本發(fā)明屬于微生物領(lǐng)域，具體涉及一種黑曲霉、菌劑、固態(tài)發(fā)酵液及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、隨著生物產(chǎn)業(yè)的不斷發(fā)展，越來越多的產(chǎn)品通過微生物發(fā)酵方法制備得到。在微生物發(fā)酵過程中的碳源尤其是葡萄糖，是微生物生長和代謝的重要能量來源，而這也意味著在微生物發(fā)酵過程中需要消耗大量的葡萄糖。目前微生物發(fā)酵時所用的葡萄糖主要來源于淀粉質(zhì)水解糖液，這表明隨著生物產(chǎn)業(yè)的不斷發(fā)展，對葡萄糖的需求也將不斷增加，可能會導(dǎo)致淀粉類糧食作物的需求增加，從而可能導(dǎo)致食品價格的上漲或糧食供應(yīng)的緊張。

2、農(nóng)業(yè)廢棄物和林業(yè)廢棄物中的木質(zhì)纖維素是潛在的葡萄糖來源，其中，農(nóng)業(yè)廢棄物包括：甘蔗渣、秸稈、稻草、果實外殼等；林業(yè)廢棄物包括：樹梢、枝干、樹冠、木屑、枯枝等。通過將農(nóng)業(yè)廢棄物和林業(yè)廢棄物中的木質(zhì)纖維素水解為葡萄糖、木糖等，不僅可以減少對淀粉類糧食作物的依賴，還能實現(xiàn)廢棄物的資源化利用，具有環(huán)境友好性和經(jīng)濟可持續(xù)性。因此，木質(zhì)纖維素水解糖液的高效生產(chǎn)是生物產(chǎn)業(yè)領(lǐng)域需要解決的工程問題。

3、經(jīng)過我國在近20年對木質(zhì)纖維素水解過程的關(guān)鍵酶，即纖維素酶和β-葡萄糖苷酶的研究開發(fā)，纖維素酶的酶活力在一定程度上滿足了工業(yè)化需求，但是，目前為止β-葡萄糖苷酶的酶活力還不能滿足工業(yè)化需求，在篩選和培育高產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的菌株方面尚未取得重要突破，目前文獻報道的β-葡萄糖苷酶酶力活均不高，大多在20u/ml以下，特別是纖維二糖酶活力更低。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題是：現(xiàn)有技術(shù)中，通常將玉米芯作為主要碳源誘導(dǎo)菌株生產(chǎn)β-葡萄糖苷酶，并通過半固態(tài)發(fā)酵方式進行培養(yǎng)，但現(xiàn)有技術(shù)的這種方式往往導(dǎo)致生產(chǎn)得到的β-葡萄糖苷酶的酶活力較低，難以滿足工業(yè)化生產(chǎn)的需求。

2、針對上述現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，本發(fā)明提供了一種黑曲霉、菌劑、固態(tài)發(fā)酵液及其制備方法和應(yīng)用。

3、具體來說，本發(fā)明提供了如下技術(shù)方案：

4、第一方面，本發(fā)明提供了一種黑曲霉，所述黑曲霉為黑曲霉（ aspergillus?niger）agm01?，其保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心（cctcc），保藏編號為：cctcc?no：m?2024768。

5、優(yōu)選地，所述黑曲霉agm01的its基因序列如seq?id?no.3所示。

6、優(yōu)選地，所述黑曲霉agm01具有產(chǎn)β-葡糖苷酶的特性。

7、優(yōu)選地，所述黑曲霉agm01的β-葡萄糖苷酶的酶活力為：20-30u，其中，所述的u是指β-葡萄糖苷酶的一個酶活力單位，其中，以每ml黑曲霉agm01的粗酶液中每min酶解纖維二糖所產(chǎn)生1μmol葡萄糖所需酶量定義為β-葡萄糖苷酶的一個酶活力單位；

8、其中，黑曲霉?agm01?的粗酶液通過如下方法制備得到：將黑曲霉進行擴增培養(yǎng)得到黑曲霉孢子懸液，將黑曲霉孢子懸液進行發(fā)酵培養(yǎng)得到發(fā)酵液，接著固液分離得到上清液，即黑曲霉agm01的粗酶液。

9、優(yōu)選地，發(fā)酵培養(yǎng)的時間為5-7天。

10、第二方面，本發(fā)明提供了一種黑曲霉菌劑的發(fā)酵制備方法，所述的發(fā)酵制備方法包括如下步驟：

11、（a）將權(quán)利要求1-5中任一項所述的黑曲霉進行擴增培養(yǎng)，得到黑曲霉孢子懸液；

12、（b）將步驟（a）得到的黑曲霉孢子懸液進行發(fā)酵培養(yǎng)。

13、優(yōu)選地，步驟（a）中，以每ml黑曲霉孢子懸液中含有106-107個權(quán)利要求1-5中任一項所述的黑曲霉的孢子。

14、優(yōu)選地，步驟（a）中的培養(yǎng)溫度為26-30℃；和/或步驟（b）中的培養(yǎng)溫度為26-32℃。

15、優(yōu)選地，步驟（a）中的培養(yǎng)時間為24-48h。

16、第三方面，本發(fā)明提供了一種黑曲霉菌劑，含有權(quán)利要求1-5中任一項所述的黑曲霉。

17、第四方面，本發(fā)明提供了一種黑曲霉菌劑，所述黑曲霉菌劑通過權(quán)利要求6-9中任一項所述的發(fā)酵制備方法制備得到。

18、第五方面，本發(fā)明提供了一種黑曲霉固態(tài)發(fā)酵液，含有權(quán)利要求1-5中任一項所述的黑曲霉，其中，所述黑曲霉固態(tài)發(fā)酵液β-葡萄糖苷酶的酶活力為：110-170u，其中，所述的u是指β-葡萄糖苷酶的一個酶活力單位，其中，以每ml所述黑曲霉固態(tài)發(fā)酵液中每min酶解纖維二糖所產(chǎn)生1μmol葡萄糖所需的酶量定義為β-葡萄糖苷酶的一個酶活力單位。

19、優(yōu)選地，以重量份計，所述種子培養(yǎng)基包括：1-30份葡萄糖、5-20份酵母浸粉、0.1-0.4份硫酸鎂、1-4份磷酸二氫鉀、0.2-2份氯化鈣、0.001-0.01份硫酸鐵、0.001-0.01份硫酸錳、0.001-0.01份硫酸鋅和0.001-0.01份氯化鈷。

20、更優(yōu)選地，所述種子培養(yǎng)基包括：5-20份葡萄糖、和/或5-15份酵母浸粉、和/或0.2-0.35份硫酸鎂、和/或1-2份磷酸二氫鉀、和/或0.5-1.5份氯化鈣、和/或0.001-?0.008份硫酸鐵、和/或0.001-0.008份硫酸錳、和/或0.001-0.008份硫酸鋅、和/或0.001-0.008份氯化鈷。

21、最優(yōu)選地，所述酵母浸粉為酵母浸粉f902。

22、優(yōu)選地，所述種子培養(yǎng)基還包括：水。

23、優(yōu)選地，所述種子培養(yǎng)基包括：葡萄糖的濃度為1-30?g/l、酵母浸粉的濃度為5-20g/l、硫酸鎂的濃度為0.1-0.4?g/l、磷酸二氫鉀的濃度為1-4?g/l、氯化鈣的濃度為0.2-2g/l、硫酸鐵的濃度為1-10mg/l、硫酸錳的濃度為1-10mg/l、硫酸鋅的濃度為1-10mg/l和氯化鈷的濃度為1-10mg/l，其余為水。

24、更優(yōu)選地，所述種子培養(yǎng)基包括：葡萄糖的濃度為5-20g/l、和/或酵母浸粉的濃度為5-15g/l、和/或硫酸鎂的濃度為0.2-0.35g/l、和/或磷酸二氫鉀的濃度為1-2g/l、和/或氯化鈣的濃度為0.5-1.5g/l、和/或硫酸鐵的濃度為1-8mg/l、和/或硫酸錳的濃度為1-8mg/l、和/或硫酸鋅的濃度為1-8mg/l、和/或氯化鈷的濃度為1-8mg/l，其余為水。

25、優(yōu)選地，以重量份計，所述固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基包括1-20份小分子誘導(dǎo)劑，其中，所述小分子誘導(dǎo)劑為木糖、纖維二糖、乳糖、槐糖、龍膽二糖、木糖和含有槐糖苷的物質(zhì)中的一種或一種以上。

26、更優(yōu)選地，所述小分子誘導(dǎo)劑為木糖。

27、更優(yōu)選地，所述含有槐糖苷的物質(zhì)為山奈酚-3-o-β-d-槐糖苷。

28、優(yōu)選地，所述固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基還包括：含有木質(zhì)纖維素的物質(zhì)、硫酸銨、尿素和氯化鈣。

29、優(yōu)選地，以重量份計，所述固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基包括：30-90份含有木質(zhì)纖維素的物質(zhì)、5-25?份硫酸銨、1-15?份尿素、0.5-3份氯化鈣和1-20?份小分子誘導(dǎo)劑。

30、更優(yōu)選地，以重量份計，所述固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基包括：30-75份含有木質(zhì)纖維素的物質(zhì)、和/或6-20?份硫酸銨、和/或2-12份尿素、和/或0.5-2份氯化鈣、和/或1-18?份小分子誘導(dǎo)劑。

31、優(yōu)選地，所述含有木質(zhì)纖維素的物質(zhì)包括：麩皮、秸稈和玉米芯中的一種或一種以上。

32、優(yōu)選地，所述含有木質(zhì)纖維素的物質(zhì)為麩皮、秸稈和玉米芯的組合。

33、優(yōu)選地，以重量份計，所述含有木質(zhì)纖維素的物質(zhì)為10-30份麩皮、10-30份秸稈和10-30份玉米芯。

34、優(yōu)選地，以重量份計，所述含有木質(zhì)纖維素的物質(zhì)為10-25份麩皮、和/或10-25份秸稈、和/或10-25份玉米芯。

35、優(yōu)選地，所述固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基還包括：水。

36、優(yōu)選地，所述固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基包括：含有木質(zhì)纖維素的物質(zhì)的濃度為30-90g/l?、硫酸銨的濃度為5-25?g/l、尿素的濃度為1-15?g/l、氯化鈣的濃度為0.5-3g/l和小分子誘導(dǎo)劑的濃度為1-20g/l，其余為水。

37、優(yōu)選地，所述固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基包括：含有木質(zhì)纖維素的物質(zhì)的濃度為30-75g/l、和/或硫酸銨的濃度為6-20?g/l、和/或尿素的濃度為2-12?g/l、和/或氯化鈣的濃度為0.5-2g/l、和/或小分子誘導(dǎo)劑的濃度為1-18g/l，其余為水。

38、優(yōu)選地，所述固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基還包括：水。

39、優(yōu)選地，所述固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基包括：麩皮的濃度為10-30g/l、秸稈的濃度為10-30g/l、玉米芯的濃度為10-30g/l、硫酸銨的濃度為5-25?g/l、尿素的濃度為1-15?g/l、氯化鈣的濃度為0.5-3g/l和小分子誘導(dǎo)劑的濃度為1-20g/l，其余為水。

40、優(yōu)選地，所述固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基包括：麩皮的濃度為10-25g/l、和/或秸稈的濃度為10-25g/l、和/或玉米芯的濃度為10-25g/l、和/或硫酸銨的濃度為5-25?g/l、和/或尿素的濃度為1-15?g/l、和/或氯化鈣的濃度為0.5-3g/l、和/或小分子誘導(dǎo)劑的濃度為1-20g/l，其余為水。

41、第六方面，本發(fā)明提了一種黑曲霉固態(tài)發(fā)酵液的制備方法，包括如下步驟：將所述的黑曲霉進行擴增培養(yǎng)，得到黑曲霉孢子懸液；將黑曲霉孢子懸液接種至種子培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，得到黑曲霉種子液；和將黑曲霉種子液接種至固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，得到黑曲霉固態(tài)發(fā)酵液。

42、優(yōu)選地，所述的制備方法包括如下步驟：

43、（a）將權(quán)利要求1-5中任一項所述的黑曲霉進行擴增培養(yǎng)，得到黑曲霉孢子懸液；

44、（b）將步驟（a）得到的黑曲霉孢子懸液接種至種子培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，得到黑曲霉種子液；

45、（c）將步驟（b）得到黑曲霉種子液接種至固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，得到黑曲霉固態(tài)發(fā)酵物；

46、（d）將步驟（c）得到的黑曲霉固態(tài)發(fā)酵物與緩沖溶液進行混合、浸泡、攪拌和過濾后得到粗酶液；

47、（e）將步驟（d）得到的粗酶液進行濃縮得到濃縮液，即黑曲霉固態(tài)發(fā)酵液。

48、更優(yōu)選地，步驟（a）中，每ml黑曲霉孢子懸液中含有106-107個權(quán)利要求1-5中任一項所述的黑曲霉的孢子。

49、更優(yōu)選地，步驟（a）中的培養(yǎng)溫度為26-30℃；和/或步驟（b）中的培養(yǎng)溫度為26-30℃；和/或步驟（c）中的培養(yǎng)溫度為27-29℃。

50、更優(yōu)選地，步驟（a）中的培養(yǎng)時間為24-48h；和/或步驟（b）中的培養(yǎng)時間為24-48h；和/或步驟（c）中的培養(yǎng)時間為100-144h。

51、更優(yōu)選地，步驟（b）中的培養(yǎng)轉(zhuǎn)速為150-300rmp。

52、更優(yōu)選地，步驟（c）中的培養(yǎng)ph為4.5-5.5。

53、更優(yōu)選地，步驟（c）中的培養(yǎng)濕度為50-95%。

54、更優(yōu)選地，步驟（d）中，黑曲霉固態(tài)發(fā)酵物與緩沖溶液的混合的體積比為（0.8-1.2）:（6-10）。

55、更優(yōu)選地，步驟（d）中的浸泡時間為1-4h。

56、更優(yōu)選地，步驟（d）中的攪拌速度為：100-300rpm。

57、更優(yōu)選地，步驟（d）中的攪拌時間為：20-50min。

58、更優(yōu)選地，步驟（d）中的過濾為板框過濾。

59、更優(yōu)選地，步驟（e）中，所述濃縮為超濾濃縮。

60、最優(yōu)選地，超濾濃縮的膜為孔徑為10-60kd。

61、最優(yōu)選地，超濾濃縮時間為1-5h。

62、第七方面，本發(fā)明提了一種所述的制備方法制備得到的黑曲霉固態(tài)發(fā)酵液。

63、第八方面，本發(fā)明提了一種木質(zhì)纖維素水解糖液，通過在含有所述的黑曲霉、或所述的黑曲霉菌劑、或所述的黑曲霉固態(tài)發(fā)酵液的體系中進行水解得到。

64、優(yōu)選地，木質(zhì)纖維素為農(nóng)業(yè)廢棄物和林業(yè)廢棄物中的一種或兩種組合。

65、更優(yōu)選地，農(nóng)業(yè)廢棄物為甘蔗渣和秸稈中的一種或兩種組合。

66、優(yōu)選地，該木質(zhì)纖維素水解糖液所含的還原糖質(zhì)量比例為90%以上，其中，所述還原糖質(zhì)量比例是指相對于水解前木質(zhì)纖維素原料中所含的纖維素和半纖維素質(zhì)量總量m1，木質(zhì)纖維素原料經(jīng)過酶解水解轉(zhuǎn)化為還原糖的質(zhì)量m2所占的百分比例。

67、優(yōu)選地，所述的黑曲霉、或所述的黑曲霉菌劑、或所述的黑曲霉固態(tài)發(fā)酵液在制備木質(zhì)纖維素水解糖液中的應(yīng)用。