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一種用于梗死心肌修復(fù)與血管重建的細胞移植組合物的制作方法

文檔序號:1130536閱讀:356來源:國知局
專利名稱:一種用于梗死心肌修復(fù)與血管重建的細胞移植組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。涉及一種用于梗死心肌修復(fù)與血管重建的細胞移植組合物。
背景技術(shù)
現(xiàn)有技術(shù)中細胞移植的意義及其存在問題目前對心肌損傷而引起的充血性心力衰竭(CHF)還缺乏有效的治療藥物和治療手段,由于成年哺乳類動物的心肌細胞不能再生,心肌細胞丟失而導致的CHF是一個不可逆轉(zhuǎn)的病理過程,所以細胞移植是未來治療CHF的根本方法。
細胞移植的關(guān)鍵是解決細胞來源的問題。由于干細胞具有分化成各種組織細胞的潛力,特別是骨髓干細胞(Born marrow stem cells,BMSC),具有取材方便,還可以實現(xiàn)自體移植,不需要免疫抑制劑進行維持移植物存活等優(yōu)點,而被認為是一種理想的用于組織修復(fù)的種子細胞。據(jù)目前的研究表明,利用BMSC中的骨髓間充質(zhì)干細胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)在體外的誘導分化培養(yǎng)可以得到心肌組織前體細胞,如利用特定的化學誘導劑5-AZA和bFGF誘導MSCs在體外分化成心肌樣細胞(裴雪濤、牛麗麗等,成年人骨髓間充質(zhì)干細胞體外擴增和定向誘導分化為心肌樣細胞的方法,中國專利公開號CN1536076A)等。
但是,這并不意味著我們就可以得到大量的可以用于移植修復(fù)的組織前體細胞。由于BMSC在體外誘導分化成各種組織前體細胞的過程中,并非所有的BMSC都可以分化為我們所需要的目的細胞。所以,在一個BMSC的誘導分化培養(yǎng)體系中,往往含有未分化的BMSC以及多種多樣的組織前體細胞,我們所需要的心肌組織前體細胞只占其中的一部分。如果將沒有經(jīng)過篩選純化的組織前體細胞移植入體內(nèi)后,就可能導致植入細胞在體內(nèi)發(fā)生瘤變,從而給病人帶來潛在的危險。所以,如何從BMSC的誘導分化培養(yǎng)產(chǎn)生的混合細胞體系中,將心肌前體細胞分離純化出來,才是解決細胞來源問題的關(guān)鍵。關(guān)于細胞的分離純化方法,目前最常采用的方法是基于細胞表面特異性蛋白標志的流式細胞技術(shù)。然而不幸的是心肌前體細胞表面上,到底存在何種特異性的特異性蛋白標志,至今還存在學術(shù)上的爭論。
為了能夠從干細胞分化后的培養(yǎng)體系中得到純化了的心肌前體細胞,Klug和Field等用含α-心肌肌凝蛋白重鏈(MHC)啟動子驅(qū)動氨基糖苷磷酸基轉(zhuǎn)移酶neor的表達載體,轉(zhuǎn)入胚胎干細胞的誘導分化培養(yǎng)體系中,然后再用G418進行篩選,從而成功地分離純化出心肌前體細胞(J.Clin.Invest.98216,1996)。也許Klug和Field的方法,是從干細胞體外誘導分化體系分離純化出符合細胞移植要求的心肌組織前體細胞的一種理想方法。
但是該方法只適用于從胚胎干細胞分化培養(yǎng)體系中分離純化心肌前體細胞,卻很難適用于從BMSC分化培養(yǎng)體系中分離純化出心肌所需要修復(fù)的細胞。這是因為胚胎干細胞具有強大的體外擴增能力,而BMSC的體外擴增能力非常有限,一般在體外進行有限的10~20次傳代,滿足不了基因工程操作所需要的要求。特別是BMSC分化后,細胞很快就凋亡了,根本就不可能進行轉(zhuǎn)基因后的陽性細胞克隆篩選培養(yǎng)。
端粒酶與細胞擴增端粒酶(Telomerase)在保持端粒穩(wěn)定、基因組完整、細胞長期的活性和潛在的繼續(xù)增殖能力等方面有重要作用。哺乳動物體內(nèi)絕大多數(shù)組織細胞,在動物出生以后就喪失了端粒酶活性,因而組織細胞在體外只能進行有限傳代的培養(yǎng),這就制約了基因工程技術(shù)在動物組織細胞上的應(yīng)用。一般認為,端粒酶活性的再活化,可以維持端粒的長度,而延緩細胞進入克隆性的老化,是維持細胞不老的關(guān)鍵步驟。很多研究表明,在端粒酶活性喪失的組織細胞中重建端粒酶的活性以后,可導致細胞的體外擴增能力增加,同時保持原有細胞的功能不變。
端粒酶活性再活化后,細胞就會繼續(xù)地進行分裂克隆,但是與此同時,細胞發(fā)生瘤變致癌的風險也相對提高了,這是因為細胞不受控制地分裂對個體而言極具侵略和破壞性。然而,適度一過性地提高組織細胞中的端粒酶活性,可以在提高細胞體外擴增能力,便于基因工程操作的同時,還能增加細胞在移植后與機體組織的整合能力。
細胞移植初始無功能細胞移植與器官移植最大的不同之處在于,植入器官具有完整的解剖結(jié)構(gòu),手術(shù)完成后,植入的器官可以通過自身的血管系統(tǒng)獲取成活所需要的營養(yǎng)物質(zhì)。而植入細胞進入機體后,只能依靠植入環(huán)境中的組織液提供養(yǎng)料和氧份。所不幸的是,大多數(shù)情況下細胞需要植入的環(huán)境,都是一些組織損傷后形成的瘢痕組織,如梗死心肌的瘢痕組織等,在這些組織內(nèi)往往血管分布稀少,除了腫瘤細胞外,正常細胞在植入的初期很難在這些組織內(nèi)成活下來。因此,心肌損傷后瘢痕組織內(nèi)的血管系統(tǒng)重建,是心肌前體細胞移植成活的關(guān)鍵。
終上所述,如何有效解決干細胞分化后,如何篩選純化心肌組織前體細胞、如何在壞死組織部位重建心血管、以及如何有效控制細胞在植入體內(nèi)后發(fā)生瘤變,是細胞移植治療充血性心率衰竭的關(guān)鍵。故本發(fā)明提供一種用于梗死心肌修復(fù)與血管重建的細胞移植組合物,無疑對充血性心力衰竭患者帶來了希望。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種用于梗死心肌修復(fù)與血管重建的細胞移植組合物,該組合物包括移植輔助細胞,以及體外制備心肌前體細胞的基因工程載體。移植輔助細胞具有植入到心梗區(qū)瘢痕組織后,可以促進心梗區(qū)血管的生成,同時提高心肌前體細胞移植成活率的作用;基因工程載體用于體外從病人(或動物)骨髓干細胞中制備出心肌修復(fù)的高純度心肌前體細胞。
本發(fā)明組合物還包括與上述基因工程載體上的自殺基因相對應(yīng)的藥物,用于在移植輔助細胞與心肌前體細胞植入心梗區(qū)內(nèi)并形成自己的血管系統(tǒng)后,將移植輔助細胞及發(fā)生瘤變的心肌組織前體細胞從宿主體內(nèi)清除。由于心肌前體細胞可以來源于病人的骨髓,所以不需要免疫抑制劑來維持心肌前體細胞的存活。
為實現(xiàn)上述目的而采用的技術(shù)方案是這樣的即提供一種用于梗死心肌修復(fù)與血管重建的細胞移植組合物,該組合物包括移植輔助細胞、以及體外制備的心肌前體細胞的基因工程載體;所述移植輔助細胞為人或動物的肝竇內(nèi)皮細胞株或其他腫瘤細胞株、經(jīng)過表達自殺基因的病毒載體轉(zhuǎn)染后經(jīng)篩選得到的,能夠穩(wěn)定表達自殺基因產(chǎn)物的細胞;所述基因工程載體包括轉(zhuǎn)心肌細胞特異性啟動子及內(nèi)部核糖體進入位點序列(IRES)調(diào)控新酶素抗性基因和端粒酶催化亞基表達的雙順反子腺病毒載體,以及腫瘤細胞特異性啟動子調(diào)控自殺基因表達的慢病毒載體。
組合物中還包括與所述自殺基因相對應(yīng)的藥物。
上述組合物中所述腫瘤細胞特異性啟動子選自端粒酶催化亞基啟動子、甲胎蛋白啟動子、癌胚抗原啟動子、前列腺特異性啟動子、視黃酸效應(yīng)生長/分化因子啟動子、腎細胞因子啟動子、絡(luò)氨酸激酶啟動子、以及人工合成上述腫瘤細胞特異性啟動子突變序列中的一種。
所述心肌細胞特性啟動子選自心肌肌凝蛋白重鏈(MHC)啟動子、心肌肌凝蛋白輕鏈2(MLC2v)啟動子中的一種。
所述自殺基因選自胞嘧啶脫胺酶基因、單純皰疹病毒的胸苷激酶基因、水痘皰疹病毒胸苷激酶基因、細胞色素P450 2B1基因、核苷磷酸化酶基因中的一種。
所述與自殺基因相對應(yīng)的藥物選自5-氟胞嘧啶、丙氧鳥苷、6-甲氧嘌呤阿拉伯糖苷、環(huán)磷酰胺、6-甲基嘌呤脫氧核苷中的一種。
上述組合物可以通過目前成熟的基因工程及組織培養(yǎng)技術(shù)制備,其中1.所述移植輔助細胞的制備過程包括(1)人肝竇內(nèi)皮細胞株(或其他腫瘤細胞)的體外培養(yǎng);(2)用表達自殺基因的病毒載體轉(zhuǎn)染步驟(1)所述的細胞;(3)用步驟(2)所述病毒載體上真核抗性基因所對應(yīng)的抗生素培養(yǎng)基進行篩選培養(yǎng);(4)將步驟(3)得到的細胞進行自殺基因表型鑒定;(4)將能夠穩(wěn)定表達自殺基因產(chǎn)物的細胞克隆按常規(guī)方法進行擴大培養(yǎng);(5)移植前用PBS沖洗(4)所得到的細胞;2.所述雙順反子的腺病毒穿梭質(zhì)粒載體構(gòu)建(1)根據(jù)NCBI中所查到的MHC或MLC2v啟動子序列為依據(jù)進行PCR引物設(shè)計,并從人(或動物)組織細胞基因組DNA中擴增出不同長度的MHC或MLC2v啟動子片段;將MHC或MLC2v啟動子片段插入無啟子腺病毒穿梭質(zhì)粒載體中;在MHC或MLC2v啟動子的3′端插入報告基因;將新構(gòu)建好的腺病毒穿梭質(zhì)粒載體與腺病毒基因組質(zhì)粒在體外包裝成腺病毒顆粒;將包裝得到的腺病毒顆粒與含有心肌細胞或心肌前體細胞的培養(yǎng)體系共同培養(yǎng);培養(yǎng)24~48小時后,檢測報告基因的表達,選擇具有較強心肌細胞特異性表達報告基因的最短的MHC或MLC2v啟動子片段用于下一步的操作。(2)在普通無啟動子腺病毒穿梭質(zhì)粒載體(如pdc312等可以從市場購得)上的多克隆位點5’端插入MHC或MLC2v啟動子片段;(3)將IRES片段插入到MHC或MLC2v啟動子片段與PolyA片段的中間;(4)在MHC或MLC2v啟動子片段與IRES片段之間插入hTERT編碼序列;(5)在IRES與PolyA片段之間插入neor編碼序列;(6)最后用PCR對上一步操作所得到的質(zhì)粒載體進行鑒定。
3.所述腫瘤特異性表達CD慢病毒載體構(gòu)建(1)根據(jù)NCBI中所記載的端粒酶催化亞基啟動子、甲胎蛋白啟動子、癌胚抗原啟動子、前列腺特異性啟動子、視黃酸效應(yīng)生長/分化因子啟動子、腎細胞因子啟動子、絡(luò)氨酸激酶啟動子、人工合成腫瘤細胞特異性啟動子序列的其中一種進行引物設(shè)計,從人或動物的基因組DNA中擴增啟動子片段,或采用人工合成腫瘤細胞特異性啟動子片段;(2)用此片段取代慢病毒載體的啟動子片段;(3)在上一步操作所得到載體的腫瘤細胞特異性啟動子的3′端,接入報告基因;(4)將上一步操作所得到的載體與相應(yīng)的包裝質(zhì)粒有體外進行病顆粒包裝,并將得到的病毒顆粒去感染腫瘤細胞與正常組織原代培養(yǎng)的細胞;(5)病毒顆粒感染細胞24~48小時后,檢測各個培養(yǎng)細胞的報告基因表達情況,并選擇腫瘤細胞特異表達報告基因的載體用于下一步的操作。(6)根據(jù)NCBI所記載的胞嘧啶脫胺酶基因、單純皰疹病毒的胸苷激酶基因、水痘皰疹病毒胸苷激酶基因、細胞色素P450 2B1基因、核苷磷酸化酶編碼序列中的一種進行引物設(shè)計,并用PCR擴增相應(yīng)的自殺基因片段;(7)將自殺基因片段插入并取代步驟(3)所得載體中的報告基因片段,從而得到新序列腫瘤特異性表達自殺基因的慢病毒載體;4、所述與自殺基因相對應(yīng)的藥物可以通過任何藥物品市場獲取。
上述組合物在梗死心肌修復(fù)與血管重建中的使用過程(1)用組合物提供的雙順反子穿梭質(zhì)粒載體和腫瘤細胞特異性表達自殺基因慢病毒載體按常規(guī)方法分別包裝成腺病毒顆粒與慢病毒顆粒,并分離濃縮腺病毒顆粒和慢病毒顆粒;(2)BMSC的分離培養(yǎng);(3)用5-Az誘導體外培養(yǎng)的BMSC分化;(4)用腺病毒顆粒和慢病毒顆粒轉(zhuǎn)染分化后的BMSC;(5)轉(zhuǎn)染病毒后,將BMSC轉(zhuǎn)入含G418和與慢病毒載體上真核抗性基因(如blasticidin等)相應(yīng)抗生素的培養(yǎng)基中進行篩選培養(yǎng),得到的心肌前體細胞用PBS清洗掉真核抗生素后,即可用于移植手術(shù)。
(6)將發(fā)明組合物中的移植輔助細胞手術(shù)多點植入患者心梗區(qū)內(nèi),并每天肌肉注射環(huán)孢素A 1mg/公斤體重;(7)用超聲波檢測儀或CT等監(jiān)測移植輔助細胞的生長,當移植部位形成直徑為3~5毫米大小的腫瘤灶時,將操作步驟(5)所得到的細胞植入腫瘤灶內(nèi);(8)心肌細胞植入1~2周后,靜注或肌注適量與自殺基因相對應(yīng)的藥物如5-氟胞嘧啶等,連續(xù)用藥至移植輔助細胞被完全清除。
本發(fā)明的有益效果如下該組合物包括移植輔助細胞,以及體外制備心肌前體細胞的基因工程載體,其中移植輔助細胞具有植入到心梗區(qū)瘢痕組織后,可以促進心梗區(qū)血管的生成,同時提高心肌前體細胞移植成活率的作用;基因工程載體,可以從病人(或動物)骨髓干細胞中制備出心肌修復(fù)的高純度心肌前體細胞。利用本發(fā)明方法獲取的心肌前體細胞在心梗區(qū)內(nèi)移植成活并形成移植輔助細胞與心肌前體細胞自己的血管系統(tǒng)后,可以用特定的藥物將移植輔助細胞及發(fā)生瘤變的心肌組織前體細胞從宿主體內(nèi)清除。因而,采用本發(fā)明組合物進行梗死心肌修復(fù)及血管重建,不但具有心肌前體細胞移植成活率高,而且還避免了骨髓干細胞由于分化末盡等因素,而造成在植入體內(nèi)后發(fā)生瘤變的潛在危險,因而具有使用安全的特點。


圖1本發(fā)明用于梗死心肌修復(fù)與血管重建的細胞移植實施應(yīng)用方案流程圖。
圖2在體外培養(yǎng)的BMSC中加入5-氮雜胞苷進行誘導分化培養(yǎng)72小時后細胞圖(10×20)圖中所示,用文獻記載方法分離培養(yǎng)BMSC傳二代細胞,在加入5-Az誘導分化培養(yǎng)48小時后,大多數(shù)的細胞形體變寬,已經(jīng)開始出現(xiàn)衰老跡象,細胞很難再繼續(xù)增殖。
圖3加入5-氮雜胞苷同時轉(zhuǎn)染腺病毒Ad-MHCp-hTERT-IRES-neor后,細胞培養(yǎng)72小時圖(10×20)圖中所示,用本發(fā)明提供方法分離培養(yǎng)BMSC傳二代細胞,在加入5-Az誘導分化培養(yǎng)48小時后,絕大多數(shù)細胞體形呈長梭狀,細胞的數(shù)量明顯增多,顯示出較強的擴增能力。
圖4轉(zhuǎn)染腺病毒Ad-MHCp-hTERT-IRESneo后,心肌前體細胞端粒酶活性測定TRAP圖。圖中所示,和轉(zhuǎn)染前對照組相比較,含MHC啟動子驅(qū)動hTERT表達的腺病毒顆粒,轉(zhuǎn)染心肌前體細胞24小時后,細胞端粒酶的活性就得到顯著的提高。72小時后細胞端粒酶活性達到最高。
圖5G418及blasticidin雙抗篩選48小時后細胞圖(10×20)。圖中所示,加入5-氮雜胞苷同時轉(zhuǎn)染重組腺病毒及慢病毒顆粒后的BMSC,在加入G418及blasticidin雙抗篩選培養(yǎng)48小時后,大部分的細胞被殺死而呈懸浮狀態(tài)。
圖6G418及blasticidin雙抗篩選72小時后細胞圖(10×20)。圖中所示,加入5-氮雜胞苷同時轉(zhuǎn)染重組腺病毒及慢病毒顆粒后的BMSC,在加入G418及blasticidin雙抗篩選培養(yǎng)72小時后,有部分細胞聚集在一起,且出現(xiàn)高頻蠕動。
圖7加入G418及blasticidin進行雙抗篩選96小時后心肌前體細胞圖(10×20)。圖中所示,加入5-氮雜胞苷同時轉(zhuǎn)染重組腺病毒及慢病毒顆粒后的BMSC,在加入G418及blasticidin雙抗篩選培養(yǎng)96小時后,細胞開始出現(xiàn)明顯的心肌細胞外形特征,在細胞與細胞之間,甚至出現(xiàn)類似潤盤的結(jié)構(gòu)。
圖8pdc315-MHCp-EGFP腺病毒顆粒感染BMSC分化72小時后細胞共聚焦顯微鏡圖(10×63)。圖中所示,加入5-氮雜胞苷同時轉(zhuǎn)染重組腺病毒及慢病毒顆粒后的BMSC,經(jīng)過pdc315-MHCp腺病毒顆粒感染后,部分細胞有EGFP的表達,且表達EGFP的細胞具有心肌細胞的形狀。
圖9重組hTERT啟動子功能鑒定的激光共聚焦顯微鏡圖(10×63)。其中的圖A所示,荷載有hTERT啟動子驅(qū)動EGFP表達的慢病毒顆粒,在感染端粒酶陽性的腫瘤細胞后,能表達出肉眼可見的EGFP;圖B所示,荷載有hTERT啟動子驅(qū)動EGFP表達的慢病毒顆粒,在感染端粒酶陰性的正常組織原代培養(yǎng)細胞后,不能表達可見的EGFP;說明了人工合成的hTERT啟動子在端粒酶陽性腫瘤細胞中有很強的特異性表達活性。
具體實施例方式
本發(fā)明的上述內(nèi)容可以通過下面非限定性的實施例進一步說明。實施所需要組合物之外的材料均屬可購取的商品。
應(yīng)用實施舉例1利用所述組合物修復(fù)大鼠梗死心肌及血管重建1.心肌梗死大鼠模型建立取體重200克左右的SD大鼠,用乙醚麻醉后,固定于臺面上,接上大鼠專用呼吸機。用毛剪將胸部毛剪干凈并消毒后,外科手術(shù)打開胸腔,暴露心臟。用絲線結(jié)扎冠狀動脈的左前降支后,用手擠壓胸腔排出空氣,然后縫合胸腔。兩個月后,即可用于下一步操作。
2.大鼠心肌細胞特異性表達hTERT和neor的腺病毒雙順反子的腺病毒穿梭質(zhì)粒載體制備(1)用大鼠基因組DNA作模板,根據(jù)NCBI中所載序列X04267進行引物設(shè)計,其中上游引物為5’-CGGTCTAGATGGGAGGAAGAGGC 3’,下游引物為5’-TTGAATTCGTTGGCTGCAAAACA-3’,用PCR方法擴增大鼠心肌肌凝蛋白重鏈(MHC)啟動子序列。見序列表SEQ ID NO1。(2)然后將步驟(1)啟動子片段取帶腺病毒穿梭質(zhì)粒pdc315的mCMV啟動子,并在其多克隆位點上插入報告基因EGFP片段,得到的新載體命名為pdc315-pMHC-EGFP。將其進行病毒顆粒包裝后,轉(zhuǎn)染BMSC誘導分化后的細胞培養(yǎng)體系,并用共聚焦熒光顯微鏡鑒定EGFP的表達,結(jié)果見圖8。(3)用限制性內(nèi)切酶EcoRI,Not I消化質(zhì)粒pGRN145(可以從市場購得)和質(zhì)粒pIRESneor3,電泳并凝膠回收hTERT片段和線性pIRESneor3片段,用T4連接酶將hTERT片段和線性pIRESneor3片段連接起來,得到的腺病毒穿梭質(zhì)粒命名為phTERT-IRES-neor;(4)用限制性內(nèi)切酶EcoRI,XbaI消化質(zhì)粒phTERT-IRES-neor,用EcoR I,NheI消化質(zhì)粒消化腺病毒穿梭質(zhì)粒pdc315-pMHC,分別回收hTERT-IRES-neor片段,和線性腺病毒穿梭質(zhì)粒pdc315-pMHC片段,并用T4DNA連接酶將回收的兩片段進行連接,得到的重組質(zhì)粒命名為pdc315-pMHC-hTERT-IRES-neor,即是本發(fā)明所述心肌細胞特異性表達hTERT和neor的腺病毒雙順反子的腺病毒穿梭質(zhì)粒載體,其核苷酸序列見序列表SEQ ID NO.2。
3.腫瘤特異性表達CD及EGFP慢病毒載體構(gòu)建(1)以NCBI中序列AB016767的第2930~3762之間的堿基序列為基礎(chǔ)進行啟動子序列設(shè)計,為了提高啟動子在腫瘤細胞中的轉(zhuǎn)錄活性,同時降低在端粒酶陰性細胞中的表達活性,在序列的內(nèi)部插入了一些順式作用元件序列(見序列表SEQ ID NO3.);為了下一步能夠方便地取代慢病毒載體上的啟動子,在序列的5’端引入了ClaI限制性內(nèi)切酶位點識別序列,在序列的3’端引入了BamHI限制性內(nèi)切酶位點識別序列,最后采用人工化學合成法合成,并將其亞克隆入PUC57中,命名為PUC57-phTERT;(2)根據(jù)NCBI注冊的序列S56903,進行引物設(shè)計,為了方便與載體進行連接,我們在上游引物的5端引入B amHI限制性內(nèi)切酶識別位點序列,在下游引物的5端引入AgeI限制性內(nèi)切酶識別位點序列,因而,上游引物為5’-ATAGGATCCGACAGCAGCAATGAC-3’,下游引物為5’-TATACCGGTGCGTTGGAGGAAT-3’。然后進行PCR擴增;(3)用PCR方法用擴增EGFP片段,其上游引物為5’-CACCATGGTGAGCAAGGGC-3’,下游引物為5’-ACAACACTCAACCCTATCTCGGTCT-3’,PCR產(chǎn)物與試劑盒pLenti6/V5 Directional TOPOCloning Kit(可從Invitrogen公司購買)中的線性慢病毒載體進行TOP連接,得到的載體命名為pLenti-EGFP;(4)用限制性內(nèi)切酶BamH I、Age I消化步驟(2)的PC R產(chǎn)物,以及慢病毒載體plenti-EGFP,最后用瓊脂糖凝膠電泳方法分別回收CD片段和線性載體片段;用T4DNA連接酶將CD片段和線性載體片段進行連接,得到的表達CD的慢病毒載體質(zhì)粒命名為pLenti-CMVp-CD;(5)用限制性內(nèi)切酶Cla I、BamH I消化步驟(1)所得質(zhì)粒PUC57-phTERT,以及慢病毒載體pLenti-CMVp-CD,分別用凝膠電泳回收phTERT啟動子片段及無啟動子慢病毒載體pLenti-CD片段,并用連接酶將所回收的兩條片段進行連接,得到的質(zhì)粒載體即是腫瘤特異性表達CD的慢病毒載體,并命名為pLenti-phTERT-CD,其核苷酸組成見序列表SEQ ID NO.4;(6)用hTERT啟動子取代步驟(3)所得到慢病毒載體pLenti-EGFP上的CMV啟動子片段后,得到的質(zhì)粒命名為pLenti-phTERT-EGFP。
4.慢病毒顆粒的體外包裝與純化(1)將上述操作所得到的慢病毒質(zhì)粒載體plenti-hTERT-CD和plenti-hTERT-EGFP,轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)大腸桿菌中進行擴增,并制備大量的超純質(zhì)粒;將此兩種超純質(zhì)粒分別與Invitrogen公司的慢病毒包裝質(zhì)粒plp1、plp2、plpVSV-G按一定比例與陽離子脂質(zhì)體混合后,轉(zhuǎn)入293FT細胞中進行包裝并分離純化病毒顆粒,(具體操作按pLenti6/V5 Directional TOPOCloning Kit指導說明書進行);(2)將由質(zhì)粒plenti-hTERT-EGFP及plenti-CMV-EGFP包裝而來的慢病毒顆粒分別與端粒酶陽性的hLSEC細胞、結(jié)腸癌細胞(SW480)、人胚腎上皮腫瘤細胞(293FT)、肝癌細胞(HepGII)、胃癌細胞(SGC7901)、黑色素瘤細胞(B16)等,以及端粒酶表達陰性的人骨肉瘤細胞(U20S)、W38細胞、正常組織細胞進行共同培養(yǎng),48小時后,用激光共聚焦顯微鏡觀察EGFP的表達。其結(jié)果見圖9。
5.腺病毒顆粒的包裝鑒定(1)將負載心肌細胞特異性表達hTERT和neor的穿梭質(zhì)粒pdc315-MHCp-hTERT-IRES-neor與腺病毒包裝質(zhì)粒pBHGloxDeltaEl,3Cre共轉(zhuǎn)染人胚腎293細胞(HEK293);(2)當60%~80%的包裝細胞出現(xiàn)變圓,并有部分細胞開始出現(xiàn)脫壁的細胞病理現(xiàn)象(CPE)時,利用超聲波將細胞破碎并離心分離,收集含有病毒顆粒的上清液,包裝得到的病毒顆粒命名為Ad-MHCp-hTERT-IRES-neor,純化后進行病病毒顆粒測定、及雙引物PCR鑒定。具體操作按元陽公司提供方法進行。此方法得到的病毒滴度可達5×109VP/ml以上(注如果OD260小于0.1則用氯化銫梯度超高速離心濃縮病毒回收液后再測)。PCR鑒定MHC片段的引物為上游引物為5’-CTAGGTCCTAACAGAC-3,下游引物為5’-TGTCTCTCCTAGATTC-3’(產(chǎn)物大小為247bp);鑒定hTERT片段的引物為5’-TCTGGGATGCGAACGG-3’,下游引物為5’-ACGGATGGGTGGGAGTG-3’(產(chǎn)物大小為309bp).
6.心肌前體細胞的制備從體重為150~200克健康2月齡SD大鼠,乙醚吸入麻醉后,無菌條件下取下股骨和脛骨,用PBS沖洗干凈后,除去骨端,暴露骨腔;用含10%胎年血清的DMEM/F12(比例為1∶1)5毫升沖洗骨腔;用5毫升移液槍反復(fù)吹打沖洗液,直到看不到凝塊后,接種于50毫升細胞培養(yǎng)瓶中;繼續(xù)培養(yǎng)24小時后,換液去除不貼壁的細胞;繼續(xù)37℃二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至80%細胞呈融合狀態(tài);吸凈培養(yǎng)液,用0.25%胰蛋白酶室溫消化細胞3~4分鐘;加入15毫升含10%胎年血清的DMEM/F12終止消化,用5毫升移液槍反復(fù)吹打細胞致懸浮狀態(tài)后,接種于3個50毫升細胞培養(yǎng)瓶中;37℃二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20分鐘后,輕輕地將末貼壁細胞懸液轉(zhuǎn)入另外的培養(yǎng)瓶中;重復(fù)此操作2遍后,于37℃二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至細胞呈40%~60%融合狀態(tài);吸掉培養(yǎng)基,加入含終濃度為10uM的5-氮雜胞苷(5-Az),106~109pfu/ml腺病毒Ad-MHCp-hTERT顆粒,105~109VP/ml慢病毒pLenti-hTERTp-CD顆粒的培養(yǎng)基,37℃二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng);72小時后,更換無5-Az的含終濃度為50ug/ml的G418和2ug/ml的blasticidin的培養(yǎng)基進行雙抗性篩選培養(yǎng);以后,每換一次液,G418和殺稻瘟菌素的濃度增大50ug/ml,blasticidin濃度增大2ug/ml。最后,G418最后將終濃度維持在400ug/ml,blasticidin終濃度維持在10ug/ml;當細胞傳到10代時,即可收集到用于梗死心肌修復(fù)治療所需要的細胞,見附圖7。并于手術(shù)移植前用PBS溶液清洗掉抗生素。
7.移植輔助細胞的基因工程改造及制備將生長狀況良好的HLSEC接種于培養(yǎng)培養(yǎng)板上,當細胞長至40~60%融合狀態(tài)時,更換培養(yǎng)液,加入含終濃度為106~109VP/ml的慢病毒Lenti-CMVp-CD顆粒的培養(yǎng)基,37℃二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72小時后,將培養(yǎng)基更換為含有終濃度為10ug/ml的blasticidin的培養(yǎng)基進行抗性篩選培養(yǎng)。篩選后得到的細胞進行克隆培養(yǎng),經(jīng)過傳5~10代的抗性篩選培養(yǎng)后,進行CD藥物敏感實驗。挑選對CD敏感的細胞克隆進行擴增培養(yǎng),并于手術(shù)移植前用PBS溶液清洗。
8.細胞移植重建血管及修復(fù)梗死心肌的操作(1)外科手術(shù)打開大鼠心肌梗塞模型胸腔,暴露心臟,在心肌梗的區(qū)域內(nèi)植入104~106個對CD敏感的HLSEC細胞(輔助細胞),然后縫合胸腔(具體操作與大鼠心肌梗塞模型建立方法相同);(2)每天肌肉注射1毫克環(huán)孢素A(GsA)以抑制大鼠對移植輔助細胞的免疫排斥反應(yīng);(3)用B超或CT等,檢測移植輔助細胞的生長,當移植輔助細胞植入點形成3~5毫米大小的腫瘤灶時,用步驟(3)的方法植入105~108個本發(fā)明方法制備的源于BMSC的心肌前體細胞。
9.藥物清除受體內(nèi)輔助細胞及瘤變的心肌前體細胞細胞移植2~5周后,開始每日靜脈注射5-Fc三次,每次給藥劑量為50~200mg/kg.體重,連續(xù)用藥3~5天即可達到清除HLSEC,以及癌變的心肌前體細胞的目的。
應(yīng)用實施案例2利用本發(fā)明組合物修復(fù)人類梗死心肌及血管重建1.人類心肌細胞特異性表達hTERT和neor的腺病毒雙順反子的腺病毒穿梭質(zhì)粒載體制備將序列表SEQID NO.1和SEQ ID NO.2中的啟動子序列更換為人類MHC或者MLC2v啟動子序列,即可得到人類心肌細胞特異性表達hTERT和neor的腺病毒雙順反子的腺病毒穿梭質(zhì)粒載體。
2.人類心肌前體細胞的制備抽取需進行移植術(shù)心?;颊?~10毫升骨髓后,按照與“應(yīng)用實施案例1”相同的方法進行人類心肌前體細胞的制備。
3.以后步驟與方法與“應(yīng)用實施案例1”相同。
序列表<110>重慶大學<120>一種用于梗死心肌修復(fù)與血管重建的細胞移植組合物<160>4<170>PatentIn Version2.1<210>1<211>492<212>DNA<213>大鼠(rat)<220>
<221>promoter<222>(10)...(499)<220>
<221>promoter<222>(1)...(492)<400>1tgggaggaag aggccatgtc aattaaaaag cagttcaaac tgcctctgcc attttctgct 60cagcatcctc tctttgagga atgcctttac ttatttttat tatggtattt aacttgggat 120gttctgttct ccatacctgt acttctcaga aaaggaagac aaagtgtcaa aagtggcatt 180tcaaaggctc cttcaccaga ctgaaagaat caagagacac ttggattaaa cagattctaa 240gcccatggca tacagtagca actcaacaaa cacgagtgga ttatgttttc ccagtgctga 300gccctcgtgt gaagctccac tgggcatggg acaggccaga tctccttgac cttgtctgag 360aggctgccat ccacttcagg gtgacaggtt gatactagga tgggcaggag gctgccggct 420gccggctgcc ggcccaggga gcagctgggc tgactggcag tttgttttgc agccaactgt 480tttgcagcca ac 492
<210>2<211>9066<212>DNA<213>腺病毒穿梭質(zhì)粒載體<220>
<221>promoter<222>(461)...(951)<400>2ttcatcaata atatacctta ttttggattg aagccaatat gataatgagg gggtggagtt 60tgtgacgtgg cgcggggcgt gggaacgggg cgggtgacgt agtagtgtgg cggaagtgtg 120atgttgcaag tgtggcggaa cacatgtaag cgacggatgt ggcaaaagtg acgtttttgg 180tgtgcgccgg tgtacacagg aagtgacaat tttcgcgcgg ttttaggcgg atgttgtagt 240aaatttgggc gtaaccgagt aagatttggc cattttcgcg ggaaaactga ataagaggaa 300gtgaaatctg aataattttg tgttactcat agcgcgtaat atttgtctag ggccgcgggg 360actttgaccg tttacgtgga gactcgccca ggtgtttttc tcaggtgttt tccgcgttcc 420gggtcaaagt tggcgtttta ttattatagt cagntctaga tgggaggaag aggccatgtc 480aattaaaaag cagttcaaac tgcctctgcc attttctgct cagcatcctc tctttgagga 540atgcctttac ttatttttat tatggtattt aacttgggat gttctgttct ccatacctgt 600acttctcaga aaaggaagac aaagtgtcaa aagtggcatt tcaaaggctc cttcaccaga 660ctgaaagaat caagagacac ttggattaaa cagattctaa gcccatggca tacagtagca 720actcaacaaa cacgagtgga ttatgttttc ccagtgctga gccctcgtgt gaagctccac 780tgggcatggg acaggccaga tctccttgac cttgtctgag aggctgccat ccacttcagg 840gtgacaggtt gatactagga tgggcaggag gctgccggct gccggctgcc ggcccaggga 900gcagctgggc tgactggcag tttgttttgc agccaactgt tttgcagcca acgaattccc 960cccgcgatgc cgcgcgctcc ccgctgccga gccgtgcgct ccctgctgcg cagccactac 1020cgcgaggtgc tgccgctggc cacgttcgtg cggcgcctgg ggccccaggg ctggcggctg 1080gtgcagcgcg gggacccggc ggctttccgc gcgctggtgg cccagtgcct ggtgtgcgtg 1140ccctgggacg cacggccgcc ccccgccgcc ccctccttcc gccaggtgtc ctgcctgaag 1200
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權(quán)利要求
1.一種用于梗死心肌修復(fù)與血管重建的細胞移植組合物,該組合物包括移植輔助細胞、以及體外制備的心肌前體細胞的基因工程載體;所述移植輔助細胞是經(jīng)過表達自殺基因的病毒載體轉(zhuǎn)染后篩選得到的,能夠穩(wěn)定表達自殺基因產(chǎn)物的人或動物的肝竇內(nèi)皮細胞株或其他腫瘤細胞株;所述基因工程載體包括心肌細胞特異性啟動子及內(nèi)部核糖體進入位點序列調(diào)控新酶素抗性基因和端粒酶催化亞基同時表達的雙順反子腺病毒載體,以及腫瘤細胞特異性啟動子調(diào)控自殺基因表達的慢病毒載體。
2.如權(quán)利要求1所述用于梗死心肌修復(fù)與血管重建的細胞移植組合物,其特征是組合物中還包括與自殺基因相對應(yīng)的藥物。
3.如權(quán)利要求1或2所述用于梗死心肌修復(fù)與血管重建的細胞移植組合物,其特征是所述腫瘤細胞特異性啟動子選自端粒酶催化亞基啟動子、甲胎蛋白啟動子、癌胚抗原啟動子、前列腺特異性啟動子、視黃酸效應(yīng)生長/分化因子啟動子、腎細胞因子啟動子、絡(luò)氨酸激酶啟動子、人工合成腫瘤細胞特異性表達啟動子中的一種。
4.如權(quán)利要求1或2所述用于梗死心肌修復(fù)與血管重建的細胞移植組合物,其特征是所述心肌細胞特性啟動子選自MHC啟動子、MLC2v啟動子中的一種。
5.如權(quán)利要求1或2所述用于梗死心肌修復(fù)與血管重建的細胞移植組合物,其特征是所述自殺基因選自胞嘧啶脫胺酶基因、單純皰疹病毒的胸苷激酶基因、水痘皰疹病毒胸苷激酶基因、細胞色素P450 2B1基因、核苷磷酸化酶基因中的一種。
6.如權(quán)利要求3所述用于梗死心肌修復(fù)與血管重建的細胞移植組合物,其特征是所述人工合成的腫瘤細胞特異性表達啟動子為人工合成核苷酸的序列,其核苷酸組成為SEQ ID No.3。
7.如權(quán)利要求1或2所述用于梗死心肌修復(fù)與血管重建的細胞移植組合物,其特征是所述腫瘤細胞特異性啟動子調(diào)控自殺基因表達的慢病毒載體的核苷酸組成為SEQ ID No.4。
8.如權(quán)利要求2所述用于梗死心肌修復(fù)與血管重建的細胞移植組合物,其特征是所述與自殺基因相對應(yīng)的藥物選自5-氟胞嘧啶、丙氧鳥苷、無環(huán)鳥苷、6-甲氧嘌呤阿拉伯糖苷、環(huán)磷酰胺、6-甲基嘌呤脫氧核苷中的一種。
全文摘要
本發(fā)明的目的是提供一種用于梗死心肌修復(fù)與血管重建的細胞移植組合物,該組合物包括移植輔助細胞,以及體外制備心肌前體細胞的基因工程載體。移植輔助細胞具有植入到心梗區(qū)瘢痕組織后,可以促進心梗區(qū)血管的生成,同時提高心肌前體細胞移植成活率的作用;基因工程載體用于體外從病人(或動物)骨髓干細胞中制備出心肌修復(fù)的高純度心肌前體細胞。本發(fā)明組合物還包括與上述基因工程載體上的自殺基因相對應(yīng)的藥物,用于在移植輔助細胞與心肌前體細胞植入心梗區(qū)內(nèi)并形成自己的血管系統(tǒng)后,將移植輔助細胞及發(fā)生瘤變的心肌組織前體細胞從宿主體內(nèi)清除。由于心肌前體細胞可以來源于病人的骨髓,所以不需要免疫抑制劑來維持心肌前體細胞的存活。
文檔編號A61L27/54GK101020081SQ200710078299
公開日2007年8月22日 申請日期2007年3月16日 優(yōu)先權(quán)日2007年3月16日
發(fā)明者楊應(yīng)斌, 蔡紹皙, 楊力, 蔡紹暉, 于淑惠, 李軍華 申請人:重慶大學
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