本發(fā)明涉及疾病診斷治療領(lǐng)域，具體的涉及mir-1912及其成熟mirna的新用途，更具體的涉及mir-1912及其成熟mirna在診治心肌梗死中的新應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：mirna是一種內(nèi)源性非編碼小分子，通過(guò)特異性結(jié)合靶基因來(lái)調(diào)控基因的表達(dá)。mirna在正常細(xì)胞生理中起調(diào)節(jié)反饋和緩沖的作用，作為精調(diào)靶基因蛋白水平，防止其超出正常生理范疇的關(guān)鍵因子。此外，mirna也是調(diào)節(jié)不同分子信號(hào)通路間的開(kāi)關(guān)。mirna表達(dá)量和活性的異常極有可能影響細(xì)胞的正常生理功能從而導(dǎo)致疾病的發(fā)生。早年的一些動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果己經(jīng)證明，mirna在轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄后修飾水平調(diào)節(jié)著心肌生長(zhǎng)發(fā)育、纖維化和重構(gòu)等。通過(guò)對(duì)心肌梗死動(dòng)物血清的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)，發(fā)現(xiàn)一些mirna在心肌梗死后動(dòng)態(tài)變化。其中影響著心肌生長(zhǎng)、發(fā)育和纖維化的mirna在心肌梗死后的早期會(huì)大量表達(dá)。因此，心肌梗死后患者血清中mirna的動(dòng)態(tài)變化意義重大。雖然目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)一些和心肌梗死密切相關(guān)的mirna，例如mir-1、mir-133、mir-24、mir-499、mir-208，但是這些還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠，臨床的精準(zhǔn)診斷和治療需要更多候選分子標(biāo)志物。本發(fā)明基于高通量測(cè)序方法，對(duì)5例心肌梗死患者的血液組織及健康對(duì)照血液組織進(jìn)行二代測(cè)序，獲得mirna和mrna的表達(dá)數(shù)據(jù)，同時(shí)，結(jié)合geo數(shù)據(jù)庫(kù)中心肌梗死相關(guān)mirna和mrna數(shù)據(jù)，進(jìn)行生物信息學(xué)分析驗(yàn)證，從候選的mirna和mrna中挑選出幾個(gè)進(jìn)行分子生物學(xué)驗(yàn)證，結(jié)果顯示，本發(fā)明提供的mir-1912及其靶基因zdhhc18與心肌梗死密切相關(guān)，可用于心肌梗死的臨床診斷及預(yù)防檢測(cè)，為臨床上相關(guān)診斷試劑或芯片等的開(kāi)發(fā)奠定基礎(chǔ)。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：檢測(cè)mir-1912或其成熟mirna的制劑在制備診斷心肌梗死試劑中的應(yīng)用。所述mir-1912的序列見(jiàn)序列表seqidno1，mir-1912成熟mirna為mir-1912，序列見(jiàn)序列表seqidno2。進(jìn)一步，診斷心肌梗死試劑包括基于高通量測(cè)序方法和/或基于定量pcr方法和/或基于探針雜交方法檢測(cè)心肌梗死樣本中mir-1912及其成熟mirna的轉(zhuǎn)錄或基于免疫檢測(cè)方法檢測(cè)心肌梗死樣本中mir-1912及其成熟mirna調(diào)控的靶基因的表達(dá)情況。優(yōu)選采用northern雜交方法、mirna表達(dá)譜芯片、核酶保護(hù)分析技術(shù)、rake法、原位雜交、基于微球的流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)心肌梗死樣本中mir-1912及其成熟mirna的轉(zhuǎn)錄；采用elisa和/或膠體金試紙條檢測(cè)心肌梗死樣本中mir-1912及其成熟mirna調(diào)控的靶基因的表達(dá)情況。優(yōu)選的，基于定量pcr方法包括特異性擴(kuò)增mir-1912及其成熟mirna的引物，進(jìn)一步優(yōu)選，特異性擴(kuò)增mir-1912的引物序列為seqidno3；基于探針雜交方法包括與mir-1912及其成熟mirna的核酸序列雜交的探針。本發(fā)明的目的在于提供mir-1912及其成熟mirna的靶基因在制備診斷和/或防治心肌梗死制劑中的應(yīng)用。所述靶基因?yàn)閐iana-microt、microrna.org、mirdb、rna22-has、targetminer、targetscan-vert數(shù)據(jù)庫(kù)表明的mir-1912靶基因。優(yōu)選的，所述靶基因?yàn)閦dhhc18。進(jìn)一步，診斷心肌梗死試劑包括基于高通量測(cè)序方法和/或基于定量pcr方法和/或基于探針雜交方法檢測(cè)心肌梗死樣本mir-1912及其成熟mirna靶基因的轉(zhuǎn)錄或基于免疫檢測(cè)方法檢測(cè)心肌梗死樣本中mir-1912及其成熟mirna靶基因的表達(dá)情況。優(yōu)選采用northern雜交方法、mirna表達(dá)譜芯片、核酶保護(hù)分析技術(shù)、rake法、原位雜交、基于微球的流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)心肌梗死樣本中mir-1912及其成熟mirna靶基因的轉(zhuǎn)錄；采用elisa和/或膠體金試紙條檢測(cè)心肌梗死樣本中mir-1912及其成熟mirna靶基因的表達(dá)情況。本發(fā)明的目的在于提供上調(diào)mir-1912及其成熟mirna的轉(zhuǎn)錄和/或促進(jìn)mir-1912及其成熟mirna的活性的試劑在制備防治心肌梗死制劑中的應(yīng)用。優(yōu)選的，采用基于rna的microrna功能獲得性技術(shù)和/或基因特異性mirmimics技術(shù)上調(diào)mir-1912及其成熟mirna的轉(zhuǎn)錄和/或促進(jìn)mir-1912及其成熟mirna的活性。優(yōu)選人工合成短發(fā)夾rna或通過(guò)調(diào)控啟動(dòng)子上調(diào)mir-1912及其成熟mirna。本發(fā)明的目的在于提供mir-1912及其成熟mirna的靶基因的抑制劑在制備防治心肌梗死制劑中的應(yīng)用。本發(fā)明的目的在于提供一種心肌梗死診斷試劑，心肌梗死診斷試劑能夠檢測(cè)心肌梗死樣本中mir-1912及其成熟mirna的轉(zhuǎn)錄或免疫檢測(cè)方法檢測(cè)心肌梗死樣本中mir-1912及其成熟mirna調(diào)控的靶基因的表達(dá)情況。進(jìn)一步，心肌梗死診斷試劑包括檢測(cè)mirna調(diào)控的靶基因zdhhc18表達(dá)的特異性引物，優(yōu)選的，引物序列為seqidno4和seqidno5。本發(fā)明的目的在于提供上述防治心肌梗死的制劑在制備心肌梗死治療藥物或試劑中的應(yīng)用。定義：現(xiàn)階段檢測(cè)mirna的表達(dá)水平的方法主要包括基于高通量測(cè)序技術(shù)、基于核苷酸雜交和基于pcr的mirna檢測(cè)方法?；谔结橂s交技術(shù)的mirna檢測(cè)方法是一種直接檢測(cè)法，不需要對(duì)樣本rna進(jìn)行預(yù)擴(kuò)增，包括northern雜交方法、mirna表達(dá)譜芯片、核酶保護(hù)分析技術(shù)、rake法、原位雜交、基于微球的流式細(xì)胞術(shù)等技術(shù)。(1)northern雜交又稱rna印跡技術(shù)為最經(jīng)典的檢測(cè)真核生物rna大小，估計(jì)其豐度的實(shí)驗(yàn)方法?；驹砣缦拢菏紫仍谳d體(如硅片、微球或膜等)上固定mirna樣本，再與經(jīng)過(guò)標(biāo)記的探針雜交，洗滌多余的雜交探針后進(jìn)行信號(hào)檢測(cè)；也可以在載體上先固定與靶mirna序列互補(bǔ)的dna探針，然后與經(jīng)過(guò)標(biāo)記的樣本mirna雜交，再進(jìn)行信號(hào)檢測(cè)。信號(hào)標(biāo)記的方法包括同位素標(biāo)記、熒光標(biāo)記和納米金標(biāo)記等。(2)mirna表達(dá)譜芯片原理同樣是使用標(biāo)記探針檢測(cè)固相支持物上的目標(biāo)分子。通過(guò)設(shè)計(jì)芯片上mirna基因及內(nèi)參序列，可精確分析出樣品中相應(yīng)mirna的表達(dá)水平。基因芯片具有高通量的優(yōu)點(diǎn)，可以一次在同一樣本中檢測(cè)出幾百個(gè)基因的全部表達(dá)。luminex公司研制的液相芯片(liquidchip)又稱多功能懸浮點(diǎn)陣(multianalytesuspensionarray，masa)，是出的新一代生物芯片技術(shù)。液相芯片體系由許多小球體為主要基質(zhì)構(gòu)成，每種小球體上固定有不同的探針?lè)肿?，為了區(qū)分不同的探針，每一種用于標(biāo)記探針的球形基質(zhì)都帶有一個(gè)獨(dú)特的色彩編號(hào)，將這些小球體懸浮于一個(gè)液相體系中，就構(gòu)成了液相芯片系統(tǒng)。該系統(tǒng)可以對(duì)同一個(gè)微量樣本中的多個(gè)不同分子同時(shí)進(jìn)行快速的定性、定量分析，這種檢測(cè)技術(shù)被稱為fmap(flexiblemultianalyteprofiling)技術(shù)。分子雜交在懸浮溶液中進(jìn)行，檢測(cè)速度極快。(3)核酶保護(hù)分析技術(shù)(rpa)mirna的檢測(cè)還可以采用核酶保護(hù)分析技術(shù)，將標(biāo)記好的探針和待測(cè)rna樣本混合，熱變性后雜交，未雜交的rna和多余的探針用單鏈核酸酶消化，熱失活核酸酶后純化受保護(hù)的rna分子，最后通過(guò)變性page電泳分離探針，顯色。這種基于液相雜交的新方法簡(jiǎn)單快速，靈敏度高，但也只能用于分析已知mirna。(4)rake法rake法(rnaprimedarraybasedklenowemzyme)是在mirnamicroarray的基礎(chǔ)上利用dna聚合酶i的klenow片段，使mirna與固定的dna探針雜交的方法。rake可以敏感特異地檢測(cè)mirna，適用于大量快速的篩選所有己知的mirna。能夠在特定的細(xì)胞和腫瘤中檢測(cè)mirna表達(dá)譜情況。不僅如此，rake法還可以從由福爾馬林固定了的石蠟包埋的組織中分離出mirna并對(duì)其進(jìn)行分析，為從存檔標(biāo)本中分析mirna開(kāi)啟了希望之門。(5)原位雜交(insituhybridization)原位雜交技術(shù)可直觀了解mirna表達(dá)方式，是觀測(cè)mirna時(shí)空表達(dá)的一種較簡(jiǎn)便的方法，常標(biāo)記方式包括地高辛、生物素、熒光標(biāo)記等。鎖定核酸基礎(chǔ)上的原位雜交(lockednucleicacid(lna)basedinsituhybridization(lna-ish))是當(dāng)前應(yīng)用較多的探針?lè)绞健?6)基于微球的流式細(xì)胞術(shù)(bead-basedflowcytometry)是一種液相芯片技術(shù)，該方法將流式細(xì)胞檢測(cè)與芯片技術(shù)有機(jī)地結(jié)合起來(lái)，兼有通量大、檢測(cè)速度快、靈敏度高和特異性好等特點(diǎn)。(7)實(shí)時(shí)熒光定量pcr技術(shù)(real-timepcr，rt-pcr)熒光檢測(cè)pcr儀可對(duì)整個(gè)pcr過(guò)程中擴(kuò)增序列的累積速率繪制動(dòng)態(tài)變化曲線。在反應(yīng)混合體系中靶序列的起始濃度越大，要求獲得擴(kuò)增產(chǎn)物某特定產(chǎn)量的pcr循環(huán)數(shù)(一般用特定閾值循環(huán)數(shù)ct來(lái)表達(dá))越少。由于mirna長(zhǎng)度僅為22nt，傳統(tǒng)的qrt-pcr不適合擴(kuò)增如此短的片段。現(xiàn)今有幾種用于mirna的實(shí)時(shí)定量pcr方法，如加尾法、頸環(huán)法等。頸環(huán)法是一種理想的mirna檢測(cè)qrt-pcr方法：首先設(shè)計(jì)特殊的莖環(huán)結(jié)構(gòu)引物，以待測(cè)mirna為模板逆轉(zhuǎn)錄合成cdna第一鏈，該cdna一端為莖環(huán)狀引物，莖環(huán)狀結(jié)構(gòu)被打開(kāi)便增加了cdna的長(zhǎng)度，隨后以合成的cdna為模板設(shè)計(jì)引物進(jìn)行實(shí)時(shí)定量pcr擴(kuò)增。qrt-pcr具有特異性高、靈敏度好、快速簡(jiǎn)單等多種優(yōu)點(diǎn)。(8)測(cè)序法大部分已知的mirna都是通過(guò)cdna克隆測(cè)序發(fā)現(xiàn)和鑒定的。該法需要先構(gòu)建mirna的cdna文庫(kù)，再進(jìn)行pcr擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物隨后克隆到表達(dá)載體上測(cè)序。takada開(kāi)發(fā)了一種改進(jìn)的擴(kuò)增克隆法(mirnaamplificationprofiling，mrap)，mrap法先在mirna的3’端連上接頭，然后用與接頭互補(bǔ)的反轉(zhuǎn)錄引物反轉(zhuǎn)錄。因?yàn)樘囟ǖ姆崔D(zhuǎn)錄酶具有末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶活性，一些核苷酸(主要是脫氧胞苷酸)會(huì)連接到反轉(zhuǎn)錄出的cdna鏈的3’末端。當(dāng)5’端接頭與cdna鏈的poly(c)粘性末端退火后，加入一對(duì)共用引物即可實(shí)現(xiàn)對(duì)cdna的pcr擴(kuò)增。由于mrap高度靈敏，可以直接用克隆和測(cè)序技術(shù)檢測(cè)少量組織中mirna的表達(dá)量。標(biāo)簽序列克隆法是一種在在基因表達(dá)系列分析(sage)技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展了檢測(cè)效率更高的mirage(mirnasage)克隆法，該法通過(guò)生成大的串聯(lián)子，通過(guò)單個(gè)測(cè)序反應(yīng)可檢測(cè)多個(gè)mirna，明顯提高了檢測(cè)效率。高通量測(cè)序(high-throughputsequencing)又稱下一代測(cè)序技術(shù)(nextgenerationsequencing)是對(duì)傳統(tǒng)測(cè)序一次革命性的改變，一次對(duì)幾十萬(wàn)到幾百萬(wàn)條dna分子進(jìn)行序列測(cè)定，極大提高了測(cè)序效率。這類大規(guī)模測(cè)序技術(shù)極大的提高了多個(gè)物種遺傳信息的解讀速度，為獲取所有mirna的序列信息，解密mirna圖譜提供了保證。同時(shí)高通量測(cè)序使得對(duì)一個(gè)物種的轉(zhuǎn)錄組和基因組進(jìn)行細(xì)致全貌的分析成為可能，所以又被稱為深度測(cè)序(deepsequencing)。高通量測(cè)序平臺(tái)的代表是羅氏公司(roche)的454測(cè)序儀(rochgsflxsequencer)，illumina公司的solexa基因組分析儀(illuminagenomeanalyzer)和abi的solid測(cè)序儀(abisolidsequencer)?；趓na的microrna功能獲得性技術(shù)即通過(guò)外源性補(bǔ)充mirnas合成的前體物質(zhì)來(lái)升高mirnas的水平。例如，可以人工合成與內(nèi)源性mirna序列一致的短發(fā)夾樣rna(shorthairpinrna，shrna)，由聚合酶ii或iii做啟動(dòng)子，以病毒為載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞，被dicer酶修飾后載入risc發(fā)揮作用，相當(dāng)于升高pre-mirna的水平，作用效果穩(wěn)定而持久?；蛱禺愋詍irmimics技術(shù)該技術(shù)避免了mirna與基因的非特異性作用。這種人工合成的與靶基因3’utr互補(bǔ)結(jié)合的特異性寡核苷酸鏈，能夠起到與mirna相同的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)作用。mirna調(diào)控的主要方式有兩種：一種是與靶基因mrna的3’utr不完全互補(bǔ)配對(duì)，阻斷靶基因的翻譯，從而調(diào)節(jié)基因表達(dá)；另一種是與sirna類似，當(dāng)mirna與mrna完全互補(bǔ)配對(duì)時(shí)，ago2蛋白通過(guò)切割mrna直接導(dǎo)致其降解，實(shí)現(xiàn)基因沉默?？傊?dāng)前認(rèn)為mirna以何種方式與目的基因作用和mirna與目的基因的配對(duì)程度有關(guān)。mirna與目的基因配對(duì)不完全時(shí)，mirna就以抑制目的基因的表達(dá)發(fā)揮作用；mirna與目的基因某段序列配對(duì)完全時(shí)，就可能引起目的基因在互補(bǔ)區(qū)斷裂而導(dǎo)致基因沉默。附圖說(shuō)明圖1是mir-1912診斷心肌梗死的roc曲線圖圖2是mir-1912相對(duì)表達(dá)情況圖圖3是zdhhc18基因相對(duì)表達(dá)情況圖具體實(shí)施方式下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明，僅用于解釋本發(fā)明，而不能理解為對(duì)本發(fā)明的限制。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以理解：在不脫離本發(fā)明的原理和宗旨的情況下可以對(duì)這些實(shí)施例進(jìn)行多種變化、修改、替換和變型，本發(fā)明的范圍由權(quán)利要求及其等同物限定。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件或按照廠商所建議的條件實(shí)施檢測(cè)。實(shí)施例1樣品的收集及總rna提取收集醫(yī)院2015年3月到2016年9月心肌梗死患者外周血及健康對(duì)照外周血各6例。急性心肌梗死診斷標(biāo)準(zhǔn)：根據(jù)2012年第三次《心肌梗死全球統(tǒng)一定義》推薦的診斷標(biāo)準(zhǔn)制定。檢測(cè)到心肌壞死標(biāo)志物(主要是肌鈣蛋白)水平上升和/或下降，至少有1次超過(guò)參考值上限的第99％百分位值，并至少伴有下列一項(xiàng)缺血的癥狀。1)心肌缺血的癥狀；2)新發(fā)生的缺血性ecg改變；3)心電圖出現(xiàn)病理性q波；4)影像學(xué)證據(jù)顯示有新的心肌活性喪失或新發(fā)的局部室壁運(yùn)動(dòng)異常；5)冠狀動(dòng)脈造影或尸檢發(fā)現(xiàn)冠狀動(dòng)脈內(nèi)存在新鮮血栓。血液rna提取標(biāo)準(zhǔn)：rna純度：od260/280≧1.8，28s/18s≧1；rna完整性：rin值≧7.0。rna完整性檢測(cè)方法：agilent2100(rna6000nanokit)、瓊脂糖凝膠電泳(瓊脂糖凝膠濃度：1％瓊脂糖膠；電壓：5v/cm；時(shí)間：20min)。實(shí)施例2測(cè)序、數(shù)據(jù)分析及電子驗(yàn)證測(cè)序：運(yùn)用lluminahiseq2500/miseq第二代高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)mirna和mrna進(jìn)行測(cè)序，通過(guò)去接頭、去低質(zhì)量、去污染等過(guò)程完成數(shù)據(jù)的處理，得到最終數(shù)據(jù)。通過(guò)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析軟件對(duì)mirna和mrna測(cè)序原始數(shù)據(jù)進(jìn)行背景校正后進(jìn)行t-test得到p值，然后利用fisher檢驗(yàn)合并p值，篩選差異表達(dá)mirna和mrna。利用包括miranda，mirdb，mirwalk及targetscan這些算法預(yù)測(cè)差異表達(dá)mirna的靶基因，選取≥4個(gè)算法預(yù)測(cè)出來(lái)的靶基因，并在mirwalk數(shù)據(jù)庫(kù)查找已驗(yàn)證的差異表達(dá)的mirna的靶基因。最終從候選的差異表達(dá)mirna和mrna中挑選到mir-1912及其靶基因zdhhc18進(jìn)行后期實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。實(shí)施例3電子驗(yàn)證電子驗(yàn)證：從geo(geneexpressionomnibus)數(shù)據(jù)庫(kù)篩選得到3套mrna數(shù)據(jù)集(gse48060、gse34198和gse61145-gpl6884)和2套mirna數(shù)據(jù)集(gse61741、gse31568)，3套mrna數(shù)據(jù)集(gse48060、gse34198和gse61145-gpl6884)共有基因13680個(gè)，我們通過(guò)使用metama包采用合并p值法計(jì)算并合并效應(yīng)值后得到612個(gè)(fdr<0.05)差異表達(dá)基因，其中上調(diào)352個(gè)，下調(diào)260個(gè)；2套數(shù)據(jù)集(gse24371,gse17498)共同mirna數(shù)目848個(gè)。使用r包metama對(duì)兩套mirna數(shù)據(jù)集進(jìn)行合并p值分析，找到15個(gè)差異表達(dá)mirna(fdr<0.001&&|combined.es|>1)。結(jié)果顯示電子驗(yàn)證結(jié)果與測(cè)序結(jié)果表達(dá)趨勢(shì)一致。對(duì)于單個(gè)mirna分子或是診斷模型的效能評(píng)價(jià)的方法為建立受試者工作特征(receiveroperatingcharacteristic，roc)曲線，通過(guò)計(jì)算曲線下面積(areaundercurve)來(lái)判斷診斷的能力。roc曲線下的面積值在1.0和0.5之間，在auc>0.5的情況下，auc越接近于1，說(shuō)明診斷效果越好，auc在0.5-0.7時(shí)有較低準(zhǔn)確性，auc在0.7-0.9時(shí)有一定準(zhǔn)確性，auc在0.9以上時(shí)具有較高準(zhǔn)確性。我們將利用gse31568數(shù)據(jù)集(包括70例對(duì)照組和20例病例組)，進(jìn)而進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，mir-1912診斷心肌梗死的auc為0.809(見(jiàn)圖1)，表明mir-1912可以作為診斷心肌梗死的分子標(biāo)志物。實(shí)施例4樣品的采集及總rna的提取1樣品采集：36例心肌梗死患者和22例健康對(duì)照人群外周血(采集時(shí)間2014年1月-2015年8月)。2總rna提?。合嚓P(guān)實(shí)驗(yàn)物品的去rnase的處理：①將所有玻璃器皿應(yīng)用前均用depc沖洗侵泡，120℃高壓20min，180℃高溫烤干2小時(shí)以上。②將塑料器皿(如：ep管/槍頭)使用前需用0.1％depc水侵泡過(guò)夜，后控干液體，120℃高壓20min，烤箱烤干備用。白細(xì)胞分離(1)取2m1抗凝外周血(采血時(shí)間不超過(guò)3h)；(2)加入等體積無(wú)菌pbs于外周血中充分混合，形成細(xì)胞懸液；(3)加入4m1淋巴細(xì)胞分離液于另一離心管；(4)吸取4m1細(xì)胞懸液沿管壁輕輕加入到淋巴細(xì)胞分離液表面(注意勿與淋巴細(xì)胞分離液混合)。離心1500rpm20min；(5)用吸管輕輕吸出界面層(白膜)入另一離心管中。無(wú)菌冷pbs洗2次，最后1次洗滌可以將細(xì)胞懸液移入ep管中，離心去上清，用于提取rna。rna提取(1)從-80℃冰箱里取出樣本，切碎，按1ml/50-100mg的比例加入trizol于ep管中，進(jìn)行勻漿處理，室溫靜置5-l0min；(2)每毫升trizol加入0.2m1氯仿，劇烈震蕩15s，室溫靜置2-3min，在4℃下12000轉(zhuǎn)離心15min；(3)小心吸出上清水相約600ul移入另一離心管(注意不要抽到蛋白層)，加入等量異丙醇，顛倒混勻，室溫靜置10min；(4)4℃12000g離心l0min，棄上清液，底部可見(jiàn)白色物質(zhì)；(5)加入lml75％冷乙醇旋轉(zhuǎn)洗滌，清洗異丙醇；(6)4℃12000g離心5min，去除乙醇后晾5-l0min，半透明即可，以20u1depc水溶解rna。取3u1rna樣本，于1.5％瓊脂糖凝膠中電泳；lu1rna樣品于紫外分光光度計(jì)檢測(cè)濃度，以a260/280在1.8-2.0視為rna樣本合格。實(shí)施例5rt-pcr檢測(cè)mir-1912及zdhhc18的表達(dá)情況1rt-pcr檢測(cè)mir-1912的表達(dá)逆轉(zhuǎn)錄rt體系的配制：1μg總rna作為模板rna；5×miscripthispecbuffer4μl；10×nucleicsmix2μl；miscriptreversetranscriptasemix2μl；滅菌水補(bǔ)平至20μl。abi9700型pcr儀上37℃保溫60min使逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)完全后，95℃5min終止反應(yīng)。加入80μlnuclease-freeh2o稀釋至100μl儲(chǔ)存在-20℃冰箱備用。熒光定量pcrmirna的rt-pcr體系的配制：反應(yīng)體系：mirnas的表達(dá)檢測(cè)每次設(shè)置3個(gè)平行管反應(yīng)，以snrnau6作為內(nèi)參。擴(kuò)增程序：95℃10min；40個(gè)循環(huán)(95℃10s，60℃30s)。2rt-pcr檢測(cè)zdhhc18的表達(dá)逆轉(zhuǎn)錄采用iiireversetranscriptase(invitrogen，貨號(hào)18080-044)進(jìn)行cdna反轉(zhuǎn)錄。使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，用逆轉(zhuǎn)錄緩沖液對(duì)lμg總rna進(jìn)行逆反錄合成cdna。rt體系的配制：5×逆轉(zhuǎn)錄緩沖液5μl，10mmol/ldntp1.25μl，0.1mmol/ldtt2.5μl，30μmmol/loligodt2μl,200u/μlmmlv1.25μl，模板rna1μg，加入滅菌水至總體系25μl。42℃孵育1小時(shí)，72℃10分鐘，短暫離心。cdna保存放-20℃冰箱備用rna。熒光定量pcr根據(jù)genbank提供的序列(nm_032283.2)設(shè)計(jì)引物，送公司進(jìn)行合成。mrna的rt-pcr體系的配制：組分加入量2×mix10μl上游引物10um(seqidno4)0.5μl下游引物10um(seqidno5)0.5μl模板2μl加入滅菌蒸餾水至25μl反應(yīng)體系：用powergreenpcrmastermix(invitrogen，貨號(hào)4367659)進(jìn)行擴(kuò)增，內(nèi)參選gapdh，實(shí)驗(yàn)操作按產(chǎn)品說(shuō)明書進(jìn)行。擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃10min，(95℃15sec，60℃60sec)×35個(gè)循環(huán)。3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析實(shí)時(shí)定量pcr樣本擴(kuò)增產(chǎn)物溶解曲線都是單峰，說(shuō)明擴(kuò)增產(chǎn)物只有一條，為特異性擴(kuò)增；擴(kuò)增曲線拐點(diǎn)清楚，擴(kuò)增曲線整體平行性好，表明各反應(yīng)管的擴(kuò)增效率相近，極限平而無(wú)上揚(yáng)現(xiàn)在，曲線指數(shù)期斜率較大，說(shuō)明擴(kuò)增效率較高；根據(jù)qrt-pcr的相對(duì)定量公式計(jì)算實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組目的基因表達(dá)的倍數(shù)關(guān)系，比較mir-1912在心肌梗死組和對(duì)照組中的表達(dá)水平。結(jié)果顯示：mir-1912在患病組的表達(dá)量為對(duì)照組的約0.4倍，zdhhc18在患病組的表達(dá)量為對(duì)照組的3.5倍，以上結(jié)果驗(yàn)證了高通量測(cè)序數(shù)據(jù)分析的結(jié)果。實(shí)施例6心肌細(xì)胞的培養(yǎng)及瞬時(shí)轉(zhuǎn)染一、材料準(zhǔn)備：人原代心肌細(xì)胞(humancardiacmyocytes，hcm)購(gòu)自美國(guó)sciencell公司，培養(yǎng)于專用的心肌細(xì)胞培養(yǎng)基。lipofectaminetm2000transfectionreagent(invitrogen)。mir-1912序列發(fā)給合成公司，請(qǐng)其化學(xué)合成mir-1912mimics、mir-1912inhibitor及其非特異性對(duì)照。二、實(shí)驗(yàn)方法1mirna瞬時(shí)轉(zhuǎn)染操作按lipofectaminetm2000試劑說(shuō)明書進(jìn)行。轉(zhuǎn)染前24h將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的hcm細(xì)胞接種到6孔板中，細(xì)胞計(jì)數(shù)約為4×105/l，常規(guī)培養(yǎng)至轉(zhuǎn)染當(dāng)天，細(xì)胞融合度為70-80％時(shí)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。將100nmmir-1912mimics/mir1912inhibitor加入到250μlopti-mem培養(yǎng)基中，輕柔混勻；另用250μlopti-mem培養(yǎng)基稀釋5μllipofectaminetm2000脂質(zhì)體，輕柔混勻，室溫孵育5min；混合opti-mem-脂質(zhì)體與opti-mem-mirnas，室溫孵育20min，以形成轉(zhuǎn)染復(fù)合物：然后將上述混合物加到細(xì)胞培養(yǎng)基中，輕輕混勻，培養(yǎng)6h后更換完全培養(yǎng)基。其中，非特異性的mimicsnegativecontrol(mimicsnc)和inhibitornegativecontrol(inhibitornc)序列作為對(duì)照。培養(yǎng)24-48h后抽提細(xì)胞總rna，逆轉(zhuǎn)錄成cdna，實(shí)時(shí)定量pcr檢測(cè)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染后mir-1912表達(dá)的改變。2實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用陽(yáng)離子脂質(zhì)體法進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，分別將mir-1912mimics或mir-1912inhibitor及相應(yīng)對(duì)照序列negativecontrol(nc)轉(zhuǎn)染心肌細(xì)胞株hcm。轉(zhuǎn)染48h后，抽提細(xì)胞總rna。以u(píng)6為內(nèi)對(duì)照，實(shí)時(shí)定量pcr檢測(cè)mir-1912的表達(dá)。結(jié)果顯示：與對(duì)照組相比，hcm轉(zhuǎn)染mir-1912mimics后，mir-1912的表達(dá)增高了約4.3倍；轉(zhuǎn)染mir-1912inhibitor后，表達(dá)下降了近63％。以上結(jié)果表明，通過(guò)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染mir-1912mimics和mir-1912inhibitor可有效上調(diào)或下調(diào)mir-1912的表達(dá)，結(jié)果可靠可進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。實(shí)施例6轉(zhuǎn)染mir-1912對(duì)人心肌細(xì)胞zdhhc18基因表達(dá)的影響將瞬時(shí)轉(zhuǎn)染mir-1912mimics或mir-1912inhibitor及相應(yīng)對(duì)照序列negativecontrol(nc)后的hcm細(xì)胞接種到96孔板中，轉(zhuǎn)染48h后，抽提細(xì)胞總rna。以gapdh為內(nèi)對(duì)照，實(shí)時(shí)定量pcr檢測(cè)zdhhc18的表達(dá)。結(jié)果顯示：與對(duì)照組相比，hcm轉(zhuǎn)染mir-1912mimics后，zdhhc18的表達(dá)量降低約13％，轉(zhuǎn)染mir-1912inhibitor后，zdhhc18的表達(dá)量上升約19％，初步證明mir-1912和zdhhc18的靶向關(guān)系。雖然已參考各種優(yōu)選實(shí)施方案描述了本發(fā)明，但本領(lǐng)域技術(shù)人員理解，可進(jìn)行各種變化，并且可用等同物替代其組件而不背離本發(fā)明的基本范圍。此外，可進(jìn)行許多改動(dòng)來(lái)使特定情況或材料適合于本發(fā)明的教導(dǎo)而不背離其基本范圍。sequencelisting<110>北京泱深生物信息技術(shù)有限公司<120>mir-1912及其靶基因在診治心肌梗死中的應(yīng)用<160>5<170>patentinversion3.3<210>1<211>80<212>rna<213>人工序列<400>1cucuaggaugugcucauugcaugggcuguguauaguauuauucaauacccagagcaugca60gugugaacauaauagagauu80<210>2<211>22<212>rna<213>人工序列<400>2uacccagagcaugcagugugaa22<210>3<211>22<212>dna<213>人工序列<400>3tacccagagcatgcagtgtgaa22<210>4<211>18<212>dna<213>人工序列<400>4tgtagtgccaggtgaagg18<210>5<211>18<212>dna<213>人工序列<400>5tcattccagccagaaggt1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