本發(fā)明屬于生物提取領(lǐng)域，具體涉及一種從虎杖中提取高含量白藜蘆醇的方法。

背景技術(shù)：

白藜蘆醇是多酚類化合物，主要來(lái)源于花生、葡萄(紅葡萄酒)、虎杖、桑椹等植物。白藜蘆醇是一種生物性很強(qiáng)的天然多酚類物質(zhì)，又稱為芪三酚，是腫瘤的化學(xué)預(yù)防劑，也是對(duì)降低血小板聚集，預(yù)防和治療動(dòng)脈粥樣硬化、心腦血管疾病的化學(xué)預(yù)防劑。在虎杖提取物中含有較多的白藜蘆醇，因此經(jīng)常地被作為一種有效的白藜蘆醇的來(lái)源進(jìn)行使用。

白藜蘆醇化學(xué)名稱為(e)-3，5，4-三羥基二苯乙烯。它是非黃酮類的多酚化合物，為白色針狀晶體，難溶于水，易溶于乙醚、氯仿、甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯等有機(jī)溶劑，在波長(zhǎng)365nm的紫外光照射下能產(chǎn)生熒光，并能和三氯化鐵-鐵氰化鉀起顯色反應(yīng)。

英文名resveratrol，cas號(hào)：501-36-0，分子式：c14h12o3，分子量：228.24，熔點(diǎn)：253-255℃。

白藜蘆醇是一種天然的抗氧化劑，可降低血液粘稠度，抑制血小板凝結(jié)和血管舒張，保持血液暢通，可預(yù)防癌癥的發(fā)生及發(fā)展，具有抗動(dòng)脈粥樣硬化和冠心病，缺血性心臟病，高血脂的防治作用。抑制腫瘤的作用還具有雌激素樣作用，可用于治療乳腺癌等疾病。

20世紀(jì)90年代，中國(guó)科技工作者對(duì)白藜蘆醇的研究不斷深入，并揭示其藥理作用:抑制血小板非正常凝聚，預(yù)防心肌硬塞、腦栓塞，對(duì)缺氧心臟有保護(hù)作用，對(duì)肥胖者可以起一個(gè)控制與減肥作用，對(duì)燒傷或失血性休克引起的心輸出量下降有效恢復(fù)，并能夠擴(kuò)張動(dòng)脈血管及改善微循環(huán)。

1998年美國(guó)艾爾·敏德爾編撰《抗衰老圣典》時(shí)，將白藜蘆醇列為"100種最熱門有效抗衰老物質(zhì)"之一；白藜蘆醇保健食品將會(huì)成為21世紀(jì)營(yíng)養(yǎng)健康的新時(shí)尚。

白藜蘆醇的主要來(lái)源是從天然植物中提取，國(guó)內(nèi)一直是以虎杖、葡萄等植物為原料，國(guó)外主要是以虎杖等為原料。

目前對(duì)白藜蘆醇的提取方法主要有：

1、醇提法:多采用乙醇回流提取或索氏提取。張建超等利用正交設(shè)計(jì)確定了醇提最優(yōu)條件為:95%乙醇15倍量，回流提取3次，2h/次。也有用50%乙醇或甲醇提取的。該法簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)，但醇提出來(lái)的產(chǎn)品，顏色深，白藜蘆醇含量低。

2、水提法:取虎杖粗粉水煎，過(guò)濾.濃縮。用95%乙醇溶解過(guò)濾，除雜，回收乙醇。用乙酸乙酯萃取4次，合并萃取液。減壓回收乙酸乙酯至浸膏狀，用稀乙醇溶解，放置，過(guò)濾，析出物即為白藜蘆醇。該法操作簡(jiǎn)單，但得到的白藜蘆醇純度不高，且收率低。

3、薄層色譜法:采用此法可將白藜蘆醇苷與虎杖中其他蒽醌類成分有效分離。薄層條件:流動(dòng)相:3十六烷三甲基溴化銨水溶液(ctab)一乙酰丙酮(8:1.4)的微堿性溶液;固定相:聚酰胺鋪板。取虎杖藥粉置錐形瓶中，加入95乙醇適量，浸漬數(shù)小時(shí)，取乙醇液點(diǎn)于聚酰胺板上，以上述展開劑上行展開，即可分離出白藜蘆醇苷該法得率較低，且使用有毒金屬鉛，會(huì)給環(huán)境帶來(lái)嚴(yán)重污染。

4、超臨界流體技術(shù):曹庸等采用超臨界co。流體技術(shù)對(duì)虎杖中自藜蘆醇進(jìn)行萃取，獲得了初步萃取條件。該技術(shù)具有萃取能力強(qiáng)、提取率高、操作溫度低、提取時(shí)間快，流程簡(jiǎn)單，操作方便、清潔等優(yōu)點(diǎn)，代表了以后白藜蘆醇乃至中藥提取工藝的發(fā)展方向。該法綜合成本低，污染小，但目前僅限于實(shí)驗(yàn)室規(guī)模提取。

5、人工合成法：以3，5一二羥基苯甲醇為起始原料，經(jīng)甲基化、溴代、arbuzov重排反應(yīng)得到中間體3，5一二甲氧基芐基磷酸酯，再與茴香醛經(jīng)wittig-horner縮合及脫甲基化5步反應(yīng)得到白藜蘆醇。

也有人以大茴香醇為原料，經(jīng)溴代，arbuzov重排反應(yīng)得到中間體對(duì)甲氧基芐基磷酸酯，再與3，5一二甲氧基苯甲醛經(jīng)過(guò)wittig-horner縮合反應(yīng)及脫甲基化4步反應(yīng)合成反式產(chǎn)物白藜蘆醇。該法產(chǎn)量大，但易造成環(huán)境污染，環(huán)保壓力大。

因此，總的來(lái)說(shuō)，以上常用的提取白藜蘆醇的方法，都能有效提取白藜蘆醇，但是卻無(wú)法有效轉(zhuǎn)化白藜蘆醇苷，造成資源的極大的浪費(fèi)和生產(chǎn)成本的增加，另外還存在提取時(shí)間長(zhǎng)、提取率低、產(chǎn)品中白藜蘆醇含量低的問(wèn)題。在以上研究的基礎(chǔ)上，取長(zhǎng)補(bǔ)短，從虎杖中提取純化白藜蘆醇，建立一種易于產(chǎn)業(yè)化、清潔環(huán)保的綠色工藝是非常有必要的。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種從虎杖中提取高含量白藜蘆醇的方法，本發(fā)明白藜蘆醇提取率高，且含量高，綠色環(huán)保，利于工業(yè)化生產(chǎn)。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下的技術(shù)方案：

一種從虎杖中提取高含量白藜蘆醇的方法，包括以下步驟：

（1）粉碎：將虎杖粉碎過(guò)10～20目篩，得到虎杖粗粉；

（2）酶解、提取、濃縮：按照質(zhì)量比1:2～4將虎杖粗粉加入水中，先高速剪切15～20min，再高頻電磁波處理10～15min，然后加入相當(dāng)于虎杖粗粉質(zhì)量0.4～0.6%的阿魏酸酯酶；再用摩爾濃度為0.1mol/l的鹽酸溶液調(diào)節(jié)ph=5～6，水浴加熱至35～40℃，酶解24～48h，雙頻超聲波交替處理15～25min后加入相當(dāng)于虎杖粗粉質(zhì)量10～15倍的體積分?jǐn)?shù)為80%的乙醇溶液，回流提取1～2h，濾出提取液，按照料液比1:10～15將濾渣加入體積分?jǐn)?shù)為80%的乙醇溶液中，高頻電磁波處理15～20min，再回流提取2～3h，濾出提取液，合并兩次提取液，濃縮至相當(dāng)于虎杖投料量的2～6倍；

（3）酶解：向步驟（2）制得的濃縮液中加入相當(dāng)于濃縮液質(zhì)量0.3～0.5%的β-葡萄糖苷酶和0.2～0.4%的纖維素酶，高頻電磁波處理10～15min，再水浴加熱至40～45℃，攪拌酶解24～72h，得酶解液；

（4）離心分離：將步驟（3）反應(yīng)好的酶解液離心分離，取沉淀加入相當(dāng)于沉淀質(zhì)量10～20倍的體積分?jǐn)?shù)為70～95%的乙醇溶液中，水浴加熱至50～60℃，攪拌至沉淀完全溶解，過(guò)濾，得乙醇溶解液；

（5）上中性氧化鋁脫色純化：將步驟（4）制得的乙醇溶解液過(guò)100～200目的中性氧化鋁，控制流速為0.6～0.8ml/min，得脫色純化液；

（6）活性炭脫色、濃縮結(jié)晶：向脫色純化液中加入相當(dāng)于脫色純化液質(zhì)量0.4～0.6%的活性炭，回流攪拌脫色2～4h，冷卻過(guò)濾，濾液濃縮至最小體積，冷卻至常溫，結(jié)晶12～24h；

（7）離心、重結(jié)晶：將步驟（6）得到的結(jié)晶粗品離心，沉淀粗品用乙酸乙酯重結(jié)晶2～3次；

（8）過(guò)濾：將步驟（7）重結(jié)晶好的物料用布氏漏斗過(guò)濾，得白藜蘆醇精品濕品沉淀；

（9）干燥：將白藜蘆醇精品濕品沉淀放入烘箱干燥，干燥溫度為70～80℃，干燥時(shí)間為12～24h；

（10）粉碎過(guò)篩：將干燥的白藜蘆醇精品粉碎，過(guò)80～100目篩，得白藜蘆醇成品。

步驟（2）中所述高速剪切的轉(zhuǎn)速為6000～8000r/min。

步驟（2）中所述高頻電磁波處理中電磁波頻率為2400～2500mhz，功率為10～20kw。

步驟（2）中所述雙頻超聲波交替處理中雙頻超聲波交替頻率為40～50khz/20～30khz，雙頻超聲波交替工作時(shí)間為3～6s，超聲波功率密度150～200w/l。

步驟（3）中所述高頻電磁波處理中電磁波頻率為2000～2200mhz，功率為15～25kw。

本發(fā)明的有益效果：

本發(fā)明在提取之前先采用阿魏酸酯酶結(jié)合高速剪切和高頻電磁波對(duì)虎杖粗粉進(jìn)行處理，不僅可以破碎虎杖的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，還可以切斷木質(zhì)素和半纖維素的交聯(lián)架構(gòu)，有利于虎杖細(xì)胞內(nèi)有效成分的溶出，提取過(guò)程中采用雙頻超聲波交替處理和高頻電磁波處理，可以進(jìn)一步促進(jìn)虎杖細(xì)胞內(nèi)有效成分的溶出；提取液再采用β-葡萄糖苷酶和纖維素酶兩種酶配合高頻電磁波進(jìn)行處理，可有效低將白藜蘆醇苷轉(zhuǎn)化為白藜蘆醇，顯著提高虎杖中白藜蘆醇的提取率。將得到的酶解物先后經(jīng)離心分離、中性氧化鋁脫色純化、活性炭脫色、濃縮結(jié)晶、再結(jié)晶等工藝，可以顯著提高成品白藜蘆醇的含量。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1

一種從虎杖中提取高含量白藜蘆醇的方法，包括以下步驟：

（1）粉碎：將虎杖粉碎過(guò)10目篩，得到虎杖粗粉；

（2）酶解、提取、濃縮：按照質(zhì)量比1:2將虎杖粗粉加入水中，先在轉(zhuǎn)速為8000r/min的條件下高速剪切15min，再在電磁波頻率為2500mhz，功率為20kw的條件下高頻電磁波處理10min，然后加入相當(dāng)于虎杖粗粉質(zhì)量0.4%的阿魏酸酯酶；再用摩爾濃度為0.1mol/l的鹽酸溶液調(diào)節(jié)ph=5，水浴加熱至35℃，酶解48h，在雙頻超聲波交替頻率為50khz/30khz，雙頻超聲波交替工作時(shí)間為3s，超聲波功率密度200w/l的條件下雙頻超聲波交替處理15min后加入相當(dāng)于虎杖粗粉質(zhì)量10倍的體積分?jǐn)?shù)為80%的乙醇溶液，回流提取1h，濾出提取液，按照料液比1:10將濾渣加入體積分?jǐn)?shù)為80%的乙醇溶液中，在電磁波頻率為2500mhz，功率為20kw的條件下高頻電磁波處理15min，再回流提取2h，濾出提取液，合并兩次提取液，濃縮至相當(dāng)于虎杖投料量的2倍；

（3）酶解：向步驟（2）制得的濃縮液中加入相當(dāng)于濃縮液質(zhì)量0.3%的β-葡萄糖苷酶和0.2%的纖維素酶，在電磁波頻率為2200mhz，功率為25kw的條件下高頻電磁波處理10min，再水浴加熱至40℃，攪拌酶解72h，得酶解液；

（4）離心分離：將步驟（3）反應(yīng)好的酶解液離心分離，取沉淀加入相當(dāng)于沉淀質(zhì)量10倍的體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇溶液中，水浴加熱至50℃，攪拌至沉淀完全溶解，過(guò)濾，得乙醇溶解液；

（5）上中性氧化鋁脫色純化：將步驟（4）制得的乙醇溶解液過(guò)100目的中性氧化鋁，控制流速為0.6ml/min，得脫色純化液；

（6）活性炭脫色、濃縮結(jié)晶：向脫色純化液中加入相當(dāng)于脫色純化液質(zhì)量0.4%的活性炭，回流攪拌脫色2h，冷卻過(guò)濾，濾液濃縮至最小體積，冷卻至常溫，結(jié)晶12h；

（7）離心、重結(jié)晶：將步驟（6）得到的結(jié)晶粗品離心，沉淀粗品用乙酸乙酯重結(jié)晶2次；

（8）過(guò)濾：將步驟（7）重結(jié)晶好的物料用布氏漏斗過(guò)濾，得白藜蘆醇精品濕品沉淀；

（9）干燥：將白藜蘆醇精品濕品沉淀放入烘箱干燥，干燥溫度為70℃，干燥時(shí)間為24h；

（10）粉碎過(guò)篩：將干燥的白藜蘆醇精品粉碎，過(guò)80目篩，得白藜蘆醇成品。

上述實(shí)施例白藜蘆醇提取率為為1.714%，hplc分析成品中白藜蘆醇含量為98.13%。

實(shí)施例2

一種從虎杖中提取高含量白藜蘆醇的方法，包括以下步驟：

（1）粉碎：將虎杖粉碎過(guò)15目篩，得到虎杖粗粉；

（2）酶解、提取、濃縮：按照質(zhì)量比1:3將虎杖粗粉加入水中，先在轉(zhuǎn)速為7000r/min的條件下高速剪切18min，再在電磁波頻率為2450mhz，功率為15kw的條件下高頻電磁波處理12min，然后加入相當(dāng)于虎杖粗粉質(zhì)量0.5%的阿魏酸酯酶；再用摩爾濃度為0.1mol/l的鹽酸溶液調(diào)節(jié)ph=5.5，水浴加熱至38℃，酶解36h，在雙頻超聲波交替頻率為45khz/25khz，雙頻超聲波交替工作時(shí)間為4s，超聲波功率密度180w/l的條件下雙頻超聲波交替處理20min后加入相當(dāng)于虎杖粗粉質(zhì)量12倍的體積分?jǐn)?shù)為80%的乙醇溶液，回流提取1.5h，濾出提取液，按照料液比1:12將濾渣加入體積分?jǐn)?shù)為80%的乙醇溶液中，在電磁波頻率為2450mhz，功率為15kw的條件下高頻電磁波處理18min，再回流提取2.5h，濾出提取液，合并兩次提取液，濃縮至相當(dāng)于虎杖投料量的4倍；

（3）酶解：向步驟（2）制得的濃縮液中加入相當(dāng)于濃縮液質(zhì)量0.4%的β-葡萄糖苷酶和0.3%的纖維素酶，在電磁波頻率為2100mhz，功率為20kw高頻電磁波處理12min，再水浴加熱至42℃，攪拌酶解48h，得酶解液；

（4）離心分離：將步驟（3）反應(yīng)好的酶解液離心分離，取沉淀加入相當(dāng)于沉淀質(zhì)量15倍的體積分?jǐn)?shù)為80%的乙醇溶液中，水浴加熱至55℃，攪拌至沉淀完全溶解，過(guò)濾，得乙醇溶解液；

（5）上中性氧化鋁脫色純化：將步驟（4）制得的乙醇溶解液過(guò)150目的中性氧化鋁，控制流速為0.7ml/min，得脫色純化液；

（6）活性炭脫色、濃縮結(jié)晶：向脫色純化液中加入相當(dāng)于脫色純化液質(zhì)量0.5%的活性炭，回流攪拌脫色3h，冷卻過(guò)濾，濾液濃縮至最小體積，冷卻至常溫，結(jié)晶18h；

（7）離心、重結(jié)晶：將步驟（6）得到的結(jié)晶粗品離心，沉淀粗品用乙酸乙酯重結(jié)晶3次；

（8）過(guò)濾：將步驟（7）重結(jié)晶好的物料用布氏漏斗過(guò)濾，得白藜蘆醇精品濕品沉淀；

（9）干燥：將白藜蘆醇精品濕品沉淀放入烘箱干燥，干燥溫度為75℃，干燥時(shí)間為18h；

（10）粉碎過(guò)篩：將干燥的白藜蘆醇精品粉碎，過(guò)90目篩，得白藜蘆醇成品。

上述實(shí)施例白藜蘆醇提取率為為1.753%，hplc分析成品中白藜蘆醇含量為98.51%。

實(shí)施例3

一種從虎杖中提取高含量白藜蘆醇的方法，包括以下步驟：

（1）粉碎：將虎杖粉碎過(guò)20目篩，得到虎杖粗粉；

（2）酶解、提取、濃縮：按照質(zhì)量比1:4將虎杖粗粉加入水中，先在轉(zhuǎn)速為8000r/min的條件下高速剪切15min，再在電磁波頻率為2400mhz，功率為10kw的條件下高頻電磁波處理15min，然后加入相當(dāng)于虎杖粗粉質(zhì)量0.6%的阿魏酸酯酶；再用摩爾濃度為0.1mol/l的鹽酸溶液調(diào)節(jié)ph=6，水浴加熱至40℃，酶解24h，在雙頻超聲波交替頻率為40khz/20khz，雙頻超聲波交替工作時(shí)間為6s，超聲波功率密度150w/l的條件下雙頻超聲波交替處理25min后加入相當(dāng)于虎杖粗粉質(zhì)量15倍的體積分?jǐn)?shù)為80%的乙醇溶液，回流提取2h，濾出提取液，按照料液比1:15將濾渣加入體積分?jǐn)?shù)為80%的乙醇溶液中，在電磁波頻率為2400mhz，功率為10kw的條件下高頻電磁波處理20min，再回流提取3h，濾出提取液，合并兩次提取液，濃縮至相當(dāng)于虎杖投料量的6倍；

（3）酶解：向步驟（2）制得的濃縮液中加入相當(dāng)于濃縮液質(zhì)量0.5%的β-葡萄糖苷酶和0.4%的纖維素酶，在電磁波頻率為2000mhz，功率為15kw高頻電磁波處理15min，再水浴加熱至45℃，攪拌酶解24h，得酶解液；

（4）離心分離：將步驟（3）反應(yīng)好的酶解液離心分離，取沉淀加入相當(dāng)于沉淀質(zhì)量20倍的體積分?jǐn)?shù)為95%的乙醇溶液中，水浴加熱至60℃，攪拌至沉淀完全溶解，過(guò)濾，得乙醇溶解液；

（5）上中性氧化鋁脫色純化：將步驟（4）制得的乙醇溶解液過(guò)200目的中性氧化鋁，控制流速為0.8ml/min，得脫色純化液；

（6）活性炭脫色、濃縮結(jié)晶：向脫色純化液中加入相當(dāng)于脫色純化液質(zhì)量0.6%的活性炭，回流攪拌脫色4h，冷卻過(guò)濾，濾液濃縮至最小體積，冷卻至常溫，結(jié)晶24h；

（7）離心、重結(jié)晶：將步驟（6）得到的結(jié)晶粗品離心，沉淀粗品用乙酸乙酯重結(jié)晶3次；

（8）過(guò)濾：將步驟（7）重結(jié)晶好的物料用布氏漏斗過(guò)濾，得白藜蘆醇精品濕品沉淀；

（9）干燥：將白藜蘆醇精品濕品沉淀放入烘箱干燥，干燥溫度為80℃，干燥時(shí)間為12h；

（10）粉碎過(guò)篩：將干燥的白藜蘆醇精品粉碎，過(guò)100目篩，得白藜蘆醇成品。

上述實(shí)施例白藜蘆醇提取率為為1.725%，hplc分析成品中白藜蘆醇含量為98.28%。