無菌分離脾臟稱重，并進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，計(jì)算保護(hù)單位；結(jié)果顯示布魯氏菌重組腺病毒疫苗在動(dòng)物體內(nèi)無殘留，且保護(hù)效果符合oie布魯氏菌疫苗的保護(hù)標(biāo)準(zhǔn)，通過免疫效果驗(yàn)證。

19、本發(fā)明具有有益效果。本發(fā)明建立在對(duì)大量布魯氏菌全基因組分析的基礎(chǔ)上，將布魯氏菌全部的抗原基因篩選出來，通過將反向疫苗學(xué)與泛基因組分析相結(jié)合，鑒定89個(gè)布魯氏菌全基因組中重要的保護(hù)性潛在抗原，客觀的逐一評(píng)價(jià)、打分和驗(yàn)證后重新優(yōu)化排列組合，最終篩選出33個(gè)關(guān)鍵的保護(hù)基因，通過a、b、c、d?4個(gè)組合在人5型復(fù)制缺陷型腺病毒中表達(dá)，從而得到對(duì)應(yīng)的重組腺病毒載體疫苗。經(jīng)按照農(nóng)業(yè)農(nóng)村部布魯氏菌疫苗評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)驗(yàn)證了本發(fā)明的疫苗有效，達(dá)到了世界動(dòng)物衛(wèi)生組織oie制定的布魯氏菌疫苗評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)；按照國家標(biāo)準(zhǔn)的評(píng)價(jià)方法，以商品化的布魯氏菌a19疫苗作為標(biāo)準(zhǔn)，評(píng)價(jià)了本發(fā)明的布魯氏菌重組腺病毒疫苗，結(jié)果證實(shí)本發(fā)明的疫苗不但安全而且有效。

20、本發(fā)明通過采用人5型復(fù)制缺陷型腺病毒作為載體表達(dá)布魯氏菌最重要的33種保護(hù)基因制備疫苗：避免采用傳統(tǒng)強(qiáng)毒株致弱或基因缺失等方法制備疫苗，從而使得本發(fā)明克服布魯氏菌傳統(tǒng)疫苗株和基因缺失疫苗株等弱毒疫苗株散毒、毒力重組、毒力返強(qiáng)、毒力殘留等缺陷；同時(shí)克服現(xiàn)有技術(shù)中利用布魯氏菌一個(gè)或兩個(gè)抗原基因制備的疫苗無法全面中和布魯氏菌毒力基因，以及根據(jù)經(jīng)驗(yàn)挑選的布魯氏菌保護(hù)基因不能反映布魯氏菌保護(hù)基因的本質(zhì)的問題。本發(fā)明成功開發(fā)出的布魯氏菌疫苗，不僅安全而且有效，為布魯氏菌的安全有效控制提供了新的途徑，為我國乃至全球公共衛(wèi)生安全提供有力保障。

21、本發(fā)明涉及的微生物的保藏信息如下：

22、保藏單位：中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心cgmcc；

23、保藏單位地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國科學(xué)院微生物研究所；

24、分類命名：布魯氏菌重組腺病毒padv-mcmv-abcd；

25、保藏編號(hào)：cgmcc?no.46170；

26、保藏日期：2024年08月27日。