一種可提高虎杖愈傷組織中白藜蘆醇含量的培養(yǎng)液及培養(yǎng)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種可提高虎杖愈傷組織中白藜蘆醇含量的 培養(yǎng)液及培養(yǎng)方法。 技術(shù)背景
[0002] 白藜蘆醇(resveratrol，簡稱Res)是一種含有芪類結(jié)構(gòu)的非黃酮多酚化合物，化 學(xué)名稱為3，4，5-三羥基二苯乙烯（亦稱芪三酚），它廣泛存在于虎杖、花生、葡萄、黎蘆等多 種天然植物或果實中，目前已在21個科31個屬的72種植物中被發(fā)現(xiàn)，其中以虎杖根莖部位 中含量最為豐富。
[0003] 白藜蘆醇具有抗癌、抗腫瘤、抗心血管疾病、抗炎、抗氧化等多種功能，被廣泛應(yīng)用 于醫(yī)藥以及食品保健等行業(yè)中。在化妝品行業(yè)中，白藜蘆醇則發(fā)揮其捕獲自由基、抗氧化和 抑制絡(luò)氨酸酶活性的特性。市售的白黎蘆醇主要從野生虎杖根莖中提取而得，但植物提取 技術(shù)面臨成本高、工藝復(fù)雜、得率低，植物資源有限等問題。此外，白黎蘆醇是在植物受到異 常刺激時才會產(chǎn)生的一種次生代謝產(chǎn)物，所以天然植物資源中白黎蘆醇的含量極低，有限 的天然植物資源根本無法滿足日益增長的市場需求。
[0004] 近年來，隨著生物技術(shù)的迅猛發(fā)展，許多學(xué)者將研究目光轉(zhuǎn)向于利用植物組織培 養(yǎng)來獲得高產(chǎn)量白藜蘆醇。此法可大大加快植物細(xì)胞的生長，提高目標(biāo)物質(zhì)的含量，并且不 受地理、季節(jié)和氣候條件的限制，能節(jié)省野生植物和土地資源，具有生長周期短，經(jīng)濟(jì)效益 顯著等優(yōu)點(diǎn)?，F(xiàn)階段的研究熱點(diǎn)主要集中在解決愈傷組織誘導(dǎo)過程中出愈率不高這一問題 上，而關(guān)于增加白藜蘆醇產(chǎn)量的研究尚處起步階段。誘導(dǎo)子是一類可以引起代謝途徑改變 或代謝強(qiáng)度改變的物質(zhì)。文獻(xiàn)表明，誘導(dǎo)子可誘發(fā)植物產(chǎn)生植物抗毒素，在植物次生代謝的 調(diào)控及其細(xì)胞內(nèi)信息傳遞等方面具有重要作用。但針對誘導(dǎo)虎杖愈傷組織產(chǎn)生白藜蘆醇這 方面的研究工作來說，已被證實有效的誘導(dǎo)子種類并不多，僅有紫外線、真菌誘導(dǎo)子、茉莉 酸及其衍生物、水楊酸等少數(shù)幾種。文濤等人研究了光照強(qiáng)度對虎杖愈上組織中白藜蘆醇 積累的影響，結(jié)果表明，弱光更利于白藜蘆醇的生成，弱光培養(yǎng)的莖愈傷組織干樣中白藜蘆 醇含量達(dá)到140.074 yg/g;李卓璽選用黑曲霉與反-香豆酸對虎杖愈傷組織進(jìn)行誘導(dǎo)，最優(yōu) 條件下，愈傷組織中白藜蘆醇含量為264.58 yg/g;杜坤玉則發(fā)現(xiàn)殼聚糖對白藜蘆醇的合成 有促進(jìn)作用，當(dāng)殼聚糖濃度為50 mg/L時，愈傷組織中白藜蘆醇含量最高，達(dá)到256.56 yg/ g。在現(xiàn)有報道中，經(jīng)特定誘導(dǎo)子處理后白藜蘆醇占愈傷組織細(xì)胞干重的0.01~0.03%，仍無 法滿足市場需求，因此，尋找一種高效的誘導(dǎo)子以提高白藜蘆醇的含量成為亟待解決的問 題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供一種可提高虎杖愈傷組織中白藜蘆醇含量的培養(yǎng)液及培 養(yǎng)方法。
[0006] 一種可提高虎杖愈傷組織中白藜蘆醇含量的培養(yǎng)液，其特征在于:在MS基礎(chǔ)培養(yǎng) 基中添加6-芐氨基嘌呤(6-BA)、6-糖基氨基嘌呤(KT)、萘乙酸(NAA)、精胺、亞精胺、鹿糖，添 加后所述6-芐氨基嘌呤的濃度為0.5~1.8 mg/L，所述6-糖基氨基嘌呤的濃度為0.3~1.0 mg/L，所述萘乙酸的濃度為0 · 15~0 · 45 mg/L，所述精胺的濃度為1 · 0~4 · 5 mg/L，所述亞精胺 的濃度為〇 · 5~1 · 25 mg/L，所述蔗糖濃度為20~50g/L;培養(yǎng)液pH為5~6。
[0007] -種可提高虎杖愈傷組織中白藜蘆醇含量的培養(yǎng)方法，其特征在于采用以下步 驟： A、 虎杖愈傷組織的誘導(dǎo):選擇虎杖莖段為外植體，在培養(yǎng)基中暗光(0 lx)培養(yǎng)25天，誘 導(dǎo)出愈傷組織，每20天繼代一次，繼代培養(yǎng)3次;所述培養(yǎng)基為MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加6-芐氨 基嘌呤、6-糖基氨基嘌呤、萘乙酸、精胺、亞精胺、蔗糖而成，所述培養(yǎng)基中6-芐氨基嘌呤濃 度為1.0 mg/L，6-糖基氨基嘌呤濃度為0.5 mg/L，萘乙酸濃度為0.2 mg/L，蔗糖濃度為30 g/L，瓊脂濃度為8 g/L，培養(yǎng)基pH 5.8,培養(yǎng)溫度25±1 °C; B、 愈傷組織懸浮擴(kuò)大培養(yǎng)及次生代謝產(chǎn)物白藜蘆醇的誘導(dǎo)：以步驟A中獲得的生長旺 盛、疏松、易散的愈傷組織為懸浮培養(yǎng)體系的種子細(xì)胞，將其接種在一種可提高虎杖愈傷組 織中白藜蘆醇含量的培養(yǎng)液中進(jìn)行懸浮擴(kuò)大培養(yǎng)，接種量為60~110 g/L，g/L=愈傷組織鮮 重/培養(yǎng)基體積，得到含有愈傷組織的培養(yǎng)液;所述一種可提高虎杖愈傷組織中白藜蘆醇含 量的培養(yǎng)液是含有0.5~1.8 mg/L 6-芐氨基嘌呤、0.3~1.0 mg/L 6-糖基氨基嘌呤、0.15~ 0.45 mg/L萘乙酸、1.0~4.5 mg/L精胺、0.5~1.25 mg/L亞精胺、20~50g/L蔗糖的MS培養(yǎng)液， 培養(yǎng)液pH為5~6;對所得含有愈傷組織的培養(yǎng)液進(jìn)行誘導(dǎo)懸浮培養(yǎng)，誘導(dǎo)懸浮培養(yǎng)的條件 為:振蕩培養(yǎng)，搖床轉(zhuǎn)速90~130 rpm，光照強(qiáng)度1280~1760 lx，光照時間12~16 h/day，培養(yǎng) 溫度25±1 °C，培養(yǎng)過程中每天向培養(yǎng)液中充入清潔無菌空氣一次;每12~16天繼代培養(yǎng)一 次，繼代培養(yǎng)2~4次后將繼代周期縮短至6~10天，縮短繼代周期后繼續(xù)培養(yǎng)3~5代;在誘導(dǎo)懸 浮培養(yǎng)繼代周期的第4~8天，繼代周期縮短后則在第2~5天時加入甲瓦龍酸內(nèi)酯，甲瓦龍酸 內(nèi)酯在培養(yǎng)液中的終濃度為50~120 mg/L，誘導(dǎo)懸浮培養(yǎng)結(jié)束后得到白藜蘆醇含量高的虎 杖愈傷組織細(xì)胞。
[0008] 經(jīng)過測定，由本發(fā)明培養(yǎng)液及培養(yǎng)方法培養(yǎng)的虎杖愈傷組織細(xì)胞，與現(xiàn)有培養(yǎng)基 相比，在相同培養(yǎng)周期內(nèi)，白藜蘆醇的含量可達(dá)細(xì)胞干重的0.12~0.18%，與目前已報道的植 物組織培養(yǎng)方式相比，含量提升4~18倍，本發(fā)明具有提高虎杖愈傷組織中白藜蘆醇的含量 的有益效果。
[0009] 本發(fā)明提供一種可提高虎杖愈傷組織中白藜蘆醇含量的培養(yǎng)液及培養(yǎng)方法。本發(fā) 明的優(yōu)點(diǎn)為：1)在次生代謝產(chǎn)物積累過程即懸浮細(xì)胞培養(yǎng)階段的特定時期，加入非生物誘 導(dǎo)子甲瓦龍酸內(nèi)酯進(jìn)行誘導(dǎo)，可增強(qiáng)白藜蘆醇在植物細(xì)胞中合成的關(guān)鍵酶一一苯丙氨酸裂 解酶(PAL)的活性，從而刺激白藜蘆醇的生成和不斷積累；2)培養(yǎng)液中精胺、亞精胺的加入 可促進(jìn)虎杖細(xì)胞的增殖，延長細(xì)胞的指數(shù)生長期與直線生長期，與現(xiàn)有培養(yǎng)基相比，在相同 培養(yǎng)周期內(nèi)，細(xì)胞生物量(每單位體積培養(yǎng)基的細(xì)胞干重，g/L)增加62%~88%，從而進(jìn)一步提 高白藜蘆醇的產(chǎn)量。本發(fā)明方法具有操作簡單、高效天然、快速穩(wěn)定、經(jīng)濟(jì)環(huán)保等優(yōu)點(diǎn)。
【具體實施方式】
[0010]下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明做進(jìn)一步說明，但本發(fā)明并不局限于以下實施例。
[0011] 實施例1: 一種可提高虎杖愈傷組織中白藜蘆醇含量的培養(yǎng)方法，采用以下步驟： A、 外植體材料選取與預(yù)處理:選擇苗齡為一周左右生長茁壯的虎杖莖段為外植體。先 將虎杖的莖剪成5~10 cm的莖段，流水沖洗2~3 h，將莖放置到已滅菌的超凈工作臺上，用無 菌水浸泡10 min，然后用75%乙醇一水溶液浸泡消毒30 s，無菌水沖洗2~3次，再用10% NaCIO溶液消毒5 min，最后用無菌水浸泡材料3次，時間分別為10 min，5 min，3 min，放在 無菌濾紙上晾干;用刀切除莖段兩端的舊切面，剪成0. 5X0. 5 cm左右的小段備用； B、 虎杖愈傷組織的誘導(dǎo):將步驟A中已消毒的外植體接入固體培養(yǎng)基，培養(yǎng)基組成為MS 培養(yǎng)基+1.0 mg/L 6-BA + 0.5 mg/L KT +0.2 mg/L NAA，30 g/L蔗糖，8 g/L瓊脂，pH 5.8， 溫度25 ± 1 °C，在暗光(0 lx)下培養(yǎng)25天，誘導(dǎo)出愈傷組織;選擇質(zhì)地疏松、顏色淡黃的新 鮮愈傷組織進(jìn)行繼代培養(yǎng)，每20天繼代一次，在相同固體培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)3次； C、 愈傷組織懸浮擴(kuò)大培養(yǎng):與次生代謝產(chǎn)物白藜蘆醇的誘導(dǎo)：以步驟B中繼代3次后獲 得的生長旺盛、疏松、易散的愈傷組織為懸浮培養(yǎng)體系的種子細(xì)胞，將其接種在懸浮細(xì)胞培 養(yǎng)液中（配方見附表2)，接種量為65 g/L，g/L=愈傷組織鮮重/培養(yǎng)基體積;將接種完成的懸 浮細(xì)胞培養(yǎng)基進(jìn)行懸浮振蕩培養(yǎng)，搖床轉(zhuǎn)速90 rpm，光照強(qiáng)度1340 lx，光照時間16 h/day， 培養(yǎng)溫度25±1 °C，培養(yǎng)過程中每天向培養(yǎng)液中充入清潔無菌空氣一次。每14天繼代培養(yǎng) 一次，并在懸浮培養(yǎng)周期的第4天于懸浮細(xì)胞培養(yǎng)液中加入甲瓦龍酸內(nèi)酯，使其終濃度為75 mg/L，繼代培養(yǎng)2次后將繼代周期縮短至8天，繼續(xù)培養(yǎng)4代，此時甲瓦龍酸內(nèi)酯的加入時間 為培養(yǎng)周期的第3天。懸浮細(xì)胞培養(yǎng)液即為可提高虎杖愈傷組織中白藜蘆醇含量的培養(yǎng)液。
[0012] 培養(yǎng)結(jié)束后，用高效液相色譜(HPLC)測定白藜蘆醇含量，結(jié)果表明白藜蘆醇含量 占細(xì)胞干重的0.172%。
[0013] 實施例2: 一種可提高虎杖愈傷組織中白藜蘆醇含量的培養(yǎng)方法，采用以下步驟： A、 外植體材料選取與預(yù)處理:選擇苗齡為一周左右生長茁壯的虎杖莖段為外植體。先 將虎杖的莖剪成5~10 cm的莖段，流水沖洗2~3 h，將莖放置到已滅菌的超凈工作臺上，用無 菌水浸泡10 min，然后用75%乙醇一水溶液浸泡消毒30 s，無菌水沖洗2~3次，再用10% NaCIO溶液消毒5 min，最后用無菌水浸泡材料3次，時間分別為10 min，5 min，3 min，放在 無菌濾紙上晾干;用刀切除莖段兩端的舊切面，剪成0. 5X0. 5 cm左右的小段備用； B、 虎杖愈傷組織的誘導(dǎo):將步驟A中已消毒的外植體接入固體培養(yǎng)基，培養(yǎng)基組成為MS 培養(yǎng)基+1.0 mg/L 6-BA + 0.5 mg/L KT +0.2 mg/L NAA，30 g/L蔗糖，8 g/L瓊脂，pH 5.8， 溫度25 ± 1 °C，在暗光(0 lx)下培養(yǎng)25天，誘導(dǎo)出愈傷組織。選擇質(zhì)地疏松、顏色淡黃的新 鮮愈傷組織進(jìn)行繼代培養(yǎng)，每20天繼代一次，在相同固體培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)3次； C、 愈傷組織懸浮擴(kuò)大培養(yǎng)與次生代謝產(chǎn)物白藜蘆醇的誘導(dǎo)：以步驟B中繼代3次后獲得 的生長旺盛、疏松、易散的愈傷組織為懸浮培養(yǎng)體系的種子細(xì)胞，將其接種在懸浮細(xì)胞培養(yǎng) 液中（配方見附表3)，接種量為80 g/L(愈傷組織鮮重/培養(yǎng)基體積）。將接種完成的懸浮細(xì) 胞培養(yǎng)基進(jìn)行懸浮振蕩培養(yǎng)，搖床轉(zhuǎn)速100 rpm，光照強(qiáng)度1560 lx，光照時間14 h/day，培 養(yǎng)溫度25±1 °C，培養(yǎng)過程中每天向培養(yǎng)液中充入清潔無菌空氣一次。每14天繼代培養(yǎng)一 次，并在懸浮培養(yǎng)周期的第6天于懸浮細(xì)胞培養(yǎng)液中加入甲瓦龍酸內(nèi)酯，使其終濃度為50 mg/