本發(fā)明涉及一種基于轉(zhuǎn)錄組測序開發(fā)劍麻ssr標記引物的方法，屬于分子生物學技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

劍麻屬龍舌蘭屬多年生草本植物，原產(chǎn)于墨西哥等熱帶、亞熱帶地區(qū)，我國保存的種質(zhì)資源嚴重缺乏，僅有100余份?，F(xiàn)有的種質(zhì)資源主要是通過麻園選育、雜交和引種獲得，遺傳背景模糊，命名極不規(guī)范，給種質(zhì)資源的保存和應(yīng)用以及育種工作帶來了極大的不便。因此需要一種快速有效的方法對現(xiàn)有的種質(zhì)資源進行遺傳多樣性分析和資源鑒定。

微衛(wèi)星dna（microsatellitedna）又稱簡單重復(fù)序列（simplesequencerepeat,ssr）是由1-6個核苷酸為重復(fù)單位串聯(lián)而成的長達幾十個核苷酸的重復(fù)序列。其側(cè)翼通常都是保守性高的單拷貝序列，因此可根據(jù)側(cè)翼序列設(shè)計引物進行pcr擴增，由于重復(fù)片段大小或重復(fù)次數(shù)的差異，顯示微衛(wèi)星位點的多態(tài)性。與其它分子標記相比，ssr標記具有多態(tài)性高、共顯性遺傳、技術(shù)簡單、重復(fù)性好，特異性強以及操作便利等優(yōu)點，廣泛應(yīng)用于遺傳多樣性分析、種質(zhì)資源鑒定以及遺傳圖譜構(gòu)建等領(lǐng)域。但對于ssr標記的應(yīng)用前提是，必須首先要從該物種中獲取重復(fù)序列兩側(cè)的序列信息，并設(shè)計引物，而后才能被應(yīng)用。

ssr標記可分為基因組ssr(gssr)和表達序列標簽ssr（est-ssr），與gssr標記相比，通過表達序列標簽（expressedsequencetag，est）序列開發(fā)ssr標記更經(jīng)濟，效率更高，而且在不同屬內(nèi)的通用性更好。隨著分子生物學和測序技術(shù)的快速發(fā)展，est序列數(shù)據(jù)急劇增加，加上生物信息學的飛速發(fā)展使得大批量數(shù)據(jù)處理成為可能，因此給ssr標記的開發(fā)提供了大量的序列信息資源和技術(shù)支持。并且est-ssr標記是基于某一時期的表達標簽序列，能直接與功能基因相關(guān)，在分子標記輔助育種如重要性狀相關(guān)標記關(guān)聯(lián)分析、分離和新基因的鑒定等方面均有極高的應(yīng)用價值。

目前劍麻的全基因組信息未知，ssr標記缺乏，劍麻ssr標記引物未見報道。隨著高通量測序技術(shù)和生物信息學的飛速發(fā)展，對于無參考基因組的轉(zhuǎn)錄組分析，技術(shù)非常成熟。因此，利用某一發(fā)育時期或逆境脅迫下的劍麻為材料，開展劍麻轉(zhuǎn)錄組研究成為可能，這不僅可以挖掘劍麻自身的功能基因，同時對解決劍麻種質(zhì)資源背景模糊，ssr標記缺乏等實際問題具有十分重要的現(xiàn)實意義。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種基于轉(zhuǎn)錄組測序開發(fā)劍麻ssr標記引物的方法，通過轉(zhuǎn)錄組測序的方法，獲得劍麻某一特定時期的轉(zhuǎn)錄組序列，然后通過生物信息學分析軟件開發(fā)劍麻ssr標記，為后續(xù)利用ssr標記引物進行劍麻遺傳多樣性研究、種質(zhì)資源的鑒定提供可靠的技術(shù)手段。

為實現(xiàn)上述目的，本方法采用的技術(shù)方案是：

一種基于轉(zhuǎn)錄組測序開發(fā)劍麻ssr標記引物的方法，包括如下步驟：

（1）totalrna的提取與轉(zhuǎn)錄組文庫的構(gòu)建

采用trizol裂解法提取劍麻葉片總rna，用帶有oligo(dt)的磁珠富集mrna，反轉(zhuǎn)錄并合成雙鏈cdna，經(jīng)qiaquickpcrpurificationkit純化后，在cdna末端添加腺嘌呤核苷進行末端修復(fù)并連接測序接頭，然后用瓊脂糖凝膠電泳回收目標片段，最后對回收片段進行pcr擴增，擴增產(chǎn)物即為轉(zhuǎn)錄組文庫；

（2）轉(zhuǎn)錄組測序及序列質(zhì)量分析

用illumina2500測序平臺進行轉(zhuǎn)錄組測序，所得原始序列以fastaq格式保存；由于原始序列含有低質(zhì)量的序列，在進行數(shù)據(jù)分析之前先對原始數(shù)據(jù)進行質(zhì)量分析和過濾。

（3）轉(zhuǎn)錄本組裝與ssr分析

利用trinity軟件將所得有效序列拼接成一個完整的轉(zhuǎn)錄組，作為后續(xù)分析的參考序列，取每條基因中最長的轉(zhuǎn)錄本作為unigene，采用misa1.0軟件對每個unigene進行簡單序列重復(fù)（ssr）分析；

（4）ssr標記引物設(shè)計、擴增與檢測

采用引物設(shè)計軟件primer3進行ssr引物設(shè)計，從所設(shè)計的ssr引物中隨機選取100對引物，首先以熱麻1號基因組dna為模板，采用touch-downpcr程序進行擴增，擴增產(chǎn)物經(jīng)3%瓊脂糖凝膠電泳，初步篩選有穩(wěn)定產(chǎn)物的ssr引物，然后以6份劍麻種質(zhì)dna為模板，采用touch-downpcr程序，對有穩(wěn)定產(chǎn)物的ssr引物進行pcr擴增，擴增產(chǎn)物經(jīng)3%瓊脂糖凝膠電泳，進一步篩選多態(tài)性的ssr標記引物，檢測ssr標記引物的有效性。

步驟（1）所述的接頭序列為seqidno.1-seqidno.2。

步驟（2）所述的低質(zhì)量序列是指不確定堿基n比例大于10%的序列和低質(zhì)量堿基含量大于50%的序列；低質(zhì)量堿基指q≤5的堿基。

步驟（4）所述的ssr標記篩選參數(shù)為：單核苷酸的重復(fù)次數(shù)大于或等于10次，二核苷酸重復(fù)次數(shù)大于或等于6次，三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸、六核苷酸的重復(fù)次數(shù)大于或等于5次。

步驟（4）所述的ssr標記引物設(shè)計參數(shù)為：引物長度18-25bp，退火溫度tm56-65℃，預(yù)期產(chǎn)物長度為100-300bp。

步驟（4）所述的touch-downpcr擴增程序為：首先94℃15s，60℃15s，72℃30s，16個循環(huán)，每個循環(huán)退火溫度降低0.7℃；然后進入下一個擴增階段：94℃15s，50℃15s，72℃30s，15個循環(huán)，最后72℃延伸60min，擴增產(chǎn)物4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

步驟（4）所述的有多態(tài)性的18對ssr標記引物組序列為seqidno.3-seqidno.38。

步驟（4）所述的6份劍麻種質(zhì)為熱麻1號、h.11648、番麻、普通劍麻、桂幅4號和廣西76416。

本發(fā)明的有益效果為：

（1）通過轉(zhuǎn)錄組測序的方法，獲得劍麻某一特定時期的轉(zhuǎn)錄組序列，然后通過生物信息學分析軟件開發(fā)劍麻ssr標記，開發(fā)了一種基于轉(zhuǎn)錄組測序開發(fā)劍麻ssr標記引物的方法，開發(fā)效率更高。

（2）本發(fā)明為劍麻ssr標記開發(fā)提供了一條新的有效途徑，填補了目前劍麻ssr標記引物稀缺的空白。

附圖說明

圖1劍麻ssr標記引物開發(fā)流程圖；

圖2瓊脂糖凝膠電泳檢測部分劍麻ssr標記引物擴增產(chǎn)物；

圖3劍麻ssr標記引物多態(tài)性篩選。

具體實施方式

下面通過實例對本發(fā)明做進一步詳細說明，這些實例僅用來說明本發(fā)明，并不限制本發(fā)明的范圍。未加特殊說明，轉(zhuǎn)錄組文庫構(gòu)建與測序均按標準流程進行，所有試劑盒操作均按試劑盒說明書進行，所有的試劑均為生物試劑。

本發(fā)明所提供的18對ssr標記引物組均來自熱麻1號轉(zhuǎn)錄組序列，其引物核酸序列分別為seqidno.3-seqidno.38。所用的植物材料為熱麻1號，病原菌為煙草疫霉。

一．rna提取與轉(zhuǎn)錄組文庫構(gòu)建

取保存于本實驗室的煙草疫霉接種于馬鈴薯培養(yǎng)基（pda）上，28℃培養(yǎng)1周后，接種熱麻1號葉片，取不同接種時間的熱麻1號葉片進行轉(zhuǎn)錄組測序。具體步驟如下：

用滅菌的大頭針將葉片正面刺傷，取直徑為5mm的菌餅，將菌餅的菌絲生長面貼在傷口的位置，用無菌濕棉花保濕，然后用保鮮膜包裹葉片，置于25-30℃條件下培養(yǎng)，并分別在接種前、接種24小時、36小時、48小時和72小時取葉片，液氮速凍后保存于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

采用trizol裂解法提取熱麻1號葉片總rna，具體操作按說明書進行。采用nanodrop-2000分光光度計和bioanalyzer2100生物分析儀對rna質(zhì)量進行檢測。質(zhì)量合格的rna樣品將用于轉(zhuǎn)錄組文庫構(gòu)建。文庫構(gòu)建采用illumina公司的文庫構(gòu)建試劑盒進行。首先用帶有oligo（dt)的磁珠富集mrna，并將mrna片段化并反轉(zhuǎn)錄成第一鏈cdna，然后合成雙鏈cdna，經(jīng)qiaquickpcrpurificationkit純化后，在cdna末端添加腺嘌呤核苷進行末端修復(fù)并連接測序接頭，然后用瓊脂糖凝膠電泳回收目標片段，最后對回收片段進行pcr擴增，擴增產(chǎn)物即為轉(zhuǎn)錄組文庫，將用于后續(xù)的轉(zhuǎn)錄組測序。

二．測序與轉(zhuǎn)錄組分析

采用illumina2500測序平臺進行轉(zhuǎn)錄組測序，所得原始序列以fastaq格式保存。由于原始序列含有接頭污染和低質(zhì)量的序列，因此，為了防止這些序列對后續(xù)分析產(chǎn)生不利影響，在進行序列分析前，先要去掉測序時的接頭序列，不確定堿基（n）比例大于10%的序列以及低質(zhì)量堿基（q≤5）含量大于50%的序列，所得序列即為有效的轉(zhuǎn)錄組序列，并用于后續(xù)的序列分析。

利用trinity（版本為v2012-06-08，參數(shù)為默認參數(shù)）軟件將所得有效序列拼接成一個完整的轉(zhuǎn)錄組，作為后續(xù)分析的參考序列，取每條基因中最長的轉(zhuǎn)錄本作為unigene，熱麻1號總計獲得了103,326個轉(zhuǎn)錄本和70,110條unigene序列。轉(zhuǎn)錄本和unigene平均長度分別為726bp和645bp。轉(zhuǎn)錄本和unigene具體數(shù)目分布如表1所示。

表1轉(zhuǎn)錄本和unigene拼接長度頻數(shù)分布

三．ssr位點查找及引物設(shè)計

以熱麻1號70,110條unigene為材料，利用misa1.0軟件對unigene序列進行ssr位點查找，查找含有1、2、3、4、5和6堿基重復(fù)的ssr位點，且重復(fù)次數(shù)依次不小于10、6、5、5、5和5次。總計查找到了13,175個ssr位點，ssr密度分布出現(xiàn)頻率最高的依次為單核苷酸重復(fù)、二核苷酸重復(fù)和三核苷酸重復(fù)，分別為5001個、4339個和3676個。使用primer3.0軟件對ssr候選位點進行引物設(shè)計。引物設(shè)計參數(shù)為，引物長度18-26bp，gc含量40%-60%，退火溫度tm值55-65℃（上下游引物的tm值相差不能大于5℃）；pcr目標產(chǎn)物在100-300bp；盡量避免產(chǎn)生引物二聚體，發(fā)夾結(jié)構(gòu)、錯配等。總計設(shè)計了11,946對ssr引物。其中長度為20bp的引物最多，為10,270對，占總引物的85.97%。

四．ssr標記引物的有效性驗證

從10,270對引物中隨機選取100對引物進行pcr擴增，篩選有穩(wěn)定產(chǎn)物條帶的ssr標記引物，然后以6份劍麻種質(zhì)基因組dna為模板，對有穩(wěn)定產(chǎn)物的ssr標記引物進行擴增，篩選有多態(tài)性的ssr標記引物，檢測ssr標記引物的有效性。引物由生工生物工程（上海）有限公司合成，引物序列見核苷酸序列表(序列分別如seqidno.3-42)。

序列說明：sedidno.3-38為熱麻1號ssr標記引物序列，其中sedidno.3和4為一對ssr引物，sedidno.5和6為一對ssr引物，依次類推，18對引物的退火溫度和擴增產(chǎn)物大小見表2。

表218對劍麻ssr引物的退火溫度和擴增產(chǎn)物大小

1.dna提取

采用天澤公司的柱式植物dnaout試劑盒提取熱麻1號、h.11648、番麻、普通劍麻、桂幅4號和廣西76416等6份劍麻種質(zhì)的基因組dna。取葉片1克，經(jīng)液氮速凍后快速研磨成粉末，先加入750μl65℃預(yù)熱的裂解液，充分混勻后65℃預(yù)熱5-10分鐘，室溫13,000rpm離心5min，取上清液500μl分別進行抽提、漂洗后過柱，最后用100μl洗脫液洗脫2次，洗脫液即為提取的dna，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.pcr反應(yīng)體系的建立

20μlpcr反應(yīng)體系中各組份的濃度及使用量：2×novataq-pluspcrforestmix(江蘇愚公生命科技有限公司):2μl；引物(10μmol/l)f:0.2μl，r:0.2μl；dna:50ng(1μl)；滅菌ddh2o:8.6μl。novataq-pluspcrforestmix購自江蘇愚公生命科技有限公司。

touch-downpcr擴增程序：94℃(15s),60℃(15s)(△℃=-0.7，即每增加一個循環(huán)，退火溫度降低0.7℃)，72℃（30s）(16個循環(huán))，然后進入下一個擴增階段，94℃（15s）,50℃(15s),72℃(30s)(15個循環(huán))，最后72℃（60min），擴增產(chǎn)物4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

3.pcr產(chǎn)物的檢測

采用3%瓊脂糖凝膠（100ml1xtbe緩沖液中加入3g瓊脂糖）電泳檢測pcr產(chǎn)物。將20μlpcr產(chǎn)物全部上樣，先150v電泳10min，然后120v電泳40min，電泳結(jié)果于凝膠成像系統(tǒng)拍照保存。

本發(fā)明采用touch-downpcr程序，從100對熱麻1號ssr標記引物中，用瓊脂糖凝膠電泳篩選出了66對有穩(wěn)定產(chǎn)物條帶的ssr標記引物（附圖2），然后用6份劍麻種質(zhì)，從66對ssr標記引物中，篩選出了18對有多態(tài)性的ssr標記引物（附圖3），證實了通過轉(zhuǎn)錄組測序開發(fā)劍麻ssr標記引物是切實可行的。

序列表

<110>中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院南亞熱帶作物研究所

<120>一種基于轉(zhuǎn)錄組測序開發(fā)劍麻ssr引物的方法

<141>2017-07-14

<160>38

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>58

<212>dna

<213>人工序列

<400>1

aatgatacggcgaccaccgagatctacactctttccctacacgacgctcttccgatct58

<210>2

<211>57

<212>dna

<213>人工序列

<400>2

gatcggaagagcacacgtctgaactccagtcacatctcgtatgccgtcttctgcttg57

<210>3

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>3

tcgcgtgcaccaacaatttc20

<210>4

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>4

gtagcggatgtaggagacgc20

<210>5

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>5

tgcttcgactcctgcttctg20

<210>6

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>6

agtggtggccgtggaaatag20

<210>7

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>7

gtgtgtgtgtgtgtgttggg20

<210>8

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>8

ggccgaatcctttccactca20

<210>9

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>9

cgctcgtcctcttctttcgt20

<210>10

<211>23

<212>dna

<213>人工序列

<400>10

tcccatccaatagtccccca20

<210>11

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>11

ggtcatgatgaaggccacca20

<210>12

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>12

gcgaacctgcattgctgaat20

<210>13

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>13

ccttaggctccctgctgttc20

<210>14

<211>23

<212>dna

<213>人工序列

<400>14

ccacaagagccgctaccatc20

<210>15

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>15

aacaaccagagcccaaacca20

<210>16

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>16

ggggaggtggtttggtgatc20

<210>17

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>17

ggttagggttcttggtgggg20

<210>18

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>18

gcttcctgatcttcttgttggc22

<210>19

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>19

aaaatccatgaggcggctga20

<210>20

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>20

tagtagctaggcccaggcaa20

<210>21

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>21

acagcacgagaaatgagctca21

<210>22

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>22

ccgatccggcgtaattctct20

<210>23

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>23

gccttctcccacggaatcaa20

<210>24

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>24

tgtggagtgtgatgggagtg20

<210>25

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>25

tggagggtgatggatagggg20

<210>26

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>26

gatgaggccatcgttttggt20

<210>27

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>27

agagttgccagatgtgtgca20

<210>28

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>28

aggtgggattcttgcggatg20

<210>29

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>29

tcaaaagcaacgaacagcgg20

<210>30

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>30

cgacttcctcatcgatgcga20

<210>31

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>31

gcaggccctgtagtttgact20

<210>32

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>32

ttcgtgcccagtttctcctc20

<210>33

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>33

atcttcaggtttccgctgca20

<210>34

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>34

ccgagagagagcgagagaga20

<210>35

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>35

accgcattcatcggtctctc20

<210>36

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>36

ggtcctcgctctgatcttgg20

<210>37

<211>20

<212>dna

<213>熱人工序列

<400>37

attgcttgaagatggctgct20

<210>38

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>38

catgcataccttcctccccc20