本發(fā)明屬于生物，具體涉及一種用于提高核糖體展示效率的核酸構(gòu)建物，以及含有該核酸構(gòu)建物的質(zhì)粒、基因工程細(xì)胞，和利用該核酸構(gòu)建物進(jìn)行核糖體展示的方法等。

背景技術(shù)：

1、功能性蛋白作為能夠識(shí)別和特異性結(jié)合其他分子的活性蛋白，在疾病治療尤其是一些免疫疾病、癌癥等重大疾病的治療中，起著非常重要的作用，在醫(yī)藥領(lǐng)域中越來(lái)越多的引起人們的關(guān)注。目前常見的功能性蛋白有抗體、多肽、酶等，抗體類藥物靶向性好，治療效果顯著，副作用小，需求越來(lái)越大。因而抗體藥物制備中的關(guān)鍵技術(shù)之一--抗體篩選技術(shù)也顯得越發(fā)重要。目前較常應(yīng)用的抗體篩選技術(shù)的有雜交瘤技術(shù)、抗體文庫(kù)篩選技術(shù)、納米抗體技術(shù)和轉(zhuǎn)基因小鼠抗體篩選技術(shù)等。其中抗體文庫(kù)篩選又分為噬菌體展示篩選技術(shù)、酵母表面展示技術(shù)、核糖體展示技術(shù)和mrna展示篩選技術(shù)等。

2、核糖體展示技術(shù)(ribosome?display?technology,rdt)是一種利用功能性蛋白相互作用進(jìn)行篩選的新技術(shù)，它將正確折疊的蛋白及其mrna同時(shí)結(jié)合在核糖體上，形成“mrna-核糖體-蛋白質(zhì)”三元復(fù)合物，使目的蛋白的基因型和表型聯(lián)系起來(lái)，之后通過(guò)特定的方法篩選出目標(biāo)功能的蛋白，由于三元復(fù)合物結(jié)合在一起的，從而可直接獲得目標(biāo)蛋白對(duì)應(yīng)的核苷酸序列，之后再通過(guò)rt-pct(rt-pcr)技術(shù)獲得cdna。經(jīng)過(guò)多輪富集后能夠獲得高親和性的抗體以及其對(duì)應(yīng)的基因。

3、核糖體展示技術(shù)的主要步驟有：待篩選基因文庫(kù)的構(gòu)建、轉(zhuǎn)錄和翻譯、親和篩選分離、逆轉(zhuǎn)錄獲得cdna等。其中轉(zhuǎn)錄翻譯可以在體內(nèi)進(jìn)行，也可以采用體外合成系統(tǒng)進(jìn)行。體外翻譯體系(又稱體外無(wú)細(xì)胞蛋白合成體系，簡(jiǎn)稱為d2p技術(shù))具有文庫(kù)容量大、篩選周期短、操作簡(jiǎn)單、生產(chǎn)效率高等優(yōu)點(diǎn)，目前常用的體外轉(zhuǎn)錄翻譯系統(tǒng)有大腸桿菌、兔網(wǎng)織紅細(xì)胞、麥胚、昆蟲、人源系統(tǒng)等.其中大腸桿菌裂解液是一種比較完善的原核cfps系統(tǒng)，可以實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)的高通量表達(dá)，但在功能性蛋白質(zhì)的翻譯后修飾方面有一定的局限性。但真核系統(tǒng)中，兔網(wǎng)織紅細(xì)胞裂解液體系需要額外補(bǔ)充微球菌核酸酶才能實(shí)現(xiàn)功能性蛋白質(zhì)的表達(dá)；麥胚系統(tǒng)缺乏糖基化等翻譯后修飾手段；總體而言，真核細(xì)胞的培養(yǎng)難度大，花費(fèi)高，其細(xì)胞抽提物的制備過(guò)程繁瑣。

4、此外，雖然目前核糖體展示技術(shù)相對(duì)較成熟，但實(shí)際操作時(shí)，“mrna-核糖體-蛋白質(zhì)”三元復(fù)合物易被酶分解或者分離，目標(biāo)蛋白也存在無(wú)法形成有活性的空間結(jié)構(gòu)等問(wèn)題，從而影響后續(xù)的分離、富集等步驟。因此，如何形成穩(wěn)定的“mrna-核糖體-蛋白質(zhì)”三元復(fù)合物且目標(biāo)蛋白能在核糖體上以正確空間構(gòu)象進(jìn)行展示是該技術(shù)的關(guān)鍵問(wèn)題。

5、為解決三元復(fù)合物的穩(wěn)定性問(wèn)題，現(xiàn)有技術(shù)提出了很多改進(jìn)手段，如去掉mrna?3′端的終止密碼子，在mrna末端添加莖環(huán)結(jié)構(gòu)(如us20200332280a1、cn1289668c)、延緩翻譯的密碼子以及增強(qiáng)子(如us6733970b2)，或者在轉(zhuǎn)錄翻譯體系中添加穩(wěn)定三元復(fù)合物的成分(如us9896685b2)等等，但是整體篩選效率依然較低，通常都需要多輪篩選才能夠?qū)⒛康幕蚧虻鞍子行Х蛛x，且目前轉(zhuǎn)錄翻譯應(yīng)用的主要是大腸桿菌體系，對(duì)蛋白的功能和活性的形成產(chǎn)生了一定限制。尚未見有酵母體外翻譯體系應(yīng)用到核糖體展示過(guò)程的具體實(shí)施方式，更未有關(guān)于在酵母無(wú)細(xì)胞體系中如何提高“mrna-核糖體-蛋白質(zhì)”三元復(fù)合物穩(wěn)定性以及篩選效率的研究。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的在于提供一種用于提高核糖體展示效率的核酸構(gòu)建物，采用該核酸構(gòu)建物能在體外快速進(jìn)行核糖體展示，高效實(shí)現(xiàn)篩選。具體采用酵母d2p技術(shù)平臺(tái)，通過(guò)設(shè)計(jì)構(gòu)建特定的核苷酸序列，促進(jìn)形成穩(wěn)定的“mrna-核糖體-蛋白質(zhì)”三元復(fù)合物，并利用篩選標(biāo)簽的特異性吸附作用提高篩選富集的效果，從而提高目的蛋白或基因的篩選效率。

2、本發(fā)明第一方面提供了一種核酸構(gòu)建物，所述核酸構(gòu)建物用于改造待篩選的基因，從而獲得改造的基因片段，使得轉(zhuǎn)錄、翻譯獲得的“mrna-核糖體-蛋白質(zhì)”三元復(fù)合物更穩(wěn)定。所述核酸構(gòu)建物包含前導(dǎo)肽序列、標(biāo)簽蛋白序列、間隔序列、聚氨基酸序列、莖環(huán)狀結(jié)構(gòu)序列等結(jié)構(gòu)。

3、所述核酸構(gòu)建物具有從5’至3’的式(i)結(jié)構(gòu)：

4、z1-z2-z3-z4-z5(i)

5、式中，

6、z1-z5分別為用于構(gòu)成所述構(gòu)建物的元件；

7、各“-”獨(dú)立地為鍵或核苷酸連接序列；

8、z1為前導(dǎo)肽(leader?peptide)的編碼序列；

9、z2為目標(biāo)分子；所述目標(biāo)分子為外源蛋白的編碼序列或連接有標(biāo)簽蛋白的外源蛋白編碼序列。

10、所述標(biāo)簽蛋白選自下組：6his?tag、8his?tag、鏈霉親和素stn及其任意組合；

11、z3為間隔序列(spacer)，所述間隔序列選自噬菌體m13基因ⅲ區(qū)編碼的部分氨基酸序列(m13?geneⅲ)、大腸桿菌e.coli的tonb序列、大腸桿菌e.coli?to1a序列及其組合；

12、z4為聚氨基酸序列，所述聚氨基酸選自聚精氨酸、聚賴氨酸及其組合；

13、z5為莖環(huán)狀結(jié)構(gòu)序列(stem?loop)。

14、在本發(fā)明中，z1、z2、z3、z4、z5元件的來(lái)源沒有特別限制。

15、在一優(yōu)選例中，所述前導(dǎo)肽序列具有如seq?no.1所示的序列，或者具有與seqno.1所示氨基酸序列≥80％一致性且具有相同活性的序列，優(yōu)選地，≥85％的一致性，優(yōu)選地≥90％的一致性；更優(yōu)選地≥95％的一致性；最優(yōu)選地，≥97％的一致性，如98％以上，99％以上。

16、在一優(yōu)選例中，所述標(biāo)簽蛋白是8his?tag或6his?tag。所述8his?tag具有seqno.2所示的序列，或者具有與seq?no.2所示氨基酸序列≥80％一致性且具有相同活性的序列，優(yōu)選地，≥85％的一致性，優(yōu)選地≥90％的一致性；更優(yōu)選地≥95％的一致性；最優(yōu)選地，≥97％的一致性，如98％以上，99％以上。所述6his?tag具有seq?no.3所示的序列，或者具有與seq?no.3所示氨基酸序列≥80％一致性且具有相同活性的序列，優(yōu)選地，≥85％的一致性，優(yōu)選地≥90％的一致性；更優(yōu)選地≥95％的一致性；最優(yōu)選地，≥97％的一致性，如98％以上，99％以上。

17、在另一優(yōu)選例中，所述標(biāo)簽蛋白是8his?tag。

18、在另一優(yōu)選例中，所述外源蛋白是待篩選的具有一定功能性的活性蛋白，其編碼序列來(lái)自原核生物、真核生物。

19、在另一優(yōu)選例中，所述外源蛋白的編碼序列來(lái)自動(dòng)物、植物、病原體。

20、在另一優(yōu)選例中，所述外源蛋白的編碼序列來(lái)自哺乳動(dòng)物，較佳地靈長(zhǎng)動(dòng)物，嚙齒動(dòng)物，包括人、小鼠、大鼠。

21、在另一優(yōu)選例中，所述的外源蛋白選自下組：熒光素蛋白、或熒光素酶、綠色熒光蛋白、黃色熒光蛋白、氨酰trna合成酶、甘油醛-3磷酸脫氫酶、過(guò)氧化氫酶、肌動(dòng)蛋白、抗體的可變區(qū)域、α-淀粉酶、腸道菌素a、丙型肝炎病毒e2糖蛋白、胰島素前體、干擾素αa、白細(xì)胞介素-1β、溶菌酶素、血清白蛋白、單鏈抗體(scfv)、甲狀腺素運(yùn)載蛋白、酪氨酸酶、木聚糖酶等，或上述任意蛋白的組合。

22、在一具體實(shí)施例中，所述外源蛋白為綠色熒光蛋白，其編碼序列具有如seq?no.4所示的序列，或者具有與seq?no.4所示氨基酸序列≥80％一致性且具有相同活性的序列，優(yōu)選地，≥85％的一致性，優(yōu)選地≥90％的一致性；更優(yōu)選地≥95％的一致性；最優(yōu)選地，≥97％的一致性，如98％以上，99％以上。

23、在另一優(yōu)選例中，所述間隔序列為噬菌體m13基因ⅲ區(qū)編碼的部分氨基酸序列(m13geneⅲ)，所述噬菌體m13基因ⅲ區(qū)編碼的部分氨基酸序列具有如seq?no.5所示的序列，或者具有與seq?no.5所示氨基酸序列≥80％一致性且具有相同活性的序列，優(yōu)選地，≥85％的一致性，優(yōu)選地≥90％的一致性；更優(yōu)選地≥95％的一致性；最優(yōu)選地，≥97％的一致性，如98％以上，99％以上。

24、在另一優(yōu)選例中，所述聚氨基酸序列為聚精氨酸序列，所述聚精氨酸具有如seqno.6所示的序列，或者具有與seq?no.6所示氨基酸序列≥80％一致性且具有相同活性的序列，優(yōu)選地，≥85％的一致性，優(yōu)選地≥90％的一致性；更優(yōu)選地≥95％的一致性；最優(yōu)選地，≥97％的一致性，如98％以上，99％以上。

25、在另一優(yōu)選例中，所述莖環(huán)結(jié)構(gòu)序列具有如seq?no.7所示的序列，或者具有與seqno.7所示氨基酸序列≥80％一致性且具有相同活性的序列，優(yōu)選地，≥85％的一致性，優(yōu)選地≥90％的一致性；更優(yōu)選地≥95％的一致性；最優(yōu)選地，≥97％的一致性，如98％以上，99％以上。

26、在另一優(yōu)選例中，所述的標(biāo)簽蛋白序列與外源蛋白的編碼序列間包含一連接序列(linker)，所述連接序列具有不易形成二級(jí)結(jié)構(gòu)的序列(如at-rich序列，無(wú)發(fā)卡結(jié)構(gòu)，無(wú)g-quadruplex等等)，不富含稀有密碼子。

27、在另一優(yōu)選例中，所述標(biāo)簽蛋白序列與外源蛋白的編碼序列之間的連接序列為linker?1，所述linker?1具有如seq?no.8所示的序列。

28、在另一優(yōu)選例中，所述核酸構(gòu)建物的5’端上游還包括啟動(dòng)子，所述啟動(dòng)子位于核酸構(gòu)建物的5’端。

29、在另一優(yōu)選例中，所述啟動(dòng)子選自下組：t7啟動(dòng)子、t3啟動(dòng)子、sp6啟動(dòng)子、或其組合。

30、在另一優(yōu)選例中，所述啟動(dòng)子為t7啟動(dòng)子，所述t7啟動(dòng)子具有如seq?no.9所示的序列，或者具有與seq?no.9所示氨基酸序列≥80％一致性且具有相同活性的序列。

31、在另一優(yōu)選例中，所述啟動(dòng)子和前導(dǎo)肽之間還包含一段5'utr序列，優(yōu)選該序列具有如seq?no.10所示的序列，或者具有與seq?no.10所示氨基酸序列≥80％一致性且具有相同活性的序列，優(yōu)選地，≥85％的一致性，優(yōu)選地≥90％的一致性；更優(yōu)選地≥95％的一致性；最優(yōu)選地，≥97％的一致性，如98％以上，99％以上。

32、在另一優(yōu)選例中，所述核酸構(gòu)建物種還包含起始密碼子，所述起始密碼子位于5'utr序列之后、前導(dǎo)肽之前，其序列為atg。

33、本發(fā)明第二方面提供了一種載體或載體組合，所述的載體或載體組合含有第一方面所述的核酸構(gòu)建物。

34、在另一優(yōu)選例中，所述載體選自：細(xì)菌質(zhì)粒、噬菌體、酵母質(zhì)粒等。具體載體類型可選自：表達(dá)載體、克隆載體或穿梭載體等。用于制備重組載體的方法是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知的。只要其能夠穩(wěn)定復(fù)制和表達(dá)，任何質(zhì)粒和載體都是可以被采用的。

35、本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以使用熟知的方法構(gòu)建含有本發(fā)明所述的啟動(dòng)子和/或目的基因序列的表達(dá)載體。這些方法包括體外重組dna技術(shù)、人工dna合成技術(shù)、體內(nèi)重組技術(shù)等。

36、本發(fā)明第三方面提供了一種基因工程細(xì)胞，所述基因工程細(xì)胞的基因組的一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)整合有本發(fā)明第一方面所述的核酸構(gòu)建物，或者所述基因工程細(xì)胞中含有本發(fā)明第二方面所述的載體或載體組合。

37、在一優(yōu)選例中，所述基因工程細(xì)胞為真核細(xì)胞。

38、在另一優(yōu)選例中，所述基因工程細(xì)胞為酵母細(xì)胞。

39、在另一優(yōu)選例中，所述酵母細(xì)胞選自下組：釀酒酵母、克魯維酵母屬酵母、畢赤酵母，或其組合。

40、在另一優(yōu)選例中，所述克魯維酵母屬酵母選自下組：乳酸克魯維酵母、馬克斯克魯維酵母、多布克魯維酵母、或其任意組合；更優(yōu)選為乳酸克魯維酵母。

41、本發(fā)明第四方面提供了一種用于核糖體展示技術(shù)的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒中包含的試劑選自下組中的一種或多種：

42、(a)本發(fā)明第一方面所述的構(gòu)建物；

43、(b)本發(fā)明第二方面所述的載體或載體組合；和

44、(c)本發(fā)明第三方面所述的基因工程細(xì)胞。

45、在另一優(yōu)選例中，所述試劑盒還包括(d)真核體外生物合成體系(如真核體外蛋白合成體系)，優(yōu)選包括酵母體外生物合成體系(如酵母體外蛋白合成體系)。

46、在另一優(yōu)選例中，所述酵母體外生物合成體系為克魯維酵母體外生物合成體系，如克魯維酵母體外蛋白合成體系，優(yōu)選乳酸克魯維酵母體外生物合成體系，如乳酸克魯維酵母體外蛋白合成體系。

47、本發(fā)明第五方面提供了一種如本發(fā)明第一方面所述的構(gòu)建物、本發(fā)明第二方面所述的載體或載體組合、本發(fā)明第三方面所述的基因工程細(xì)胞或本發(fā)明第四方面所述試劑盒的用途，用于進(jìn)行核酸展示，以富集篩選目的基因或蛋白。

48、本發(fā)明第六方面提供了一種利用d2p(dna?to?protein，即體外蛋白質(zhì)合成體系)平臺(tái)在體外快速進(jìn)行核糖體展示的方法，包括步驟：

49、(1)構(gòu)建篩選模板合成前述核酸構(gòu)建物，之后采用pcr技術(shù)構(gòu)建含有所述的核酸構(gòu)建物的質(zhì)粒，將含有核酸構(gòu)建物的質(zhì)粒進(jìn)行pcr擴(kuò)增，獲得用于篩選的dna庫(kù)。

50、(2)體外轉(zhuǎn)錄、翻譯將上一步獲得的待篩選dna庫(kù)添加到d2p體系中進(jìn)行反應(yīng)。

51、(3)體外篩選對(duì)反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行富集篩選。

52、(4)逆轉(zhuǎn)錄獲得cdna將上一步篩選獲得的產(chǎn)物通過(guò)rt-pcr獲得cdna。

53、在另一優(yōu)選例中，所述方法還包括：(5)將步驟(4)中獲得的cdna再循環(huán)進(jìn)行一輪、兩輪或多輪步驟(1)-(4)的篩選，以富集更多的目標(biāo)基因或蛋白。

54、在另一優(yōu)選例中，所述方法還包括：(6)在步驟(4)或步驟(5)之后增加檢測(cè)步驟。

55、在另一優(yōu)選例中，所述含有核酸構(gòu)建物的質(zhì)粒采用常規(guī)基因合成工藝制備，如人工合成或pcr技術(shù)等。

56、在另一優(yōu)選例中，所述含有核酸構(gòu)建物的質(zhì)粒的擴(kuò)增采用引物進(jìn)行。

57、在另一優(yōu)選例中，所述體外轉(zhuǎn)錄、翻譯在酵母體外蛋白合成體系中進(jìn)行，優(yōu)選克魯維酵母體外蛋白合成體系，更優(yōu)選乳酸克魯維酵母體外生物合成體系。

58、在另一優(yōu)選例中，所述體外轉(zhuǎn)錄、翻譯在室溫下進(jìn)行，反應(yīng)時(shí)間為40-120min；優(yōu)選在25-30℃條件下反應(yīng)60min。

59、在另一優(yōu)選例中，所述體外篩選采用吸附磁珠，優(yōu)選his?beads進(jìn)行，優(yōu)選在2-6℃條件下孵育0.5-2h，更優(yōu)選在4℃條件下孵育1h。

60、在另一優(yōu)選例中，所述體外篩選重復(fù)2次、3次或多次。

61、在另一優(yōu)選例中，所述目標(biāo)分子或目的基因在待篩選基因文庫(kù)中的含量(摩爾比)≥1：106，優(yōu)選地≥1：105；更優(yōu)選地≥1：103。

62、在另一優(yōu)選例中，所述體外篩選在采用吸附磁珠進(jìn)行吸附后，采用超純水進(jìn)行充分洗滌，之后添加dnasei(takara)消化去除beads上結(jié)合的dna。優(yōu)選的，上述吸附磁珠選擇his?beats。

63、在另一優(yōu)選例中，所述添加dnasei(takara)消化的工藝采在消化體系中進(jìn)行，所述消化體系包括以下一種或多種組分：10x?buffer、depc?h2o、dnase?i。

64、在另一優(yōu)選例中，所述消化在30-40℃條件下保溫進(jìn)行，更優(yōu)選在37℃保溫30min。

65、在另一優(yōu)選例中，所述逆轉(zhuǎn)錄在逆轉(zhuǎn)錄體系中進(jìn)行，所述逆轉(zhuǎn)錄體系包括至少以下一種成分：rna(混勻帶beads)、primer(10μm)、5x?buffer、10mm?dntp、逆轉(zhuǎn)錄酶mmlv?2。

66、在另一優(yōu)選例中，所述體外篩選在采用吸附磁珠進(jìn)行吸附后，直接添加dnasei(takara)消化去除beads上結(jié)合的dna。

67、在另一優(yōu)選例中，所述逆轉(zhuǎn)錄后再進(jìn)行熱變性反應(yīng)。

68、本發(fā)明的有益效果

69、1)本發(fā)明首次開發(fā)一種新的用于提高核糖體展示篩選效率的核酸構(gòu)建物。所述的核酸構(gòu)建物，包含前導(dǎo)肽序列、目標(biāo)分子序列、間隔序列、聚氨基酸序列以及莖環(huán)結(jié)構(gòu)序列等特定的結(jié)構(gòu)，通過(guò)設(shè)計(jì)特定結(jié)構(gòu)的核酸序列，將含有目標(biāo)基因的目標(biāo)分子插入該核酸序列中，能夠使得核糖體上mrna在翻譯時(shí)及時(shí)停止，并能夠防止rna的降解，從而保證“mrna-核糖體-蛋白質(zhì)”三元復(fù)合物的穩(wěn)定性，有利于核糖體展示的完成。

70、2)當(dāng)構(gòu)建的目標(biāo)分子中添加有標(biāo)簽蛋白時(shí)，在后續(xù)的篩選工藝中，由于篩選標(biāo)簽具有特異性吸附作用，大大提高了目的蛋白或基因的富集效果，提升了核糖體展示技術(shù)整體的篩選效率。當(dāng)構(gòu)建的目標(biāo)分子中添加有標(biāo)簽蛋白，可以用作驗(yàn)證核酸構(gòu)建物在核糖展示技術(shù)的篩選效果的試驗(yàn)。

71、3)本發(fā)明還提供了與上述核酸構(gòu)建物相關(guān)的可用于核糖體展示的一系列產(chǎn)品或方法，如試劑盒、核糖體展示方法等，方便該核酸構(gòu)建物的使用以及核糖體展示的操作，能夠大大節(jié)約核糖體展示技術(shù)的篩選時(shí)間，提高功能性蛋白如單抗、酶等的篩選效率。

72、4)此外，本發(fā)明采用的是體外翻譯體系，具體采用了酵母體外翻譯體系，作為申請(qǐng)人一直以來(lái)致力研究的體外翻譯體系，酵母體系尤其是克魯維酵母體系具有突出的優(yōu)勢(shì)，其克服了大腸桿菌體系在蛋白翻譯后修飾上局限性的問(wèn)題以及兔網(wǎng)織紅細(xì)胞裂解液體系和麥胚體系存在的培養(yǎng)成本高等諸多問(wèn)題，更利于大批量進(jìn)行實(shí)驗(yàn)或生產(chǎn)，構(gòu)建核糖體篩選文庫(kù)的容量也大大提升、工藝周期也縮短。

73、5)使用本發(fā)明的核酸構(gòu)建物，能夠更加高效地富集目的基因，即使在目的基因在篩選庫(kù)中所占的比例較低(如占基因庫(kù)總摩爾數(shù)的1/105，或者更低)的情況下，也能夠有效將其富集和展示出來(lái)，可見其對(duì)于實(shí)現(xiàn)高效的核糖體篩選具有重要作用。

74、應(yīng)理解，在本發(fā)明范圍內(nèi)中，本發(fā)明的上述各技術(shù)特征和在下文(如實(shí)施例)中具體描述的各技術(shù)特征之間都可以互相組合，從而構(gòu)成新的或優(yōu)選的技術(shù)方案。限于篇幅，在此不再一一累述。