本發(fā)明涉及一種與sars-cov-2受體結(jié)構(gòu)域結(jié)合的小肽的構(gòu)建方法及應(yīng)用，屬于生物工程。

背景技術(shù)：

1、sars-cov-2是一種屬于冠狀病毒科的病毒，它是引起covid-19的病原體。sars-cov-2是一種有包膜的病毒，其基因組為正鏈rna。它的基因組長(zhǎng)度約為30,000個(gè)核苷酸，編碼了多個(gè)蛋白質(zhì)，包括刺突蛋白(s蛋白)、包膜蛋白(e蛋白)、核膜蛋白(m蛋白)和核酸蛋白(n蛋白)等。sars-cov-2主要通過(guò)飛沫傳播，在一個(gè)感染者咳嗽、打噴嚏或說(shuō)話時(shí)，病毒可以通過(guò)呼吸道分泌物進(jìn)入另一個(gè)人的鼻腔、口腔或眼睛。此外，病毒也可以通過(guò)接觸受污染的表面，然后再觸摸口、鼻或眼而傳播。sars-cov-2最初被認(rèn)為是從野生動(dòng)物傳播給人類的，但確切的宿主仍未確定。研究表明，蝙蝠可能是這種病毒的天然宿主，但中間宿主仍在調(diào)查中。像其他rna病毒一樣，sars-cov-2也具有變異的能力。隨著時(shí)間的推移，病毒可能會(huì)出現(xiàn)一些變異株，其中一些變異株可能具有不同的傳播性、嚴(yán)重性或免疫逃逸能力。這就強(qiáng)調(diào)了監(jiān)測(cè)病毒變異和持續(xù)研究的重要性。針對(duì)sars-cov-2的疫苗已經(jīng)開(kāi)發(fā)并推出使用。疫苗的目標(biāo)是激活人體免疫系統(tǒng)，使其產(chǎn)生對(duì)病毒的免疫反應(yīng)。此外，科學(xué)家也在研究和開(kāi)發(fā)抗病毒藥物和其他治療方法，以減輕covid-19的癥狀和嚴(yán)重性?？傮w而言，sars-cov-2是一種導(dǎo)致covid-19的冠狀病毒，它對(duì)全球健康和社會(huì)產(chǎn)生了重大影響。研究和理解這種病毒的特性對(duì)于控制和預(yù)防covid-19的傳播至關(guān)重要。

2、sars-cov-2受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域(receptor?binding?domain，rbd)是病毒刺突蛋白(s蛋白)上的一個(gè)重要區(qū)域，它與宿主細(xì)胞上的受體結(jié)合，介導(dǎo)病毒進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。sars-cov-2的刺突蛋白是病毒的表面蛋白，它存在于病毒外殼上，形成了病毒的冠狀形狀，因此得名。刺突蛋白由兩個(gè)亞單位(s1和s2)組成，其中s1亞單位包含了rbd。rbd位于s1亞單位的n末端，它是與宿主細(xì)胞上的受體相互作用的關(guān)鍵部位。對(duì)于sars-cov-2，rbd主要與宿主細(xì)胞上的ace2(血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2)受體結(jié)合，形成病毒與細(xì)胞之間的結(jié)合橋梁。這種結(jié)合使得病毒能夠進(jìn)入宿主細(xì)胞，感染并復(fù)制自身。rbd的結(jié)構(gòu)具有高度的靈活性和特異性。它通過(guò)與ace2受體的相互作用來(lái)實(shí)現(xiàn)病毒與宿主細(xì)胞之間的結(jié)合，這一過(guò)程是covid-19發(fā)病機(jī)制的關(guān)鍵步驟。研究rbd的結(jié)構(gòu)和功能可以幫助科學(xué)家了解病毒如何進(jìn)入宿主細(xì)胞，從而為抗病毒藥物的設(shè)計(jì)和疫苗開(kāi)發(fā)提供重要線索。研究人員利用x射線晶體學(xué)和電子顯微鏡等技術(shù)，成功解析了sars-cov-2刺突蛋白和rbd的高分辨率結(jié)構(gòu)，這為理解病毒的侵染機(jī)制和開(kāi)發(fā)針對(duì)rbd的疫苗和治療藥物提供了基礎(chǔ)。rbd作為sars-cov-2病毒與宿主細(xì)胞之間的關(guān)鍵連接點(diǎn)，在研究和應(yīng)對(duì)covid-19的過(guò)程中具有重要意義。

3、sars-cov-2受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域(rbd)與宿主細(xì)胞上的ace2受體結(jié)合是病毒進(jìn)入細(xì)胞的關(guān)鍵步驟。由于rbd與ace2之間的相互作用對(duì)病毒入侵的重要性，構(gòu)建出能夠與rbd結(jié)合的小肽(peptides)，來(lái)干擾病毒與宿主細(xì)胞的結(jié)合，從而阻止病毒進(jìn)入細(xì)胞是值得研究的問(wèn)題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題，在于提供一種與sars-cov-2受體結(jié)構(gòu)域結(jié)合的小肽的構(gòu)建方法及應(yīng)用，該小肽具有高親和力和特異性，可以與rbd結(jié)合并阻斷病毒進(jìn)入細(xì)胞。

2、本發(fā)明通過(guò)下述方案實(shí)現(xiàn)：一種與sars-cov-2受體結(jié)構(gòu)域結(jié)合的小肽，其序列為：wgpmlwrafdramsaglggw。

3、一種與sars-cov-2受體結(jié)構(gòu)域結(jié)合的小肽法，其序列為以下19條中的一種：

4、peptide1?ppstrvpvttfvgtelgsta

5、peptide2?wgpmlwrafdramsaglggw

6、peptide4?vramrlmqwllcvlstaars

7、peptide5?lplssevgastgtyrlrlll

8、peptide7?srfasttfsprlvgvaaacq

9、peptide9?igraaplslllfwaltkepk

10、peptide13?laptatlassvaihlwkgli

11、peptide15?pwsfffcvsgrlcrlrvcga

12、peptide16?lrtlscrllvalmqfasaec

13、peptide17?cpfarrpwfpmslrlvlvcf

14、peptide18?psssmfrteltaggsl

15、peptide19?lvqlmwpaircsrgfsgayv

16、peptide21?lvqlmwpaircsrgfrvrtf

17、peptide22?llffvlplrlprevtrvspa

18、peptide23?srfplslyvtlhtatlgrmr

19、peptide26?yttlprrlprgrpapprsig

20、peptide28?ggqdlsltsvsllarfllpw

21、peptide29?tsgcprswpvgwstlaftgl?peptide32?wqsrclpgalhlvlflsvak。

22、一種與sars-cov-2受體結(jié)構(gòu)域結(jié)合的小肽的構(gòu)建方法，包括以下步驟：

23、步驟一、sars-cov-2病毒spike蛋白rbd?domain序列的設(shè)計(jì)；

24、步驟二、sars-cov-2病毒spike蛋白rbd?domain克?。?/p>

25、步驟三、酵母雙雜交bait株系的構(gòu)建；

26、步驟四、酵母雙雜交篩選；

27、步驟五、目標(biāo)片段序列的解析。

28、所述步驟一包括以下過(guò)程：選取spike序列、去掉跨膜結(jié)構(gòu)的序列、密碼子優(yōu)化后的dna序列、加酶切位點(diǎn)、送合成序列。

29、所述步驟二包括以下過(guò)程：合成序列、片段擴(kuò)增、酶切回收、連接反應(yīng)、大腸桿菌轉(zhuǎn)化、質(zhì)粒提取。

30、所述片段擴(kuò)增采用的擴(kuò)增引物：

31、primer1為gaggccgaattcagagtccaaccaactgagagt，

32、primer2為gtcgacggatcctagaaatttacacacttgttc。

33、所述步驟三包括ah109感受態(tài)制備和bait質(zhì)粒的ah109轉(zhuǎn)化。

34、所述步驟四包括自激活檢測(cè)、文庫(kù)篩選。

35、所述步驟五包括目標(biāo)片段的pcr擴(kuò)增、目標(biāo)片段的pcr產(chǎn)物測(cè)序、spike-rbd結(jié)合肽保守序列，所述目標(biāo)片段的pcr擴(kuò)增用pgadt7載體的通用引物擴(kuò)增所有陽(yáng)性克隆菌株中靶標(biāo)質(zhì)粒的插入片段，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳篩選出符合文庫(kù)基因長(zhǎng)度的擴(kuò)增產(chǎn)物分別等量混勻使用磁珠回收方法回收pcr產(chǎn)物中的所有基因片段，所述目標(biāo)片段的pcr產(chǎn)物測(cè)序是將最終獲得的36個(gè)陽(yáng)性克隆用ad-rev和ad-fwd引物擴(kuò)增后，得到35個(gè)pcr片段，然后通過(guò)sanger測(cè)序獲得34個(gè)隨機(jī)肽庫(kù)序列。

36、一種與sars-cov-2受體結(jié)構(gòu)域結(jié)合的小肽的應(yīng)用，在阻斷病毒與宿主細(xì)胞之間的結(jié)合，抑制病毒進(jìn)入細(xì)胞中的應(yīng)用。

37、本發(fā)明的有益效果為：

38、1、本發(fā)明具有高度多樣性：隨機(jī)多肽酵母文庫(kù)包含大量不同的隨機(jī)多肽序列，可以覆蓋廣泛的結(jié)構(gòu)和功能空間；可以篩選出多樣性較高的結(jié)合蛋白，發(fā)現(xiàn)具有高親和力和高特異性的候選蛋白；

39、2、本發(fā)明具有高靈敏度：由于酵母表達(dá)系統(tǒng)的高效性和可調(diào)控性，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)低濃度目標(biāo)蛋白(如sars-cov-2rbd)的靈敏篩選；這使得能夠檢測(cè)到結(jié)合親和力較低但仍具有潛在療效的候選蛋白；

40、3、本發(fā)明具有高通量：酵母表達(dá)系統(tǒng)可以進(jìn)行高通量的篩選，可以同時(shí)處理大量的酵母克隆，可以在相對(duì)較短的時(shí)間內(nèi)篩選出大量的結(jié)合蛋白，提高發(fā)現(xiàn)潛在藥物候選物的效率；

41、4、本發(fā)明具有可溶性表達(dá)：酵母表達(dá)系統(tǒng)能夠?qū)⒑蜻x蛋白以溶解態(tài)表達(dá)，這對(duì)于后續(xù)的結(jié)構(gòu)和功能研究非常重要，可溶性表達(dá)的蛋白易于純化和進(jìn)一步的表征，有助于確定其在與sars-cov-2rbd相互作用中的作用機(jī)制；

42、5、本發(fā)明具有可改造性：通過(guò)引入其他酵母表達(dá)系統(tǒng)的遺傳工程技術(shù)，如dna重組或互換，可以對(duì)篩選出的結(jié)合蛋白進(jìn)行改造和優(yōu)化，這使得可以通過(guò)進(jìn)一步的工程來(lái)提高其親和力、特異性和穩(wěn)定性等性能，增強(qiáng)其作為疫苗或藥物的潛力；

43、6、本發(fā)明能夠應(yīng)用于抗病毒藥物研發(fā)：rbd結(jié)合小肽可以作為抗病毒藥物的候選物，用于阻斷病毒與宿主細(xì)胞之間的結(jié)合，從而抑制病毒進(jìn)入細(xì)胞，這些小肽可以通過(guò)與rbd相互作用，競(jìng)爭(zhēng)ace2與rbd的結(jié)合位點(diǎn)，從而阻斷病毒的侵入；

44、7、本發(fā)明能夠應(yīng)用于疫苗輔助劑：rbd結(jié)合小肽可以作為疫苗的輔助劑，用于增強(qiáng)疫苗的免疫原性和保護(hù)效果，這些小肽可以與疫苗中的病毒蛋白結(jié)合，激活免疫系統(tǒng)產(chǎn)生針對(duì)rbd的抗體和細(xì)胞免疫應(yīng)答，通過(guò)引入rbd結(jié)合小肽，疫苗可以更好地模擬病毒與宿主細(xì)胞的相互作用，提高免疫響應(yīng)的效力和持久性；

45、8、本發(fā)明能夠應(yīng)用于診斷工具：rbd結(jié)合小肽可以用于病毒的診斷和檢測(cè)，這些小肽可以與rbd結(jié)合并形成特異性復(fù)合物，在病毒檢測(cè)中作為識(shí)別和檢測(cè)的工具，這種方法可以用于快速、敏感和特異性地檢測(cè)sars-cov-2感染，并有助于病毒的追蹤和監(jiān)測(cè)。