本發(fā)明涉及基因工程和殘留農(nóng)藥減除領(lǐng)域，具體地，涉及一種降解擬除蟲菊酯的酯酶及構(gòu)建該基因重組菌并獲得重組酶的方法。

背景技術(shù)：

1、擬除蟲菊酯類農(nóng)藥是目前應(yīng)用最廣泛的殺蟲劑之一，用于果蔬、谷物等農(nóng)林作物及家庭中多種害蟲的防治。擬除蟲菊酯的大量使用導致其在環(huán)境中長期存在并在農(nóng)林作物中逐步積累，嚴重危害生態(tài)環(huán)境安全和食品安全。同時，擬除蟲菊酯還可以通過空氣、灰塵、水及食物等介質(zhì)經(jīng)由攝食、呼吸、皮膚等多種途徑進入人體，可能造成一系列的毒性損傷。

2、酯酶是催化酯鍵斷裂的水解酶總稱，來源廣泛，催化活性高，反應(yīng)條件溫和，無需輔酶參與，在醫(yī)藥行業(yè)可用于手性化合物拆分與藥物合成，在食品工業(yè)中可用于改善釀造食品風味，也可以用于環(huán)境及食品中擬除蟲菊酯類農(nóng)藥的減除。

3、酯鍵斷裂是擬除蟲菊酯類農(nóng)藥降解的第一步，在此過程中，酯酶發(fā)揮著極其重要的作用。微生物繁殖速度快、培養(yǎng)周期較短，是獲得酯酶的重要來源之一。從擬除蟲菊酯降解微生物出發(fā)，尋找酯酶基因并進行異源表達，構(gòu)建基因工程菌，由此獲得酯酶，進一步考察酯酶對擬除蟲菊酯的降解能力，是擴充擬除蟲菊酯降解酶資源的重要手段，在環(huán)境生物修復(fù)以及食品、人體中農(nóng)藥減除等方面具有重要意義。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的是提供該酯酶基因編碼的蛋白質(zhì)，該蛋白可有效降解擬除蟲菊酯類農(nóng)藥，該酯酶的氨基酸序列為seq?id?no.1。

2、?該酶蛋白由482個氨基酸組成，不含有信號肽，分子量為52.882?kda，等電點pi為4.91。

3、本發(fā)明的目的也包括提供表達上述酯酶的重組菌株。

4、本發(fā)明還提供了利用含該重組菌株生產(chǎn)酯酶的方法。

5、本發(fā)明的目的通過以下方案實現(xiàn)：

6、本發(fā)明所述酯酶基因 est10來源于一株能夠降解擬除蟲菊酯類農(nóng)藥的枯草芽孢桿菌（ bacillus?subtilis）j6。

7、?設(shè)計上游引物5’-atgacaaaacttaccgttcaaaccc-3’，下游引物5’-ttatgcttgaaacaggatgcggc-3’。以枯草芽孢桿菌j6基因組dna為模板進行pcr擴增，瓊脂糖凝膠電泳檢測無誤后回收基因片段，將該片段與pmd18t載體進行t-a連接，構(gòu)建克隆載體、將克隆載體轉(zhuǎn)入大腸桿菌dh5α，將菌液涂布于含100?mg/l氨芐西林的lb固體培養(yǎng)基，通過藍白斑篩選獲得白色單菌落。收集菌體提取質(zhì)粒，利用引物對克隆載體進行pcr擴增，同時進行測序和比對分析，獲得陽性克隆菌株。

8、?根據(jù)表達載體pet-28a(+)及目的基因序列選擇合適的酶切位點和保護堿基設(shè)計特異性引物：上游引物5’-catgccatggccatgacaaaacttaccgttcaaaccc-3’，下游引物5’-ccgctcgagtgcttgaaacaggatgcggcgtttt-3’。使用限制性內(nèi)切酶 ncoi和 xhoi在37℃水浴處理2h，對表達載體pet-28a(+)和目的基因 est10進行雙酶切，用pcr純化試劑盒進行片段純化回收，使用t4連接酶進行連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞bl21(de3)，將菌液涂布于含卡那霉素的lb平板上，37℃培養(yǎng)10~12?h，獲得陽性轉(zhuǎn)化子，即得到基因工程菌 e.colibl21(de3)-pet-28a(+)- est10。

9、獲得基因工程菌分泌表達酯酶的誘導方法，按以下步驟進行。

10、將基因工程菌 e.colibl21(de3)-pet-28a(+)- est10甘油菌接種于含40?mg/l卡那霉素的lb液體培養(yǎng)基中，在37℃條件下振蕩過夜培養(yǎng)，得到基因工程菌菌液。

11、?將上述菌液按照1%接種量接種至含40?mg/l卡那霉素的lb液體培養(yǎng)基中，37℃、160?rpm振蕩培養(yǎng)至od600為0.8；加入iptg至終濃度為1?mmol/l，20℃、160?rpm振蕩培養(yǎng)16h。

12、本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在：提供了一種來源于枯草芽孢桿菌j6的酯酶基因 est10及構(gòu)建的重組菌，能表達重組的酯酶est10；本發(fā)明中所述基因工程菌培養(yǎng)簡單，酯酶能夠催化擬除蟲菊酯農(nóng)藥水解，反應(yīng)條件溫和，具有很好的應(yīng)用開發(fā)潛力。

技術(shù)特征：

1.一株具有酯鍵水解作用的酯酶est10，其特征在于，由來源于枯草芽孢桿菌（bacillus?subtilis）j6的酯酶基因est10編碼，其氨基酸序列如seq?id?no.1所示。

2.包含權(quán)利要求1所述酯酶基因est10的重組載體為pet-28a(+)-est10。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述酯酶基因的重組菌株。

4.一種制備酯酶的方法，其特征在于，包括以下步驟：

5.權(quán)利要求1所述酯酶應(yīng)用在環(huán)境及農(nóng)作物、農(nóng)產(chǎn)品中的含酯農(nóng)藥的去除。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開了一種酯酶Est10及分泌該酯酶的重組菌。該酯酶含有482個氨基酸，具有如SEQ?ID?NO.1氨基酸序列。將該酯酶基因與表達載體pET28a(+)連接，以E.coli?BL21(DE3)為宿主菌，構(gòu)建重組基因工程菌E.coli?BL21(DE3)?pET?28a(+)?est10?；蚬こ叹王ッ缚梢杂糜谑苻r(nóng)藥污染的土壤、水體等環(huán)境的生物修復(fù)，也可以應(yīng)用于農(nóng)產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留的減除。

技術(shù)研發(fā)人員：胡凱弟,張夢梅,劉書亮,刁揚羽,夏小龍,戴鑫,李建龍,李琴,敖曉琳,胡欣潔
受保護的技術(shù)使用者：四川農(nóng)業(yè)大學
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/1/2