本發(fā)明涉及一種多環(huán)芳烴污染土壤中外源降解菌的施加方法，特別涉及一種針對(duì)多環(huán)芳烴污染土壤及環(huán)境中外源降解菌定量、特異檢測(cè)及施加的方法，屬于土壤微生物檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

有機(jī)污染土壤的生物修復(fù)法因具有成本低、無(wú)二次污染、可大面積應(yīng)用等優(yōu)點(diǎn)受到廣泛關(guān)注。生物強(qiáng)化法是生物修復(fù)的重要手段之一，其主體是人為投加有高效降解能力的降解菌或菌群。外源降解菌進(jìn)入污染環(huán)境后，會(huì)受污染物脅迫，并與土著菌競(jìng)爭(zhēng)，其存活和增殖情況在整個(gè)修復(fù)期內(nèi)呈現(xiàn)動(dòng)態(tài)變化。通過(guò)對(duì)降解菌進(jìn)行實(shí)時(shí)定量的追蹤，可準(zhǔn)確了解其進(jìn)入環(huán)境后的存活和增殖情況，從而改進(jìn)修復(fù)時(shí)菌劑的投加量和投加方式，提高修復(fù)效果。因此有必要開(kāi)發(fā)出針對(duì)特定外源降解菌在環(huán)境中的數(shù)量檢測(cè)方法。

傳統(tǒng)的微生物數(shù)量檢測(cè)方法有稀釋平板法、血球計(jì)數(shù)板法等，但這些方法只能對(duì)樣品中的全部微生物進(jìn)行無(wú)差別的計(jì)數(shù)，無(wú)法對(duì)樣品中的微生物進(jìn)行準(zhǔn)確的種屬區(qū)分，因此無(wú)法排除環(huán)境樣品中土著微生物的干擾對(duì)特定菌株進(jìn)行數(shù)量檢測(cè)。

實(shí)時(shí)熒光定量pcr技術(shù)具有靈敏性高、精確性好、特異性強(qiáng)和安全快速等優(yōu)點(diǎn)，已被應(yīng)用于檢測(cè)環(huán)境樣品中的目標(biāo)微生物。但目前基于實(shí)時(shí)熒光定量pcr技術(shù)對(duì)有機(jī)污染土壤及其他環(huán)境樣品中微生物的定量方法多以16s/18srdna或功能基因?yàn)槟康幕?，研究多集中于某?lèi)或某幾類(lèi)土著降解菌，缺少對(duì)某種特定外源降解菌進(jìn)入環(huán)境后的數(shù)量分布情況的關(guān)注。其主要技術(shù)難點(diǎn)在于針對(duì)能夠高效處理有機(jī)污染物的外源微生物菌株，需要找到該微生物菌株與土著降解菌及土著同種屬菌具有差異的特異性基因序列及特異性引物。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種多環(huán)芳烴污染土壤中外源降解菌的施加方法。

本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

一種多環(huán)芳烴污染土壤中外源降解菌的施加方法，步驟如下：

(1)采集土壤樣品，測(cè)定含水率，-20℃以下保存；

(2)提取樣品中的基因組dna，制得dna模板；

(3)對(duì)步驟(2)制得的dna模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量pcr擴(kuò)增，上游引物核苷酸序列如seqidno.1所示，下游引物核苷酸序列如seqidno.2所示，然后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，計(jì)算目標(biāo)菌數(shù)量；所述標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)如下：

y＝-3.365x+37.624；

其中：r²＝0.9999，y為實(shí)時(shí)熒光定量pcr反應(yīng)的ct值，x為菌的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)?？截悢?shù)對(duì)數(shù)值；

(4)調(diào)整土壤含水率至20-50％，疏松土壤，根據(jù)土壤多環(huán)芳烴污染物含量及土壤營(yíng)養(yǎng)元素含量，添加氮磷肥料，調(diào)節(jié)污染土壤的碳、氮、磷的摩爾比為(100～120)：(5～10)：1，投加外源假單胞菌(psedomonassp.)ppz-1的數(shù)量至10⁹cfu/g土，隔周翻攪一次，維持土壤含水率20～50％，每周檢測(cè)外源降解菌的數(shù)量及多環(huán)芳烴殘留量，當(dāng)外源降解菌數(shù)量低于10⁷cfu/g土?xí)r，補(bǔ)加外源假單胞菌(psedomonassp.)ppz-1的數(shù)量至10⁹cfu/g土，直至多環(huán)芳烴殘留量達(dá)到處理要求。

所述外源假單胞菌(psedomonassp.)ppz-1分離自多環(huán)芳烴污染土壤，保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，菌種保藏號(hào)cgmccno.12596。

根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(3)中，熒光定量pcr擴(kuò)增的反應(yīng)體系如下，總體系20μl：

2×sybrgreenqpcrmastermix10μl；濃度10μm的上游引物0.4μl；濃度10μm的下游引物0.4μl；ddh207.2μl；dna模板2μl；

所述熒光定量pcr擴(kuò)增的反應(yīng)條件如下：

95℃預(yù)變性3min；95℃變性15s，57℃退火20s，72℃延伸30s，45個(gè)循環(huán)。

根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(4)中，多環(huán)芳烴為菲。

有益效果

本發(fā)明首次通過(guò)利用實(shí)時(shí)熒光定量pcr的方法特異性監(jiān)測(cè)土壤中外源多環(huán)芳烴降解菌假單胞菌(psedomonassp.)ppz-1，并通過(guò)控制土壤中的外源多環(huán)芳烴降解菌的菌量實(shí)現(xiàn)快速降解土壤中多環(huán)芳烴的目的。

附圖說(shuō)明

圖1、瓊脂糖凝膠電泳圖；

圖中：1、2、3、4分別對(duì)應(yīng)實(shí)施例1中引物組1、引物組2、引物組3和引物組4，土1為濟(jì)南土，土2為浙江土；

圖2、實(shí)時(shí)熒光定量pcr擴(kuò)增曲線(xiàn)圖；

圖3、實(shí)時(shí)熒光定量pcr熔解曲線(xiàn)圖；

圖4、實(shí)時(shí)熒光定量pcr標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)圖；

圖5、土壤中ppz-1數(shù)量變化圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例本發(fā)明的技術(shù)方案做進(jìn)一步說(shuō)明，但本發(fā)明所保護(hù)范圍不限于此。

生物材料來(lái)源

假單胞菌(psedomonassp.)ppz-1分離自多環(huán)芳烴污染土壤，保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，菌種保藏號(hào)cgmccno.12596；

土壤基因組dna抽提試劑盒購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司。

實(shí)施例1特異性基因序列的篩選與引物設(shè)計(jì)

根據(jù)菌株ppz-1基因組測(cè)序結(jié)果，將編碼基因分別在通用功能數(shù)據(jù)庫(kù)go(geneontology)、kegg(kyotoencyclopediaofgenesandgenomes)、cog(clusteroforthologousgroupsofproteins)、nr(non-redundantproteindatabase)、pfam和swiss-prot等進(jìn)行blast比對(duì)，篩選未注釋到的基因序列，這些序列即為該菌株可能的特異性基因序列；標(biāo)記為基因片段1、基因片段2、基因片段3、基因片段4。序列分別如seqidno.4、seqidno.1、seqidno.5和seqidno.6所示。

針對(duì)以上基因序列分別設(shè)計(jì)引物，基因片段1的引物記為引物組1，核苷酸序列如下所示：

f：tctccgccgcccagataa；r：tggatgtcccgttgaagc

基因片段2的引物記為引物組2，核苷酸序列如下所示：

f：gcgggaggtgttgctgtt；r：cctattgcccttgcgttc

基因片段3的引物記為引物組3，核苷酸序列如下所示：

f：cgggttatgggcagcaga；r：ggttggcaaacaggaagtca

基因片段4的引物記為引物組4，核苷酸序列如下所示：

f：ccctgagcagcgtgaaag；r：cattgcccaccgccatac

實(shí)施例2

分別利用上述引物對(duì)假單胞菌(psedomonassp.)ppz-1及2種多環(huán)芳烴污染土樣dna進(jìn)行pcr擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行觀察。

基因組dna采用土壤基因組dna抽提試劑盒進(jìn)行抽提制備模板dna。

所述pcr擴(kuò)增體系如下，總體系共25μl：

模板dna0.5μl；濃度10μm的引物f0.5μl；濃度10μm的引物r0.5μl；濃度10mm的dntp0.5μl；10×taqbuffer2.5μl；濃度25mm的mgcl22μl；濃度5u/μl的taq酶0.2μl；h2o18.3μl；

pcr反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性3min；94℃變性30s，57℃退火30s，72℃延伸30s，35個(gè)循環(huán)；72℃修復(fù)延伸8min。

電泳條件為：1.5wt％瓊脂糖凝膠，1×tae，150v，100ma，20min。

結(jié)果如圖1所示，1、2、3、4分別對(duì)應(yīng)上述引物組1、2、3、4，土1、土2分別為濟(jì)南土和浙江土。結(jié)果表明，引物組2具有較好的特異性。

對(duì)引物組2通過(guò)ncbiblast進(jìn)行了特異性檢驗(yàn)，無(wú)顯著匹配結(jié)果，表明該組引物在ncbi數(shù)據(jù)庫(kù)中是特異的，基因序列具體如下：

atgttctcccatgagtctcgcaggccccgtgccgggtgggtagtgacggttcacctctggtggcagatgcgtggaatgttggaccaagtggcgcacttccacttggaaaaattcatcagcgcaggtttgcgcgggtttttctcgggggcgggaggtgttgctgttcaggcagcgtgtttgttcggcgcgaacttgcagttcggtaattttgagggggtaatgcttcctgctaatcagttcgttgtaccctgcatcgttgccttgatagagttcagtgaacgcaagggcaataggccccgcacaatggttggccactttccctaccccgtcagtgtctag。

由上述基因序列設(shè)計(jì)的特異性引物序列為：

f：gcgggaggtgttgctgtt；seqidno.1

r：cctattgcccttgcgttc；seqidno.2

實(shí)施例3實(shí)時(shí)熒光定量pcr標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制備

構(gòu)建質(zhì)粒，10倍梯度稀釋構(gòu)建好的各質(zhì)粒，90μl稀釋液+10μl質(zhì)粒。

實(shí)時(shí)熒光定量pcr擴(kuò)增體系如下，總體系20μl：

2×sybrgreenqpcrmastermix10μl；10μm濃度的引物f0.4μl；10μm濃度的引物r0.4μl；ddh2o7.2μl；dna模板2μl。

實(shí)時(shí)熒光定量pcr反應(yīng)條件為：

95℃預(yù)變性3min；95℃變性15s，57℃退火20s，72℃延伸30s，45個(gè)循環(huán)。

梯度稀釋樣品擴(kuò)增曲線(xiàn)如圖2所示，從左到右標(biāo)準(zhǔn)品濃度依次為1.73×10⁸、1.73×10⁷、1.73×10⁶、1.73×10⁵、1.73×10⁴、1.73×10³copies/μl。

梯度稀釋樣品擴(kuò)增曲線(xiàn)如圖2所示，曲線(xiàn)較光滑，為典型s型，各循環(huán)ct值間隔均勻。

梯度稀釋樣品熔解曲線(xiàn)如圖3所示，曲線(xiàn)峰值單一，峰值在84.73℃。

標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)結(jié)果如圖4所示，縱坐標(biāo)是ct值；橫坐標(biāo)logco，logco是指log濃度即取濃度的對(duì)數(shù)，slope＝-3.365；

擴(kuò)增效率：e＝10^-1/斜率-1＝10^-1/-3.365-1＝98.233％；

相關(guān)系數(shù)：r²＝0.9999y-inter＝37.624。

實(shí)施例4

定量檢測(cè)多環(huán)芳烴污染土壤中降解菌假單胞菌(psedomonassp.)ppz-1數(shù)量

向多環(huán)芳烴污染土1(濟(jì)南土，sj)和土2(浙江土，sz)中分別投加活化后的ppz-1菌液并混合均勻，投加量分別為2×10⁹、2×10⁷、2×10⁵、2×10³cfu/g，樣品編號(hào)分別為0、2、4、6，同時(shí)設(shè)不加菌的土樣對(duì)照，記作ck。使用上海生工b618763磁珠法土壤基因組dna抽提試劑盒提取dna，將其稀釋適當(dāng)倍數(shù)上機(jī)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量pcr檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果如下：

表1土壤中ppz-1的數(shù)量

結(jié)果顯示該定量方法所檢測(cè)出的多環(huán)芳烴降解菌ppz-1的數(shù)量與理論投加量基本一致，且土壤背景中檢測(cè)不到該菌存在，說(shuō)明該檢測(cè)方法能較準(zhǔn)確地反映土壤中ppz-1的數(shù)量。

實(shí)施例5

定量方法在污染土壤生物修復(fù)過(guò)程中的應(yīng)用

從濟(jì)南農(nóng)田中采集土樣，按重量比0.1％加入菲，混勻。添加氮磷肥料，調(diào)節(jié)污染土壤的碳、氮、磷的摩爾比為(100-120)：(5-10)：1，調(diào)整土壤含水率至20-50％，疏松土壤，按10⁹cfu/g土的比例加入外源降解菌劑，混合均勻。隔周翻攪一次，維持土壤含水率20-50％。同時(shí)設(shè)置自然衰減對(duì)照(不添加肥料，不添加外源降解菌劑)。每周檢測(cè)外源降解菌的數(shù)量及菲殘留量。

按照如下處理方法進(jìn)行處理：

處理一：當(dāng)外源降解菌數(shù)量低于初始投加量2個(gè)數(shù)量級(jí)時(shí)，補(bǔ)加與初始劑量相同的菌劑；

處理二：不補(bǔ)加菌劑。

經(jīng)過(guò)2個(gè)月的修復(fù)，處理一的菲去除率為91.5％，處理二的菲去除率為73.2％。2個(gè)月間土壤中外源菌數(shù)量變化見(jiàn)圖5。

結(jié)果分析

圖5顯示，ppz-1在投加入土壤之后，數(shù)量有緩慢下降趨勢(shì)，在第6周時(shí)，數(shù)量由初始的2.0e+09降至3.2e+07，此時(shí)處理一補(bǔ)加ppz-1(2.0e+09cfu/g土)強(qiáng)化修復(fù)，處理二未補(bǔ)加。修復(fù)至第8周，處理一的菲去除率比處理二高出18.3％。在修復(fù)過(guò)程中對(duì)投加的外源降解菌進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，可以通過(guò)及時(shí)補(bǔ)加保證外源降解菌數(shù)量維持在較高水平，從而在相同修復(fù)時(shí)間內(nèi)使外源菌發(fā)揮最大效果，獲得更高的污染物去除率，而在其他節(jié)點(diǎn)投加效果均較差，無(wú)法達(dá)到較處理二高出18.3％的技術(shù)效果。

sequencelisting

<110>山東省科學(xué)院生態(tài)研究所

<120>一種多環(huán)芳烴污染土壤中外源降解菌的施加方法

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