本發(fā)明屬于高分子抗菌生物材料，具體包含一種具有抗菌活性的明膠/抗菌肽共價偶聯(lián)物，制備及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、明膠是膠原經(jīng)酸、堿或者酶處理后的部分水解產(chǎn)物，具有良好的生物相容性、生物降解性，低免疫原性，是一種應(yīng)用廣泛的生物高分子材料，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于感光成像、包裝材料、食品、化妝品、飼料等生產(chǎn)、生活領(lǐng)域。在具有高附加值的生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，明膠同樣有著廣泛的應(yīng)用，被用于皮膚科、眼科、骨科等科室的治療藥物與器械中。

2、在現(xiàn)實生產(chǎn)生活領(lǐng)域中，微生物感染是困擾了人類幾千年的大問題，食品儲存流通中因微生物的污染而導(dǎo)致食品腐敗、變質(zhì)，人類誤食污染的食品可能會導(dǎo)致食源性疾病。同時有害微生物感染導(dǎo)致了人類多種疾病，外科感染延緩了傷口的治愈，嚴(yán)重時甚至?xí)＜吧Ｃ髂z不具有抗菌活性，同時由于明膠是由氨基酸組成，還可作為微生物的營養(yǎng)物質(zhì)，這使得明膠在應(yīng)用上受到了很大的限制。為了賦予明膠抗菌活性，人們向明膠制品中加入抗菌試劑，包括有機(jī)抗菌材料、無機(jī)抗菌材料以及天然抗菌材料等。

3、抗菌肽是一類具有抗菌活性的多肽物質(zhì)，廣泛存在于細(xì)菌、植物、動物體內(nèi)，是宿主細(xì)胞先天性免疫的重要效應(yīng)分子?？咕木哂袕V譜抗菌性質(zhì)，對于多重耐藥菌具有良好的抑制作用，同時不易產(chǎn)生耐藥性，有望成為抗生素的替代品，受到了科學(xué)工作者廣泛的關(guān)注。天然防腐劑ε-聚賴氨酸、那他霉素、乳酸鏈球菌素等是由鏈霉菌屬、乳酸鏈球菌產(chǎn)生的抗菌肽，對于多種細(xì)菌、真菌具有良好的抑制作用。

4、目前，制備明膠/抗菌肽復(fù)合材料主要有兩種方式：1)第一種方式，明膠與抗菌肽進(jìn)行物理混合；2)第二種方式，明膠與抗菌肽形成共價偶聯(lián)物。由于物理混合方式中，明膠與抗菌肽沒有強烈的化學(xué)鍵合，抗菌肽容易流失，從而使得復(fù)合材料失去抗菌活性。同時抗菌肽也存在如易被酶降解，活性不穩(wěn)定，生物利用度低，一定的溶血性以及細(xì)胞毒性等缺點。例如酸性多糖類、鹽酸鹽類、磷酸鹽類、銅離子等會降低ε-聚賴氨酸的抗菌活性。同時當(dāng)ε-聚賴氨酸分解，分子量低于1300時，ε-聚賴氨酸失去抑菌活性。明膠與抗菌肽形成共價偶聯(lián)物可以克服上述物理混合帶來的缺點，有助于抗菌肽活性的穩(wěn)定。目前文獻(xiàn)中報導(dǎo)的方法是以明膠和抗菌肽為原料，通過1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽/n-羥基琥珀酰亞胺(edc/nhs)體系活化明膠或者抗菌肽的羧基，與另一反應(yīng)物的氨基反應(yīng)形成酰胺鍵，生成共價偶聯(lián)物。但該方法中使用的edc/nhs試劑價格高，活化羧基時用量較大，從而推高抗菌明膠的成本。同時該方法只適合在反應(yīng)物濃度較低的條件下生成偶聯(lián)物，當(dāng)提高明膠濃度時，明膠快速交聯(lián)，生成凝膠產(chǎn)物。

5、基于此，急需開發(fā)一種制備成本低廉、操作簡便、效率高、可進(jìn)行大規(guī)模制備明膠/抗菌肽共價偶聯(lián)物的方法。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、針對現(xiàn)有技術(shù)存在的上述問題，本發(fā)明的第一個目的在于提供一種具有抗菌活性的明膠/抗菌肽共價偶聯(lián)物的制備方法。該制備方法具有低成本、高效率、條件溫和的特點，通過在堿性條件下活化明膠與抗菌肽的氨基，或者在酸性條件下活化明膠與抗菌肽的羧基，繼而與偶聯(lián)劑分子兩端的環(huán)氧基團(tuán)偶聯(lián)，形成具有抗菌性質(zhì)的明膠/抗菌肽共價偶聯(lián)物；同時，該制備方法可實現(xiàn)幾克到幾百克明膠原料的投料生產(chǎn)，可大規(guī)模制備具有抗菌活性的明膠/抗菌肽共價偶聯(lián)物。

2、本發(fā)明的第二個目的在于提供一種采用如上所述的制備方法制備得到的具有抗菌活性的明膠/抗菌肽共價偶聯(lián)物。該明膠/抗菌肽共價偶聯(lián)物具有較高的抗菌活性，并且還可以通過引入功能試劑，賦予明膠/抗菌肽共價偶聯(lián)物新的性質(zhì)，有利于拓寬該明膠/抗菌肽共價偶聯(lián)物的應(yīng)用范圍。

3、本發(fā)明的第三個目的在于提供一種利用如上所述的明膠/抗菌肽共價偶聯(lián)物在制備抗菌和/或抑菌產(chǎn)品中的應(yīng)用。

4、為實現(xiàn)以上第一個目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案包括：

5、本發(fā)明公開一種具有抗菌活性的明膠/抗菌肽共價偶聯(lián)物的制備方法，包括如下步驟：

6、1)向明膠中加入反應(yīng)介質(zhì)，加熱，使明膠充分溶解，得到明膠溶液；

7、2)向明膠溶液中加入抗菌肽，再加入或不加入功能試劑，充分溶解后調(diào)節(jié)ph至3-6.5或9-12，得預(yù)混液；

8、3)向預(yù)混液中添加偶聯(lián)劑，進(jìn)行偶聯(lián)反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后，調(diào)至中性，透析，凍干，即得。

9、本發(fā)明通過簡單地調(diào)整反應(yīng)體系的酸堿性，即實現(xiàn)對明膠與抗菌肽的氨基或羧基的活化，活化后的明膠與抗菌肽再通過偶聯(lián)劑分子兩端的環(huán)氧基團(tuán)發(fā)生偶聯(lián)，從而將抗菌肽分子偶聯(lián)到明膠分子鏈上，形成具有抗菌性質(zhì)的明膠/抗菌肽共價偶聯(lián)物，該制備方法從成本角度出發(fā)，擯棄傳統(tǒng)技術(shù)中使用的edc/nhs活化體系，成本更低，效率較高，能夠在明膠較高濃度下簡單、快速制備抗菌明膠復(fù)合材料，并且通過對明膠溶液的濃度與明膠/聚賴氨酸/偶聯(lián)劑的配比協(xié)調(diào)控制，避免明膠快速交聯(lián)形成凝膠，可實現(xiàn)在整個制備過程中保持溶液狀態(tài)的效果。

10、進(jìn)一步，本發(fā)明使用的明膠可以選用本領(lǐng)域常用的明膠，對明膠的來源不做限定，包括但不限于豬、牛、魚和家禽來源的明膠中的一種或多種。

11、進(jìn)一步，所述明膠溶液中明膠的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2-20％，優(yōu)選為5-15％。

12、進(jìn)一步，所述反應(yīng)介質(zhì)包括但不限于蒸餾水、氯化鈉水溶液、碳酸鹽緩沖液、tris-hcl溶液、2-嗎啉乙磺酸溶液和醋酸鹽緩沖液中的一種或多種。

13、進(jìn)一步，步驟1對明膠進(jìn)行溶解時，控制溶解溫度為35-60℃，優(yōu)選為40-55℃。

14、進(jìn)一步，本發(fā)明使用的抗菌肽可以是天然抗菌肽，也可以是人工合成的抗菌肽，只要具有自由氨基和/或羧基即可，所述抗菌肽包括但不限于ε-聚賴氨酸或其鹽、乳酸鏈球菌素或其鹽、那他霉素或其鹽中的一種或多種。

15、進(jìn)一步，所述抗菌肽與明膠的質(zhì)量比為0.05-2:1，優(yōu)選為0.1-1:1。

16、進(jìn)一步，所述功能試劑包括但不限于抗氧化增強試劑、抗菌增強試劑、機(jī)械強度增強試劑和伸展性增強試劑中的一種或多種；示例性地，所述功能試劑包括但不限于水溶性殼聚糖、茶多酚、檸檬酸、單寧酸、透明質(zhì)酸等中的一種或多種。為幫助這些功能試劑溶解，可適量添加乙醇、乙二醇、丙三醇等溶劑，這些溶劑在透析以及干燥步驟中可以去除完全，對生物安全性無影響。

17、進(jìn)一步，所述功能試劑為明膠質(zhì)量的0-20wt％。

18、進(jìn)一步，考慮到過酸、過堿條件下明膠容易分解，以及未來大規(guī)模生產(chǎn)中酸堿性對反應(yīng)容器的影響，步驟2更為適宜的ph范圍為4-6或10-11。

19、進(jìn)一步，所述偶聯(lián)劑具有多個環(huán)氧基團(tuán)，包括但不限于乙二醇二縮水甘油醚，聚乙二醇二縮水甘油醚，季戊四醇縮水甘油醚，丙三醇三縮水甘油醚，1,4-丁二醇二縮水甘油醚，1,6-己二醇二縮水甘油醚，三羥甲基丙烷三縮水甘油醚，四臂聚乙二醇縮水甘油醚等，優(yōu)選水中溶解度較大的乙二醇二縮水甘油醚，聚乙二醇二縮水甘油醚，丙三醇三縮水甘油醚，1,4-丁二醇二縮水甘油醚中的一種或多種。

20、進(jìn)一步，所述偶聯(lián)劑與明膠的質(zhì)量比為0.01-0.10:1，優(yōu)選為0.02-0.05:1。

21、進(jìn)一步，所述偶聯(lián)反應(yīng)的反應(yīng)溫度為35-60℃，優(yōu)選為40-55℃，反應(yīng)時間為8-48h，優(yōu)選為12-24h。

22、進(jìn)一步，所述透析過程是除去未反應(yīng)的抗菌肽以及偶聯(lián)劑，減少其對后續(xù)應(yīng)用的影響，可以通過透析袋的截留分子量來控制。所述透析過程中控制的溫度為室溫-50℃，優(yōu)選為35-45℃，透析時間為1-5d；透析袋的截留分子量為20-40kda。

23、為實現(xiàn)以上第二個目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案包括：

24、本發(fā)明公開一種采用如上所述的制備方法制備得到的具有抗菌活性的明膠/抗菌肽共價偶聯(lián)物。

25、為實現(xiàn)以上第三個目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案包括：

26、本發(fā)明公開一種利用如上所述的明膠/抗菌肽共價偶聯(lián)物在制備抗菌和/或抑菌產(chǎn)品中的應(yīng)用。

27、本發(fā)明有益效果：

28、本發(fā)明公開一種制備明膠/抗菌肽共價偶聯(lián)物的方法，該制備方法具有低成本、高效率、反應(yīng)溫和的特點，通過在堿性條件下活化明膠與抗菌肽的氨基，或者在酸性條件下活化明膠與抗菌肽的羧基，繼而與偶聯(lián)劑分子兩端的環(huán)氧基團(tuán)偶聯(lián)，形成具有抗菌性質(zhì)的明膠/抗菌肽共價偶聯(lián)物；同時，該制備方法可實現(xiàn)幾克到幾百克明膠原料的投料生產(chǎn)，可大規(guī)模制備具有抗菌活性的明膠/抗菌肽共價偶聯(lián)物。

29、本發(fā)明通過簡單地調(diào)整反應(yīng)體系的酸堿性，即可實現(xiàn)對明膠與抗菌肽的氨基或羧基的活化，活化后的明膠與抗菌肽再通過偶聯(lián)劑分子兩端的環(huán)氧基團(tuán)發(fā)生偶聯(lián)，從而將抗菌肽分子偶聯(lián)到明膠分子鏈上，形成具有抗菌性質(zhì)的明膠/抗菌肽共價偶聯(lián)物，該制備方法從成本角度出發(fā)，擯棄傳統(tǒng)技術(shù)中使用的edc/nhs活化體系，成本更低，效率較高，能夠在明膠較高濃度下簡單、快速制備抗菌明膠復(fù)合材料。