本發(fā)明屬于基因檢測，具體涉及一種原發(fā)性肝癌的分子標(biāo)記物核酸組合、試劑盒及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、肝癌的發(fā)病率和死亡率在癌癥中居前列，全球每年新診斷病例超過90萬，死亡人數(shù)超過80萬。肝細(xì)胞癌(hcc)是最常見的一種原發(fā)性肝癌，90％的肝癌病例是肝細(xì)胞癌，通常發(fā)生于慢性肝病患者，比如由乙肝或丙肝病毒感染引起的肝硬化。全世界有3.5億人患有慢性病毒性肝炎感染，5000萬人患有肝硬化，這些人群的肝癌風(fēng)險(xiǎn)增加。病人的存活率在很大程度上取決于診斷時的疾病分期。

2、晚期肝癌的五年存活率低于5％。據(jù)《原發(fā)性肝癌的分層篩查與監(jiān)測指南(2020)》，0期或a期肝癌患者5年總生存率可高達(dá)69.0％-86.2％。對肝癌風(fēng)險(xiǎn)患者進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)分層并采用不同的監(jiān)測手段有助于更早發(fā)現(xiàn)癌癥。目前對高風(fēng)險(xiǎn)人群的檢測手段為帶或不帶甲胎蛋白(afp)的腹部超聲成像。大約一半晚期hcc患者具有高水平的afp，這是一種在胎兒早期發(fā)育中產(chǎn)生的糖蛋白，也產(chǎn)自肝臟以及各種腫瘤(包括hcc)。但是與晚期疾病相比，這些檢測對早期疾病的篩查靈敏度從47％-84％不等，特異性從67％-90％以上不等。因此，非常需要開發(fā)可用且靈敏的非侵入性hcc篩查方法。

3、近幾年，基于pcr、ngs等分子診斷技術(shù)，以非固態(tài)生物組織為標(biāo)本進(jìn)行取樣的液體活檢技術(shù)發(fā)展迅速，在癌癥早篩領(lǐng)域應(yīng)用前景廣闊，也是國內(nèi)外基因檢測科研機(jī)構(gòu)和廠商布局的熱點(diǎn)。甲基化是基因表達(dá)的一種調(diào)控方式。在腫瘤細(xì)胞中，往往會出現(xiàn)與腫瘤快速生長相關(guān)基因的去甲基化，以及抑癌基因的甲基化。甲基化的變化往往出現(xiàn)在癌癥的早期，因此能在極早期找到癌癥的蛛絲馬跡?，F(xiàn)有技術(shù)表明血液中的循環(huán)腫瘤dna(ctdna)與腫瘤組織中的dna有很強(qiáng)的一致性。據(jù)《中國肝癌早篩策略專家共識(2021)》，以cfdna甲基化信息為主要標(biāo)志物的液體活檢展現(xiàn)出較好的早篩性能。

4、目前已報(bào)道的肝細(xì)胞癌血液標(biāo)記物很少，且靈敏性和準(zhǔn)確性不高。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的在于提供一種原發(fā)性肝癌的分子標(biāo)記物核酸組合，發(fā)明人通過檢測chr6:26250425-26250945區(qū)域(hg38人類參考基因組)序列中的cpg位點(diǎn)的甲基化水平，可以鑒別目標(biāo)樣本是否為原發(fā)性肝癌。目標(biāo)樣本為原發(fā)性肝癌時，上述區(qū)域的cpg位點(diǎn)為高甲基化水平；目標(biāo)樣本為健康人樣本或良性肝病樣本時，上述區(qū)域的cpg位點(diǎn)為低甲基化水平。上述區(qū)域的cpg位點(diǎn)的甲基化對于原發(fā)性肝癌的檢測或診斷具有較好的靈敏度和特異性，可以用于區(qū)分肝癌樣本、健康樣本和肝良性疾病樣本。

2、本發(fā)明為肝癌早篩提供了良好的分子標(biāo)志物，能夠顯著提高血液樣本早期肝癌的檢出率，并鑒于液體活檢的無創(chuàng)性，適于大規(guī)模推廣應(yīng)用，從而降低肝細(xì)胞癌發(fā)病率與死亡率。

3、本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：

4、一種原發(fā)性肝癌的分子標(biāo)記物核酸組合,所述分子標(biāo)記物核酸組合為位于chr6:26250425-26250945區(qū)域序列中的cpg位點(diǎn)的核酸分子的組合；

5、所述區(qū)域來自于hg38人類參考基因組。

6、作為優(yōu)選地，所述分子標(biāo)記物核酸組合為位于如下5個區(qū)域中至少一個區(qū)域內(nèi)至少包含一個cpg位點(diǎn)的核酸分子：區(qū)域1、區(qū)域2、區(qū)域3、區(qū)域4和區(qū)域5；

7、所述區(qū)域1為chr6:26250435-26250563；區(qū)域2為chr6:26250469-26250577；區(qū)域3為chr6:26250563-26250692；區(qū)域4為chr6:26250594-26250753；區(qū)域5為chr6:26250696-26250942。

8、作為優(yōu)選地，所述核酸組合為用于檢測所述區(qū)域1的核酸組合1、用于檢測所述區(qū)域2的核酸組合2、用于檢測所述區(qū)域3的核酸組合3、用于檢測所述區(qū)域4的核酸組合4和用于檢測所述區(qū)域5的核酸組合5中的任意一種或多種的組合；

9、所述核酸組合1包括引物組合1，所述核酸組合2包括引物組合2，所述核酸組合3包括引物組合3，所述核酸組合4包括引物組合4，所述核酸組合5包括引物組合5。

10、作為優(yōu)選地，所述引物組合1的堿基序列與seq?id?no.1-2所示的堿基序列具有至少90％的一致性；

11、所述引物組合2的堿基序列與seq?id?no.4-5所示的堿基序列具有至少90％的一致性；

12、所述引物組合3的堿基序列與seq?id?no.7-8所示的堿基序列具有至少90％的一致性；

13、所述引物組合4的堿基序列與seq?id?no.10-11所示的堿基序列具有至少90％的一致性；

14、所述引物組合5的堿基序列與seq?id?no.13-14所示的堿基序列具有至少90％的一致性。

15、作為優(yōu)選地，所述核酸組合1還包括探針1，所述核酸組合2還包括探針2，所述核酸組合3還包括探針3，所述核酸組合4還包括探針4，所述核酸組合5還包括探針5；

16、所述探針1的堿基序列與seq?id?no.3所示的堿基序列具有至少90％的一致性；

17、所述探針2的堿基序列與seq?id?no.6所示的堿基序列具有至少90％的一致性；

18、所述探針3的堿基序列與seq?id?no.9所示的堿基序列具有至少90％的一致性；

19、所述探針4的堿基序列與seq?id?no.12所示的堿基序列具有至少90％的一致性；

20、所述探針5的堿基序列與seq?id?no.15所示的堿基序列具有至少90％的一致性。

21、一種原發(fā)性肝癌的分子標(biāo)記物核酸組合在制備檢測產(chǎn)品中的應(yīng)用，包含所述的核酸組合。

22、作為優(yōu)選地，所述檢測產(chǎn)品包括試劑、試劑盒、芯片和測序文庫中的任意一種。

23、試劑可以是凍干粉狀、溶液、懸浮液、乳液等產(chǎn)品形態(tài)。

24、作為優(yōu)選地，通過如下至少一種的方法進(jìn)行所述檢測：甲基化特異性pcr法、測序法、甲基化特異性高效液相層析法、數(shù)字pcr法、甲基化特異性高分辨率溶解曲線法、甲基化特異性微陣列法、甲基化敏感性限制性內(nèi)切酶法和flap?endonuclease法。

25、一種原發(fā)性肝細(xì)胞癌檢測試劑盒，包括所述的核酸組合、陽性對照、陰性對照、內(nèi)參基因的檢測引物、內(nèi)參基因的檢測探針、dna聚合酶和緩沖液。

26、所述試劑盒的檢測樣本為離體血液樣本或離體組織樣本和離體白細(xì)胞樣本。

27、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明至少具有如下技術(shù)效果：

28、(一)本發(fā)明提供了一種原發(fā)性肝癌的分子標(biāo)記物核酸組合，發(fā)明人通過檢測chr6:26250425-26250945區(qū)域(hg38人類參考基因組)序列中的cpg位點(diǎn)的甲基化水平，可以鑒別目標(biāo)樣本是否為原發(fā)性肝癌。

29、目標(biāo)樣本為原發(fā)性肝癌時，上述區(qū)域的cpg位點(diǎn)為高甲基化水平；目標(biāo)樣本為健康人樣本或良性肝病樣本時，上述區(qū)域的cpg位點(diǎn)為低甲基化水平。

30、(二)上述區(qū)域的cpg位點(diǎn)的甲基化對于原發(fā)性肝癌的檢測或診斷具有較好的靈敏度和特異性，可以用于區(qū)分肝癌樣本、健康樣本和肝良性疾病樣本。

31、(三)本發(fā)明為肝癌早篩提供了良好的分子標(biāo)志物，能夠顯著提高血液樣本早期肝癌的檢出率，并鑒于液體活檢的無創(chuàng)性，適于大規(guī)模推廣應(yīng)用，從而降低肝細(xì)胞癌發(fā)病率與死亡率。