本發(fā)明涉及微生物發(fā)酵
技術(shù)領(lǐng)域：
，更具體地說，本發(fā)明涉及一種γ-聚谷氨酸的發(fā)酵工藝。
背景技術(shù)：
：γ-聚谷氨酸在醫(yī)藥、食品、農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域均有廣泛的應(yīng)用，其經(jīng)濟價值不言而喻。在現(xiàn)有技術(shù)中，生產(chǎn)γ-聚谷氨酸的主流方法是微生物發(fā)酵法。γ-聚谷氨酸產(chǎn)生菌主要有四種：枯草(納豆)芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、耐高溫芽孢桿菌、炭疽芽孢桿菌。盡管對微生物發(fā)酵法生產(chǎn)γ-聚谷氨酸進行了大量研究，但γ-聚谷氨酸的產(chǎn)率仍然不樂觀。產(chǎn)率低導(dǎo)致γ-聚谷氨酸的生產(chǎn)成本高，限制了γ-聚谷氨酸的生產(chǎn)與應(yīng)用。由于γ-聚谷氨酸生物合成的機理至今尚不明確，代謝途徑復(fù)雜，目前提高γ-聚谷氨酸產(chǎn)率主要依靠選育優(yōu)良菌種和優(yōu)化發(fā)酵工藝。因此，提高γ-聚谷氨酸的產(chǎn)率是大規(guī)模生產(chǎn)與應(yīng)用亟待解決的重要課題。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的一個目的是解決至少上述問題，并提供至少后面將說明的優(yōu)點。本發(fā)明還有一個目的是提供一種節(jié)省成本、產(chǎn)率高的γ-聚谷氨酸的發(fā)酵工藝。為了實現(xiàn)根據(jù)本發(fā)明的這些目的和其它優(yōu)點，提供了一種γ-聚谷氨酸的發(fā)酵工藝，包括：s1：制備枯草芽孢桿菌種子液；s2：將枯草芽孢桿菌種子液接種于液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中，于37℃、120r/min搖瓶培養(yǎng)12-16h后，得發(fā)酵液；采用頻率為10-20khz且功率為5w/ml的超聲波處理發(fā)酵液3-5min后，其中，所述超聲波處理的具體步驟為：每超聲30s后，間隔30s再次超聲；將超聲波處理得到的發(fā)酵液低溫保存并加入肽聚糖冷凍膠囊，補料，再繼續(xù)37℃、120r/min搖瓶培養(yǎng)96h；s3：對發(fā)酵液進行提取、純化，得到γ-聚谷氨酸；其中，制備肽聚糖冷凍膠囊的具體的步驟為：s4：按質(zhì)量比3:1將肽聚糖和魔芋粉混合，向其中投入質(zhì)量為肽聚糖2倍的磁化水?dāng)嚢?，以冷卻速度3℃/min降至4℃，于磁場強度為0.45t的磁場環(huán)境保溫保持靜置24h，得肽聚糖混合液；s5：然后將肽聚糖混合液分裝到多個淀粉膠囊殼內(nèi)，其中每個淀粉膠囊殼盛裝3g步驟s4得到的肽聚糖混合液；s6：再以冷卻速度5℃/min將盛裝肽聚糖混合液的淀粉膠囊殼冷卻至-12℃，保溫6h，得肽聚糖冷凍膠囊。優(yōu)選地，所述液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基的碳源濃度為10-15g/l。優(yōu)選地，所述的γ-聚谷氨酸的發(fā)酵工藝還包括補料工藝，所述補料工藝的具體步驟為：在s2中將發(fā)酵液低溫保存后，添加補料維持發(fā)酵液中碳源濃度為40-60g/l。優(yōu)選地，所述補料為甘油和麥芽糖的混合物。優(yōu)選地，所述補料工藝的補料次數(shù)為兩次；第一次補料時間為：在s2中將發(fā)酵液低溫保存后；第二次補料與第一次補料的間隔時間為36-40h。優(yōu)選地，發(fā)酵液低溫保存并加入肽聚糖冷凍膠囊的具體步驟為：步驟一:制備預(yù)冷至-12℃的肽聚糖冷凍膠囊；步驟二:將發(fā)酵液在4℃靜置20分鐘后，在超凈臺中按1顆/15min向發(fā)酵液中逐步加入步驟一得到肽聚糖冷凍膠囊4顆，邊加入邊輕輕搖動；步驟三：將發(fā)酵液放置入20℃的培養(yǎng)箱靜置20分鐘；步驟四:將發(fā)酵液30°培養(yǎng)箱中靜置20分鐘。優(yōu)選地，超聲30s的具體步驟為：s7：采用頻率為10khz且功率為5w/ml的超聲波發(fā)酵液2s；s8：采用頻率為15khz且功率為5w/ml的超聲波發(fā)酵液3s；s9：采用頻率為20khz且功率為5w/ml的超聲波發(fā)酵液15s；s10：采用頻率為15khz且功率為5w/ml的超聲波發(fā)酵液5s；s11：采用頻率為10khz且功率為5w/ml的超聲波發(fā)酵液5s。優(yōu)選地，制備甘油和麥芽糖的混合物的過程為：s12：將質(zhì)量份數(shù)為10的水預(yù)熱至60℃，將質(zhì)量份數(shù)為1的麥芽糖緩慢加入到水中，邊加邊攪拌至麥芽糖完全溶解后冷卻到室溫后抽濾，得到第一混合溶液；s13：將s12中得到的第一混合溶液與質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1的甘油完全混合得到第二混合溶液，將第二混合溶液放置在37°培養(yǎng)箱備用。本發(fā)明至少包括以下有益效果：一、與現(xiàn)有技術(shù)相比較，本發(fā)明的γ-聚谷氨酸的產(chǎn)率高，且使用的設(shè)備及試劑均是實驗室常用的，故發(fā)明是一種節(jié)省成本的γ-聚谷氨酸的發(fā)酵工藝。二、與現(xiàn)有技術(shù)相比較，本發(fā)明的γ-聚谷氨酸的產(chǎn)率高達45g/l，故發(fā)明是一種節(jié)省成本的γ-聚谷氨酸的發(fā)酵工藝。本發(fā)明的其它優(yōu)點、目標(biāo)和特征將部分通過下面的說明體現(xiàn)，部分還將通過對本發(fā)明的研究和實踐而為本領(lǐng)域的技術(shù)人員所理解。具體實施方式下面結(jié)合實施例對本發(fā)明做進一步的詳細(xì)說明，以令本領(lǐng)域技術(shù)人員參照說明書文字能夠據(jù)以實施。需要說明的是，下述實施方案中所述實驗工藝，如無特殊說明，均為常規(guī)工藝，所述試劑和材料，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑獲得。本發(fā)明提供一種γ-聚谷氨酸的發(fā)酵工藝，包括：s1：制備枯草芽孢桿菌種子液；s2：將枯草芽孢桿菌種子液接種于液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中，于37℃、120r/min搖瓶培養(yǎng)12-16h后，得發(fā)酵液；采用頻率為10-20khz且功率為5w/ml的超聲波處理發(fā)酵液3-5min后，其中，所述超聲波處理的具體步驟為：每超聲30s后，間隔30s再次超聲；將超聲波處理得到的發(fā)酵液低溫保存并加入肽聚糖冷凍膠囊，補料，再繼續(xù)37℃、120r/min搖瓶培養(yǎng)96h；s3：對發(fā)酵液進行提取、純化，得到γ-聚谷氨酸；其中，制備肽聚糖冷凍膠囊的具體的步驟為：s4：按質(zhì)量比3:1將肽聚糖和魔芋粉混合，向其中投入質(zhì)量為肽聚糖2倍的磁化水?dāng)嚢?，以冷卻速度3℃/min降至4℃，于磁場強度為0.45t的磁場環(huán)境保溫保持靜置24h，得肽聚糖混合液；s5：然后將肽聚糖混合液分裝到多個淀粉膠囊殼內(nèi)，其中每個淀粉膠囊殼盛裝3g步驟s4得到的肽聚糖混合液；s6：再以冷卻速度5℃/min將盛裝肽聚糖混合液的淀粉膠囊殼冷卻至-12℃，保溫6h，得肽聚糖冷凍膠囊。本發(fā)明在發(fā)酵過程中，用超聲波處理發(fā)酵液，可以延長枯草芽孢桿菌處于對數(shù)期及穩(wěn)定期的時間；并且在超聲波處理發(fā)酵液后，用低溫保存的方法，延緩枯草芽孢桿菌的增殖速率及代謝速率，讓其短暫處于修養(yǎng)狀態(tài)，并且在低溫保存過程中加入肽聚糖刺激細(xì)胞膜的修復(fù)，并且在低溫處理后加入補料，補充發(fā)酵液的碳源，以免發(fā)酵時間延長引起碳源不足，導(dǎo)致細(xì)胞提前進入衰亡期。本發(fā)明將肽聚糖制備成肽聚糖冷凍膠囊，并且讓其保存在-12℃低溫狀態(tài)，而且在制備肽聚糖冷凍膠囊的過程中混合了魔芋粉，都是為了讓肽聚糖在加入到發(fā)酵液后，能緩慢釋放，以免復(fù)雜的發(fā)酵液成分對肽聚糖的破壞。同時，降溫的過程是一個階段性降溫過程，先降溫至4℃，是為了防止一次性降溫溫差大導(dǎo)致肽聚糖的析出。在將溫度從常溫降到4℃采用的是3℃/min的快速冷卻是為了加快試驗進度，從4℃降溫至-12℃采用的是5℃/min的快速冷卻，一方面是為了加快試驗進度，另一方面是為了快速通過最大冰晶區(qū)，防止冰晶破壞肽聚糖和魔芋粉形成的凝膠狀態(tài)。在肽聚糖和魔芋粉形成凝膠狀態(tài)后，將其置于磁場強度為0.45t的磁場環(huán)境保溫保持靜置24h，是為了在凝膠的結(jié)構(gòu)不會損壞的情況下，讓肽聚糖和魔芋粉結(jié)合力更大。制備肽聚糖冷凍膠囊使用的試劑均為無菌，且制備環(huán)境也為無菌，制備出的肽聚糖冷凍膠囊也是無菌。所述液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基的碳源濃度為10-15g/l。在發(fā)酵前期，枯草芽孢桿菌處于遲緩期，代謝不旺盛，需要的碳源較少，故處于成本的考慮，將液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基的碳源濃度設(shè)定在10-15g/l。所述的γ-聚谷氨酸的發(fā)酵工藝還包括補料工藝，所述補料工藝的具體步驟為：在s2中將發(fā)酵液低溫保存后，添加補料維持發(fā)酵液中碳源濃度為40-60g/l。液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基的碳源濃度設(shè)定在10-15g/l，而經(jīng)過遲緩期碳源基本被耗盡，在細(xì)胞進入對數(shù)期后，碳源的濃度需要在40-60g/l，才能維持其穩(wěn)定增長。加入的補料影響發(fā)酵的產(chǎn)率，加入補料的體積越小越好。所述補料為甘油和麥芽糖的混合物。碳源選擇甘油和麥芽糖是本發(fā)明的一個優(yōu)選方案，但不僅僅限于此，凡是可以達到補充碳源目的的碳源均在本發(fā)明的保護范圍內(nèi)。所述補料工藝的補料次數(shù)為兩次；第一次補料時間為：在s2中將發(fā)酵液低溫保存后；第二次補料與第一次補料的間隔時間為36-40h。在發(fā)酵液低溫保存后，枯草芽孢桿菌逐步進入對數(shù)生長期，為了維持其生長，需要在此時補料。而枯草芽孢桿菌在經(jīng)過對數(shù)生長期后，對碳源的耗費也較大，如果不及時補充碳源會導(dǎo)致其快速進入衰亡期，因此在第一次補料后，間隔36-40h進行第二次補料，第二次補料也維持發(fā)酵液中的碳源濃度為40-60g/l。發(fā)酵液低溫保存并加入肽聚糖冷凍膠囊的具體步驟為：步驟一:制備預(yù)冷至-12℃的肽聚糖冷凍膠囊；步驟二:將發(fā)酵液在4℃靜置20分鐘后，在超凈臺中按1顆/15min向發(fā)酵液中逐步加入步驟一得到肽聚糖冷凍膠囊4顆，邊加入邊輕輕搖動；步驟三：將發(fā)酵液放置入20℃的培養(yǎng)箱靜置20分鐘；步驟四:將發(fā)酵液30°培養(yǎng)箱中靜置20分鐘。在加入肽聚糖冷凍膠囊前將發(fā)酵液冷卻至4℃，延緩枯草芽孢桿菌的增殖速率及代謝速率，讓其短暫處于修養(yǎng)狀態(tài)，同時，便于其適應(yīng)肽聚糖冷凍膠囊的溫度，加入肽聚糖冷凍膠囊讓其逐步升溫，讓其逐步適應(yīng)發(fā)酵溫度。超聲30s的具體步驟為：s7：采用頻率為10khz且功率為5w/ml的超聲波發(fā)酵液2s；s8：采用頻率為15khz且功率為5w/ml的超聲波發(fā)酵液3s；s9：采用頻率為20khz且功率為5w/ml的超聲波發(fā)酵液15s；s10：采用頻率為15khz且功率為5w/ml的超聲波發(fā)酵液5s；s11：采用頻率為10khz且功率為5w/ml的超聲波發(fā)酵液5s。逐步提高超聲波頻率，讓枯草芽孢桿菌逐步適應(yīng)超聲波的刺激，在超聲波達到最大頻率處理后，再逐漸降低超聲波頻率，讓其逐步適應(yīng)無超聲波刺激的環(huán)境，這種梯度設(shè)置都是為了保護枯草芽孢桿菌。制備甘油和麥芽糖的混合物的過程為：s12：將質(zhì)量份數(shù)為10的水預(yù)熱至60℃，將質(zhì)量份數(shù)為1的麥芽糖緩慢加入到水中，邊加邊攪拌至麥芽糖完全溶解后冷卻到室溫后抽濾，得到第一混合溶液；s13：將s12中得到的第一混合溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1的甘油完全混合得到第二混合溶液，將第二混合溶液放置在37℃培養(yǎng)箱備用。將用于溶解麥芽糖的水預(yù)熱到60℃，加快麥芽糖溶解的速率，該種方式比將麥芽糖投入到水中再逐步加熱溶解的方法受熱均勻，避免了出現(xiàn)局部溫度過高破壞麥芽糖的情況。麥芽糖、水、甘油的質(zhì)量份數(shù)比為1:10:1，僅僅是本發(fā)明的優(yōu)選方案。將第二混合溶液放入37℃的環(huán)境中，避免補料的加入對發(fā)酵液溫度的影響。本發(fā)明實施例一：(1)種子液的制備生產(chǎn)γ-聚谷氨酸采用的枯草芽孢桿菌。種子培養(yǎng)基組成為：蛋白胨10g/l，酵母膏5g/l，nacl10g/l，ph7.0，其余為蒸餾水或自來水，裝液量50ml/250ml三角瓶，在121℃滅菌30min，冷卻后，取一環(huán)預(yù)先保存于斜面培養(yǎng)基的枯草芽孢桿菌接種于種子培養(yǎng)基中，在37℃、120r/min搖瓶培養(yǎng)24h，即成枯草芽孢桿菌種子液。(2)搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)所述液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基的成分：蛋白胨3g/l，檸檬酸1g/l，葡萄糖6g/l，谷氨酸15g/l，nh4cl7g/l，k2hpo40.5g/l,mgso4·7h2o0.5g/l，fecl3·6h2o0.04g/l，cacl2·2h2o0.15g/l，mnso4·h2o0.104g/l，初始ph值為7.0?？莶菅挎邨U菌種子液按1％～6％接種量接種于液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基，裝液量1l/3l塑料搖瓶，37℃、120r/min搖瓶培養(yǎng)12h，采用頻率為10-20khz且功率為5w/ml的超聲波處理發(fā)酵液3min后，其中，所述超聲波處理的具體步驟為：每超聲30s后，間隔30s再次超聲；將超聲波處理得到的發(fā)酵液低溫保存并加入肽聚糖冷凍膠囊，補料，再繼續(xù)37℃、120r/min搖瓶培養(yǎng)36h后第二次補料，再繼續(xù)37℃、120r/min搖瓶培養(yǎng)60h終止。其中，所述補料為甘油和麥芽糖的混合物，在s2中將發(fā)酵液低溫保存及第二次補料后，添加補料維持發(fā)酵液中碳源濃度為40g/l。(3)γ-聚谷氨酸的提取將發(fā)酵液于3000r/min下離心30min，上清液用1mol/lhcl調(diào)ph到3.0，加入4倍體積的95％乙醇，放于4℃下冰箱內(nèi)過夜。然后于3000r/min下離心30min，用乙醇洗滌沉淀物，收集粘性沉淀物，干燥得γ-聚谷氨酸產(chǎn)品，所得γ-聚谷氨酸的產(chǎn)率為38g/l。本發(fā)明實施例二：(1)種子液的制備，同上。(2)搖瓶培養(yǎng)所述液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基的成分：蛋白胨4g/l，檸檬酸1.5g/l，葡萄糖7g/l，谷氨酸15g/l，nh4cl7g/l，k2hpo40.5g/l，mgso4·7h2o0.5g/l，fecl3·6h2o0.04g/l，cacl2·2h2o0.15g/l，mnso4·h2o0.104g/l，初始ph值為7.0?？莶菅挎邨U菌種子液按1％～6％接種量接種于液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基，裝液量1l/3l塑料搖瓶，37℃、120r/min搖瓶培養(yǎng)14h，采用頻率為10-20khz且功率為5w/ml的超聲波處理發(fā)酵液4min后，其中，所述超聲波處理的具體步驟為：每超聲30s后，間隔30s再次超聲；將超聲波處理得到的發(fā)酵液低溫保存并加入肽聚糖冷凍膠囊，補料，再繼續(xù)37℃、120r/min搖瓶培養(yǎng)38h后第二次補料，再繼續(xù)37℃、120r/min搖瓶培養(yǎng)58h終止。其中，所述補料為甘油和麥芽糖的混合物，在s2中將發(fā)酵液低溫保存及第二次補料后，添加補料維持發(fā)酵液中碳源濃度為50g/l。(3)γ-聚谷氨酸的提取，同上，所得γ-聚谷氨酸的產(chǎn)率為41g/l。本發(fā)明實施例三：(1)種子液的制備，同上。(2)搖瓶培養(yǎng)所述液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基的成分：蛋白胨5g/l，檸檬酸2g/l，葡萄糖8g/l，谷氨酸15g/l，nh4cl7g/l，k2hpo40.5g/l，mgso4·7h2o0.5g/l，fecl3·6h2o0.04g/l，cacl2·2h2o0.15g/l，mnso4·h2o0.104g/l，初始ph值為7.0。枯草芽孢桿菌種子液按1％～6％接種量接種于液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基，裝液量1l/3l塑料搖瓶，37℃、120r/min搖瓶培養(yǎng)16h，采用頻率為10-20khz且功率為5w/ml的超聲波處理發(fā)酵液5min后，其中，所述超聲波處理的具體步驟為：每超聲30s后，間隔30s再次超聲；將超聲波處理得到的發(fā)酵液低溫保存并加入肽聚糖冷凍膠囊，補料，再繼續(xù)37℃、120r/min搖瓶培養(yǎng)40h后第二次補料，再繼續(xù)37℃、120r/min搖瓶培養(yǎng)56h終止。其中，所述補料為甘油和麥芽糖的混合物，在s2中將發(fā)酵液低溫保存及第二次補料后，添加補料維持發(fā)酵液中碳源濃度為60g/l。(3)γ-聚谷氨酸的提取，同上，所得γ-聚谷氨酸的產(chǎn)率為45g/l。對比例：現(xiàn)有γ-聚谷氨酸的發(fā)酵工藝中，γ-聚谷氨酸的平均產(chǎn)率為33g/l。γ-聚谷氨酸的產(chǎn)率(g/l)實施例一38實施例二41實施例三45對比例33由表格可知，本發(fā)明的三個實施例的產(chǎn)率均比對比例高。盡管本發(fā)明的實施方案已公開如上，但其并不僅僅限于說明書和實施方式中所列運用，它完全可以被適用于各種適合本發(fā)明的領(lǐng)域，對于熟悉本領(lǐng)域的人員而言，可容易地實現(xiàn)另外的修改，因此在不背離權(quán)利要求及等同范圍所限定的一般概念下，本發(fā)明并不限于特定的細(xì)節(jié)和這里示出與描述的實施例。當(dāng)前第1頁12