L，繼代培養(yǎng)3次后將繼代周期縮短至6天，繼續(xù)培養(yǎng)3代，此時甲瓦龍酸內(nèi)酯的加入時間 為培養(yǎng)周期的第2天。懸浮細胞培養(yǎng)液即為可提高虎杖愈傷組織中白藜蘆醇含量的培養(yǎng)液。
[0014]培養(yǎng)結(jié)束后，用高效液相色譜(HPLC)測定白藜蘆醇含量，結(jié)果表明白藜蘆醇含量 占細胞干重的0.161%。
[0015] 實施例3: 一種可提高虎杖愈傷組織中白藜蘆醇含量的培養(yǎng)方法，采用以下步驟： A、 外植體材料選取與預(yù)處理： 選擇苗齡為一周左右生長茁壯的虎杖莖段為外植體。先將虎杖的莖剪成5~10 cm的莖 段，流水沖洗2~3 h，將莖放置到已滅菌的超凈工作臺上，用無菌水浸泡10 min，然后用75% 乙醇一水溶液浸泡消毒30 s，無菌水沖洗2~3次，再用10% NaCIO溶液消毒5 min，最后用無 菌水浸泡材料3次，時間分別為10 min，5 min，3 min，放在無菌濾紙上晾干；用刀切除莖段 兩端的舊切面，剪成0. 5X0. 5 cm左右的小段備用； B、 虎杖愈傷組織的誘導(dǎo):將步驟A中已消毒的外植體接入固體培養(yǎng)基，培養(yǎng)基組成為MS 培養(yǎng)基+1.0 mg/L 6-BA + 0.5 mg/L KT +0.2 mg/L NAA，30 g/L蔗糖，8 g/L瓊脂，pH 5.8， 溫度25 ± 1 °C，在暗光(0 lx)下培養(yǎng)25天，誘導(dǎo)出愈傷組織。選擇質(zhì)地疏松、顏色淡黃的新 鮮愈傷組織進行繼代培養(yǎng)，每20天繼代一次，在相同固體培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)3次； C、 愈傷組織懸浮擴大培養(yǎng)與次生代謝產(chǎn)物白藜蘆醇的誘導(dǎo)：以步驟B中繼代3次后獲得 的生長旺盛、疏松、易散的愈傷組織為懸浮培養(yǎng)體系的種子細胞，將其接種在懸浮細胞培養(yǎng) 液中（配方見附表4)，接種量為95 g/L(愈傷組織鮮重/培養(yǎng)基體積）。將接種完成的懸浮細 胞培養(yǎng)基進行懸浮振蕩培養(yǎng)，搖床轉(zhuǎn)速115 rpm，光照強度1680 lx，光照時間13 h/day，培 養(yǎng)溫度25±1 °C，培養(yǎng)過程中每天向培養(yǎng)液中充入清潔無菌空氣一次。每12天繼代培養(yǎng)一 次，并在懸浮培養(yǎng)周期的第7天于懸浮細胞培養(yǎng)液中加入甲瓦龍酸內(nèi)酯，使其終濃度為100 mg/L，繼代培養(yǎng)4次后將繼代周期縮短至8天，繼續(xù)培養(yǎng)3代，此時甲瓦龍酸內(nèi)酯的加入時間 為培養(yǎng)周期的第4天。懸浮細胞培養(yǎng)液即為可提高虎杖愈傷組織中白藜蘆醇含量的培養(yǎng)液。
[0016] 培養(yǎng)結(jié)束后，用高效液相色譜(HPLC)測定白藜蘆醇含量，結(jié)果表明白藜蘆醇含量 占細胞干重的0.154%。
[0017] 實施例4: 一種可提高虎杖愈傷組織中白藜蘆醇含量的培養(yǎng)方法，采用以下步驟： A、 外植體材料選取與預(yù)處理:選擇苗齡為一周左右生長茁壯的虎杖莖段為外植體。先 將虎杖的莖剪成5~10 cm的莖段，流水沖洗2~3 h，將莖放置到已滅菌的超凈工作臺上，用無 菌水浸泡10 min，然后用75%乙醇一水溶液浸泡消毒30 s，無菌水沖洗2~3次，再用10% NaCIO溶液消毒5 min，最后用無菌水浸泡材料3次，時間分別為10 min，5 min，3 min，放在 無菌濾紙上晾干;用刀切除莖段兩端的舊切面，剪成0. 5X0. 5 cm左右的小段備用； B、 虎杖愈傷組織的誘導(dǎo):將步驟A中已消毒的外植體接入MS培養(yǎng)基，培養(yǎng)基組成為MS培 養(yǎng)基+1.0 mg/L 6-BA + 0.5 mg/L KT +0.2 mg/L NAA，30 g/L蔗糖，8 g/L瓊脂，pH 5.8,溫 度25 ± 1 °C，在暗光(0 lx)下培養(yǎng)25天，誘導(dǎo)出愈傷組織。選擇質(zhì)地疏松、顏色淡黃的新鮮 愈傷組織進行繼代培養(yǎng)，每20天繼代一次，在相同固體培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)3次； C、 愈傷組織懸浮擴大培養(yǎng)與次生代謝產(chǎn)物白藜蘆醇的誘導(dǎo)：以步驟B中繼代3次后獲得 的生長旺盛、疏松、易散的愈傷組織為懸浮培養(yǎng)體系的種子細胞，將其接種在懸浮細胞培養(yǎng) 液中（配方見附表5)，接種量為110 g/L(愈傷組織鮮重/培養(yǎng)基體積）。將接種完成的懸浮細 胞培養(yǎng)基進行懸浮振蕩培養(yǎng)，搖床轉(zhuǎn)速130 rpm，光照強度1760 lx，光照時間12 h/day，培 養(yǎng)溫度25 ± 1 °C，培養(yǎng)過程中每天向培養(yǎng)液中充入清潔無菌空氣一次。每16天繼代培養(yǎng)一 次，并在懸浮培養(yǎng)周期的第5天于懸浮細胞培養(yǎng)液中加入甲瓦龍酸內(nèi)酯，使其終濃度為120 mg/L，繼代培養(yǎng)2次后將繼代周期縮短至9天，繼續(xù)培養(yǎng)5代，此時甲瓦龍酸內(nèi)酯的加入時間 為培養(yǎng)周期的第5天。懸浮細胞培養(yǎng)液即為可提高虎杖愈傷組織中白藜蘆醇含量的培養(yǎng)液。
[0018] 培養(yǎng)結(jié)束后，用高效液相色譜(HPLC)測定白藜蘆醇含量，結(jié)果表明白藜蘆醇含量 占細胞干重的0.148%。
[0019] 實施例5: 一種可提高虎杖愈傷組織中白藜蘆醇含量的培養(yǎng)方法，采用以下步驟： A、 外植體材料選取與預(yù)處理:選擇苗齡為一周左右生長茁壯的虎杖莖段為外植體。先 將虎杖的莖剪成5~10 cm的莖段，流水沖洗2~3 h，將莖放置到已滅菌的超凈工作臺上，用無 菌水浸泡10 min，然后用75%乙醇一水溶液浸泡消毒30 s，無菌水沖洗2~3次，再用10% NaCIO溶液消毒5 min，最后用無菌水浸泡材料3次，時間分別為10 min，5 min，3 min，放在 無菌濾紙上晾干;用刀切除莖段兩端的舊切面，剪成0. 5X0. 5 cm左右的小段備用； B、 虎杖愈傷組織的誘導(dǎo):將步驟A中已消毒的外植體接入MS培養(yǎng)基，培養(yǎng)基組成為MS培 養(yǎng)基+1.0!1^/16-8厶 + 0.5 11^/11〇'+0.2 11^/1熟厶，308/1蔗糖，88/1瓊脂，？!15.8，溫 度25 ± 1 °C，在暗光(0 lx)下培養(yǎng)25天，誘導(dǎo)出愈傷組織。選擇質(zhì)地疏松、顏色淡黃的新鮮 愈傷組織進行繼代培養(yǎng)，每20天繼代一次，在相同固體培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)3次； C、 愈傷組織懸浮擴大培養(yǎng)與次生代謝產(chǎn)物白藜蘆醇的誘導(dǎo)：以步驟B中繼代3次后獲得 的生長旺盛、疏松、易散的愈傷組織為懸浮培養(yǎng)體系的種子細胞，將其接種在懸浮細胞培養(yǎng) 液中（配方見附表6)，接種量為70 g/L(愈傷組織鮮重/培養(yǎng)基體積）。將接種完成的懸浮細 胞培養(yǎng)基進行懸浮振蕩培養(yǎng)，搖床轉(zhuǎn)速105 rpm，光照強度1500 lx，光照時間15 h/day，培 養(yǎng)溫度25±1 °C，培養(yǎng)過程中每天向培養(yǎng)液中充入清潔無菌空氣一次。每12天繼代培養(yǎng)一 次，并在懸浮培養(yǎng)周期的第8天于懸浮細胞培養(yǎng)液中加入甲瓦龍酸內(nèi)酯，使其終濃度為120 mg/L，繼代培養(yǎng)4次后將繼代周期縮短至6天，繼續(xù)培養(yǎng)5代，此時甲瓦龍酸內(nèi)酯的加入時間 為培養(yǎng)周期的第3天。懸浮細胞培養(yǎng)液即為可提高虎杖愈傷組織中白藜蘆醇含量的培養(yǎng)液。
[0020] 培養(yǎng)結(jié)束后，用高效液相色譜(HPLC)測定白藜蘆醇含量，結(jié)果表明白藜蘆醇含量 占細胞干重的0.135%。
[0021] 表1. MS培養(yǎng)基的基本組成
表2.實施例1的懸浮細胞培養(yǎng)液配方
【主權(quán)項】
1. 一種可提高虎杖愈傷組織中白藜蘆醇含量的培養(yǎng)液，其特征在于：在MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基 中添加6-芐氨基嘌呤、6-糖基氨基嘌呤、萘乙酸、精胺、亞精胺、蔗糖，添加后，所述6-芐氨基 嘌呤的濃度為0.5~1.8 mg/L，所述6-糖基氨基嘌呤的濃度為0.3~1.0 mg/L，所述萘乙酸的 濃度為〇. 15~0.45 mg/L，所述精胺的濃度為1.0~4.5 mg/L，所述亞精胺的濃度為0.5~1.25 mg/L，所述蔗糖濃度為20~50 g/L;培養(yǎng)液pH為5~6。2. -種可提高虎杖愈傷組織中白藜蘆醇含量的培養(yǎng)方法，其特征在于采用以下步驟： A、 虎杖愈傷組織的誘導(dǎo):選擇虎杖莖段為外植體，在培養(yǎng)基中暗光(0 lx)培養(yǎng)25天，誘 導(dǎo)出愈傷組織，每20天繼代一次，繼代培養(yǎng)3次;所述培養(yǎng)基為MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加6-芐氨 基嘌呤、6-糖基氨基嘌呤、萘乙酸、精胺、亞精胺、蔗糖而成，所述培養(yǎng)基中6-芐氨基嘌呤濃 度為1.0 mg/L，6-糖基氨基嘌呤濃度為0.5 mg/L，萘乙酸濃度為0.2 mg/L，蔗糖濃度為30 g/L，瓊脂濃度為8 g/L，培養(yǎng)基pH 5.8,培養(yǎng)溫度25±1 °C; B、 愈傷組織懸浮擴大培養(yǎng)及次生代謝產(chǎn)物白藜蘆醇的誘導(dǎo)：以步驟A中獲得的生長旺 盛、疏松、易散的愈傷組織為懸浮培養(yǎng)體系的種子細胞，將其接種在一種可提高虎杖愈傷組 織中白藜蘆醇含量的培養(yǎng)液中進行懸浮擴大培養(yǎng)，接種量為60~110 g/L，g/L=愈傷組織鮮 重/培養(yǎng)基體積，得到含有愈傷組織的培養(yǎng)液;所述一種可提高虎杖愈傷組織中白藜蘆醇含 量的培養(yǎng)液是含有0.5~1.8 mg/L 6-芐氨基嘌呤、0.3~1.0 mg/L 6-糖基氨基嘌呤、0.15~ 0.45 mg/L萘乙酸、1.0~4.5 mg/L精胺、0.5~1.25 mg/L亞精胺、20~50g/L蔗糖的MS培養(yǎng)液， 培養(yǎng)液pH為5~6;對所得含有愈傷組織的培養(yǎng)液進行誘導(dǎo)懸浮培養(yǎng)，誘導(dǎo)懸浮培養(yǎng)的條件 為:振蕩培養(yǎng)，搖床轉(zhuǎn)速90~130 rpm，光照強度1280~1760 lx，光照時間12~16 h/day，培養(yǎng) 溫度25±1 °C，培養(yǎng)過程中每天向培養(yǎng)液中充入清潔無菌空氣一次;每12~16天繼代培養(yǎng)一 次，繼代培養(yǎng)2~4次后將繼代周期縮短至6~10天，縮短繼代周期后繼續(xù)培養(yǎng)3~5代;在誘導(dǎo)懸 浮培養(yǎng)繼代周期的第4~8天，繼代周期縮短后則在第2~5天時加入甲瓦龍酸內(nèi)酯，甲瓦龍酸 內(nèi)酯在培養(yǎng)液中的終濃度為50~120 mg/L，誘導(dǎo)懸浮培養(yǎng)結(jié)束后得到白藜蘆醇含量高的虎 杖愈傷組織細胞。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種可提高虎杖愈傷組織中白藜蘆醇含量的培養(yǎng)液及培養(yǎng)方法，所述培養(yǎng)液是由MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基、6-芐氨基嘌呤、6-糖基氨基嘌呤、萘乙酸、精胺、亞精胺、蔗糖組成，所述6-芐氨基嘌呤的濃度為0.5~1.8？mg/L，所述6-糖基氨基嘌呤的濃度為0.3~1.0？mg/L，所述萘乙酸的濃度為0.15~0.45？mg/L，所述精胺的濃度為1.0~4.5？mg/L，所述亞精胺的濃度為0.5~1.25？mg/L，所述蔗糖濃度為20~50g/L；培養(yǎng)液pH為5~6。使用本發(fā)明的培養(yǎng)液對虎杖愈傷組織進行培養(yǎng)，白藜蘆醇的含量可達細胞干重的0.12~0.18%，具有提高虎杖愈傷組織中白藜蘆醇的含量的有益效果。
【IPC分類】A01H4/00
【公開號】CN105580735
【申請?zhí)枴緾N201610064635
【發(fā)明人】黃潔芳, 王麗娜, 畢永賢, 殷海琴, 陳斌, 蔣麗剛
【申請人】珀萊雅化妝品股份有限公司
【公開日】2016年5月18日
【申請日】2016年2月1日