本發(fā)明涉及一種活性多肽在制備離子通道工具試劑中的用途，尤其是用化學(xué)法制備的廣西纓毛蛛毒素提取物-蜘蛛抑鈉肽-i（簡(jiǎn)寫為spnp-i）在制備電壓門控鈉通道工具試劑-nav1.3型鈉通道抑制劑中的用途。

背景技術(shù)：

電壓門控鈉通道廣泛分布于神經(jīng)元、心肌、血管平滑肌、胰腺、骨骼肌等可興奮性組織中，是一種重要的跨膜結(jié)構(gòu)蛋白，其參與調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)的分泌、血管收縮、胰腺分泌和骨骼肌興奮性等多種生理過(guò)程,同時(shí)也是治療藥物作用的重要靶標(biāo)之一。鈉通道在動(dòng)作電位的產(chǎn)生和傳播過(guò)程中的關(guān)鍵性作用，電壓門控鈉通道成為很多動(dòng)植物毒素的作用靶標(biāo)。鈉離子通道的結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系研究已經(jīng)成為國(guó)際上的研究熱點(diǎn)。電壓門控鈉通道很可能成為神經(jīng)性和心血管等疾病的重要治療靶點(diǎn)。自然界的動(dòng)物毒素是一類具有很高實(shí)用價(jià)值和應(yīng)用前景的工具試劑或藥物導(dǎo)向物質(zhì)，不僅是有毒動(dòng)物抵御天敵的有力武器，也是從事神經(jīng)生物學(xué)和生理學(xué)研究、天然創(chuàng)新藥物開(kāi)發(fā)以及蛋白質(zhì)基礎(chǔ)研究的寶貴材料,同時(shí)也是研究離子通道的獨(dú)特“分子探針和解密器”。迄今為止，從多種動(dòng)物（如蝎、蜘蛛、蛇以及海洋動(dòng)物等）的毒液中鑒定到了很多作用于鈉通道的活性成分。它們通過(guò)與鈉通道的不同位置相結(jié)合從而引起通道的動(dòng)力學(xué)特征發(fā)生相應(yīng)的變化，如通道去失活、阻塞通道口、易化激活、失活延緩等。通過(guò)闡述這些特異性調(diào)制劑作用于鈉通道的分子機(jī)制，除了在理論上可深入推測(cè)鈉通道亞型之間的功能活動(dòng)區(qū)別和門控活動(dòng)機(jī)制外，還可以為將它們開(kāi)發(fā)成治療人類相關(guān)疾病的新藥提供充分的理論基礎(chǔ)和廣闊的應(yīng)用前景。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明旨在于提供一種廣西纓毛蛛毒素提取物-蜘蛛抑鈉肽-i在制備電壓門控鈉通道工具試劑-nav1.3型鈉通道抑制劑中的應(yīng)用，所述的廣西纓毛蛛毒素提取物-蜘蛛抑鈉肽-i（簡(jiǎn)寫為spnp-i），其氨基酸序列為：

nh2-alacysglyglnphetrptrplyscysglygluglylysproprocyscysalaasnphealacyslysileglyleutyrleucysiletrpserpro-oh,

其特征在于廣西纓毛蛛毒素提取物-蜘蛛抑鈉肽-i作為單一有效活性組份用于制備nav1.3型鈉通道抑制劑。

所述的一種廣西纓毛蛛毒素提取物-蜘蛛抑鈉肽-i在制備電壓門控鈉通道工具試劑-nav1.3型鈉通道抑制劑中的應(yīng)用，其特征在于，所述的蜘蛛抑鈉肽-i的n端第2位半胱氨酸和第16位半胱氨酸之間，n端第9位半胱氨酸和第21位半胱氨酸之間，n端第15位半胱氨酸和第28位半胱氨酸之間分別形成二硫鍵。

該蜘蛛抑鈉肽-i作為單一有效活性組分用于制備nav1.3型鈉通道抑制劑，以細(xì)胞外給藥的方式制備成nav1.3型鈉通道工具試劑。

蜘蛛抑鈉肽-i在制備nav1.3型鈉通道工具試劑或抑制劑時(shí)，配制細(xì)胞外給藥的劑量為1μmol/l。

蜘蛛抑鈉肽-i對(duì)nav1.3型鈉通道的抑制呈現(xiàn)濃度依賴性和時(shí)間依從性，是一種較好的nav1.3型鈉通道工具試劑。

附圖說(shuō)明

圖1是spnp-i對(duì)nav1.3型鈉通道的影響。

圖2是spnp-i抑制nav1.3型鈉通道的時(shí)間-效應(yīng)關(guān)系曲線。

具體實(shí)施方式

為了更好的理解和更充分公開(kāi)本發(fā)明，下面將通過(guò)細(xì)胞外給藥途徑，采用轉(zhuǎn)染hek293t細(xì)胞模型來(lái)說(shuō)明蜘蛛抑鈉肽-i的nav1.3型鈉通道抑制作用。

1、實(shí)驗(yàn)材料和方法

1.1人胚腎細(xì)胞（hek293t）的培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染

hek293t細(xì)胞適應(yīng)酸性環(huán)境,ph值在6.9～7.1時(shí),可順利貼壁生長(zhǎng),換液時(shí)動(dòng)作要輕。一般用高糖的dmem培養(yǎng)基。

1.1.1細(xì)胞的傳代培養(yǎng)

(1)hek293細(xì)胞傳代時(shí)機(jī)為達(dá)80-90%匯合，待細(xì)胞在60mm培養(yǎng)皿中長(zhǎng)滿后，吸掉培養(yǎng)液。

(2)加適量pbs漂洗兩次，吸掉。

(3)加0.5ml0.25%胰酶，搖勻。37℃培養(yǎng)箱中胰酶處理2-3min。于顯微鏡下觀察細(xì)胞是否全部脫壁。加入適量10%新生牛血清dmem培養(yǎng)液終止胰酶反應(yīng)。

(4)用移液管將細(xì)胞團(tuán)輕輕吸打成單個(gè)細(xì)胞。將細(xì)胞按1∶3平均分入裝有預(yù)熱培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿中，于37℃、5%co2、15%相對(duì)濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.1.2陽(yáng)離子性的脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染方法:

（1）在轉(zhuǎn)染前一天，對(duì)于35mm培養(yǎng)皿，每皿用2ml不含抗生素的培養(yǎng)液培養(yǎng)。

（2）轉(zhuǎn)染的當(dāng)天，細(xì)胞密度最好達(dá)到80-90%，吸掉舊培養(yǎng)液，pbs漂洗一次，換成2ml無(wú)血清opti-mem培養(yǎng)液。

（3）每皿dna用量為4μg，用無(wú)血清無(wú)血清opti-mem培養(yǎng)液分別稀釋到250μl，輕輕混勻,室溫靜置5min。

（4）同時(shí)將10μl脂質(zhì)體加入250μl無(wú)血清opti-mem培養(yǎng)液中，輕輕混勻，室溫靜置5min。

（5）將稀釋的脂質(zhì)體加入等體積dna混勻，室溫靜置20min。

（6）將0.5mldna/脂質(zhì)體復(fù)合物輕輕混勻，滴加入細(xì)胞中，輕輕混勻，常規(guī)條件培養(yǎng)。

（7）讓dna/脂質(zhì)體復(fù)合物與細(xì)胞接觸4-6h后，換成10%新生牛血清dmem培養(yǎng)液培養(yǎng)。24-72h內(nèi)可以進(jìn)行膜片鉗實(shí)驗(yàn)。

1.2膜片鉗電生理活性實(shí)驗(yàn)

膜片鉗實(shí)驗(yàn)均在室溫（25±1℃）進(jìn)行，采用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)。挑選質(zhì)膜光滑可見(jiàn)、胞質(zhì)均勻的有綠色熒光的hek293t細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)細(xì)胞。電流記錄通過(guò)全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)利用epc9放大器(heka公司,german)在電腦上進(jìn)行。計(jì)算機(jī)記錄和分析系統(tǒng)采用pulse+pulsefit8.0軟件。玻璃電極管為硼硅酸鹽玻璃毛細(xì)管（南京泉水教學(xué)實(shí)驗(yàn)器材廠）。玻璃電極兩步拉制而成，經(jīng)拋光儀(narishige,japan)拋光后電極尖端直徑約為3μm，充灌電極液后電極電阻為1-3mω。膜片鉗實(shí)驗(yàn)要在室溫條件下進(jìn)行，整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中溫度的變動(dòng)最多上下不超過(guò)2℃。采用sigmaplot9.0軟件分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

2、實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1spnp-i對(duì)nav1.3型電壓門控鈉通道的影響

運(yùn)用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)，我們進(jìn)一步研究了spnp-i對(duì)瞬時(shí)表達(dá)于hek293t細(xì)胞的鈉通道亞型nav1.3的抑制作用。鈉通道亞型電流以同一種去極化方式誘導(dǎo)：將細(xì)胞膜電位鉗制在-100mv，以20ms的時(shí)程給予一測(cè)試電壓-10mv，每隔5s重復(fù)一次。

如圖1所示，1mmspnp-i對(duì)nav1.3通道的失活有一定的抑制作用，能明顯延緩nav1.3鈉通道的失活，其抑制程度為45%。spnp-i對(duì)nav1.3通道的抑制或延緩失活作用呈現(xiàn)明顯的濃度依從性，spnp-i的半數(shù)有效作用劑量ic50為845nmol/l。spnp-i對(duì)nav1.3鈉通道的失活抑制具有時(shí)間依從性，當(dāng)濃度增加為1μm時(shí)，可在約3min的時(shí)間內(nèi)達(dá)到最大抑制程度（見(jiàn)圖2）。

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