本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及4-1bb結(jié)合蛋白，例如結(jié)合4-1bb的單域抗體、重鏈抗體和/或融合蛋白及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、4-1bb，也被稱為cd137，屬于腫瘤壞死因子受體超家族，在t細胞激活驅(qū)動免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要功能，主要促進t細胞增殖，獲得效應(yīng)功能，促進免疫記憶，同時抑制激活誘導(dǎo)的細胞死亡。最早進入臨床的靶向4-1bb的激動性抗體包括百時美施貴寶公司(bms)的urelumab(烏瑞蘆單抗)和pfizer的utomilumab(烏托魯單抗)，作為單藥或聯(lián)合療法在小鼠腫瘤模型中展現(xiàn)出潛力，但是在臨床上由于毒性或缺乏療效(chester?c,sanmamed?mf,wang?j,melero?i.immunotherapy?targeting?4-1bb:mechanistic?rationale,clinicalresults,and?future?strategies.blood.2018；131(1):49-57.)，因此安全有效的靶向4-1bb的新型療法存在很大的臨床需求。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明提供4-1bb結(jié)合蛋白，可以特異性結(jié)合4-1bb，不阻斷4-1bb和4-1bbl(4-1bb配體)的結(jié)合，在交聯(lián)的條件下能有效激活nf-κb信號，有效激活t細胞。

2、一方面，本發(fā)明提供4-1bb結(jié)合蛋白，其包含重鏈可變區(qū)，所述重鏈可變區(qū)包含以下互補決定區(qū)(cdr)中的一個或多個：如seq?id?no:7所示的hcdr1，如seq?id?no:8-13或seq?id?no:31-36任一項所示的hcdr2，如seq?id?no:14-19或seq?id?no:37-42任一項所示的hcdr3。

3、在一些實施方案中，所述重鏈可變區(qū)包含如seq?id?no:7所示的hcdr1，如seq?idno:8-13所示的hcdr2，如seq?id?no:14-19任一項所示的hcdr3。

4、在一些實施方案中，所述重鏈可變區(qū)包含如seq?id?no:7所示的hcdr1，如seq?idno:8所示的hcdr2，如seq?id?no:14-17任一項所示的hcdr3。

5、在一些實施方案中，所述重鏈可變區(qū)包含如seq?id?no:7所示的hcdr1，如seq?idno:9所示的hcdr2，如seq?id?no:14或19所示的hcdr3。

6、在一些實施方案中，所述重鏈可變區(qū)包含如seq?id?no:7所示的hcdr1，如seq?idno:10所示的hcdr2，如seq?id?no:14或16所示的hcdr3。

7、在一些實施方案中，所述重鏈可變區(qū)包含如seq?id?no:7所示的hcdr1，如seq?idno:11或12所示的hcdr2，如seq?id?no:16所示的hcdr3。

8、在一些實施方案中，所述重鏈可變區(qū)包含如seq?id?no:7所示的hcdr1，如seq?idno:13所示的hcdr2，如seq?id?no:18或19所示的hcdr3。

9、在一些實施方案中，所述重鏈可變區(qū)包含如seq?id?no:7所示的hcdr1，如seq?idno:31-36所示的hcdr2，如seq?id?no:37-42任一項所示的hcdr3。

10、在一些實施方案中，所述重鏈可變區(qū)包含如seq?id?no:7所示的hcdr1，如seq?idno:31所示的hcdr2，如seq?id?no:37-40任一項所示的hcdr3。

11、在一些實施方案中，所述重鏈可變區(qū)包含如seq?id?no:7所示的hcdr1，如seq?idno:32所示的hcdr2，如seq?id?no:37或42所示的hcdr3。

12、在一些實施方案中，所述重鏈可變區(qū)包含如seq?id?no:7所示的hcdr1，如seq?idno:33所示的hcdr2，如seq?id?no:37或39所示的hcdr3。

13、在一些實施方案中，所述重鏈可變區(qū)包含如seq?id?no:7所示的hcdr1，如seq?idno:34或35所示的hcdr2，如seq?id?no:39所示的hcdr3。

14、在一些實施方案中，所述重鏈可變區(qū)包含如seq?id?no:7所示的hcdr1，如seq?idno:36所示的hcdr2，如seq?id?no:41或42所示的hcdr3。

15、在一些實施方案中，所述重鏈可變區(qū)包含如seq?id?no:1-6、29-30任一項所示的氨基酸序列，或與seq?id?no:1-6、29-30任一項所示的氨基酸序列相比具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，或與seq?id?no:1-6、29-30任一項所示的氨基酸序列相比具有一個或多個保守氨基酸取代的氨基酸序列。

16、在一些實施方案中，所述重鏈可變區(qū)包含如seq?id?no:1-6、29-30任一項所示的氨基酸序列。

17、在一些實施方案中，所述4-1bb結(jié)合蛋白為抗體或抗原結(jié)合片段。在一些實施方案中，所述4-1bb結(jié)合蛋白為單域抗體(如納米抗體)、重鏈抗體、雙特異抗體、多特異抗體、fab、fab'、f(ab')2、fv、scfv的形式。

18、在一些實施方案中，所述4-1bb結(jié)合蛋白為融合蛋白，還包含fc區(qū)。在一些實施方案中，所述fc為免疫球蛋白的fc。在一些實施方案中，所述fc為igg的fc。在一些實施方案中，所述fc為igg1、igg2、igg3或igg4的fc或其變體。在一些實施方案中，所述igg1的fc的氨基酸序列如seq?id?no:21所示。

19、在一些實施方案中，所述fc為變體fc區(qū)。在一些實施方案中，相對于親本fc區(qū)，變體fc區(qū)具有一個或多個氨基酸修飾，如取代、缺失或插入。在一些實施方案中，相對于親本fc區(qū)活性，fc區(qū)的氨基酸修飾改變了效應(yīng)功能活性。在一些實施方案中，變體fc區(qū)可以具有改變的(即，增加的或降低的)抗體依賴性細胞毒性(adcc)、補體介導(dǎo)的細胞毒性(cdc)、吞噬作用、調(diào)理作用或細胞結(jié)合活性。在一些實施方案中，相對于親本fc區(qū)，fc區(qū)的氨基酸修飾可以改變對fcγr(fcγ受體)的親和力。在一些實施方案中，所述fc區(qū)來源于igg1或igg4。在一些實施方案中，所述fc突變包含n297a、l234a/f234a、l235a、l235e和g237a突變(eu編號)中的一個或多個。在一些實施方案中，fc區(qū)突變是e345r或s440y(eu編號)。在一些實施方案中，所述igg1?fc包含n297a突變(eu編號)。

20、在一些實施方案中，所述融合蛋白的重鏈可變區(qū)的c端與fc區(qū)的n端之間還連接有肽接頭。在一些實施方案中，所述肽接頭的序列為(gms)n，其中每個m獨立為2、3、4或5，n獨立為1、2、3、4、5或6。在一些實施方案中，所述接頭的序列為(ggggs)n，所述n獨立為1、2、3、4、5或6。在一些實施方案中，所述肽接頭1的氨基酸序列如seq?id?no:8所示。

21、在一些實施方案中，所述融合蛋白包含如seq?id?no:22-27任一項所示的氨基酸序列，或與seq?id?no:22-27任一項所示的氨基酸序列相比具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，或與seq?id?no:22-27任一項所示的氨基酸序列相比具有一個或多個保守氨基酸取代的氨基酸序列。

22、在一些實施方案中，所述融合蛋白包含如seq?id?no:22-27任一項所示的氨基酸序列。

23、在一些實施方案中，所述融合蛋白包含兩條相同的氨基酸序列。

24、表1:cdr氨基酸序列

25、

26、表2:氨基酸序列

27、

28、

29、

30、在一方面，本發(fā)明提供一種生物材料，為：

31、1)核酸分子，編碼本發(fā)明的4-1bb結(jié)合蛋白或其一部分；

32、2)表達載體，包含本發(fā)明的核酸分子；

33、3)宿主細胞，包含本發(fā)明的核酸分子或表達載體。

34、在一方面，本發(fā)明提供一種藥物組合物，包含本發(fā)明的4-1bb結(jié)合蛋白和藥學(xué)上可接受的載體。

35、在一方面，本發(fā)明提供上述4-1bb結(jié)合蛋白、生物材料或藥物組合物在制備治療或預(yù)防疾病的藥物中的應(yīng)用。

36、在一方面，本發(fā)明提供上述4-1bb結(jié)合蛋白、生物材料或藥物組合物在治療或預(yù)防疾病中的應(yīng)用。在一方面，本發(fā)明提供治療或預(yù)防疾病的方法，包括向有需要的患者施用有效劑量的上述4-1bb結(jié)合蛋白、生物材料或藥物組合物。在一些實施方案中，所述疾病為腫瘤、病毒性感染、自身免疫性疾病或炎癥性疾病。在一些實施方案中，所述腫瘤包括黑色素瘤、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、頭頸癌、肝癌、結(jié)腸癌、前列腺癌、胃癌、腎癌、膀胱癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、子宮內(nèi)膜癌、食道癌、軟組織肉瘤、膽管癌、甲狀腺癌、肝細胞癌、間皮瘤等。