本發(fā)明涉及分子生物技術領域，尤其涉及菊花核因子cmnf-yb8及其在花期調控和幼年葉數(shù)量調控中的應用。

背景技術：

在適當?shù)臅r間開花是植物成功進行有性繁殖的關鍵，并且這是由環(huán)境條件信號和內部信號的復雜相互作用來決定的。被子植物已經發(fā)展了幾種機制來協(xié)調控制成花轉化，包括光周期途徑、春化途徑、赤霉素途徑以及年齡途徑等。這些開花途徑信號最終會聚在一組下游開花整合因子上，包括mads-box基因、floweringlocust(ft)、suppressorofoverexpressionofco1(soc1)、apetala1(ap1)和一個植物特異性轉錄因子，leafy(lfy)。

在這些開花途徑中，年齡途徑提供了一個內源性發(fā)育信號，其防止植株在幼年期開花，并且確保其在沒有外源誘導因子的情況下可以在成年期開花。小rna(mirna)，mir156，以及它的靶基因，squamosapromoterbindingprotein-like(spl)基因，已被確定為年齡途徑的關鍵組分，在植物從幼年向成年階段轉化、促進開花的過程中起作用(wuetal,2006,temporalregulationofshootdevelopmentinarabidopsisthalianabymir156anditstargetspl3.development133:3539-3547)。在擬南芥中，mir156的過表達延長了幼年期的性狀，而mir156水平的降低加速了成年期性狀的表現(xiàn)。mir156的表達水平在幼苗中較高，隨著時間而降低，并且隨著營養(yǎng)生長過程中光合產物的積累而下調。mir156水平的下降導致spl基因表達的增加，這反過來誘導開花途徑整合因子soc1、ap1、ful和lfy在莖尖分生組織中的表達。mir156在開花中的關鍵作用已經被證明在被子植物中是保守的，并且mir156的異源表達改變了許多物種的開花時間，包括水稻(oryzasativa)(xiek等，2006，genomicorganization，differentialexpression，andinteractionofsquamosapromoter-binding-liketranscriptionfactorsandmicrorna156inrice.plantphysiol142:280-293)和玉米(zeamays)(chucketal，2011,overexpressionofthemaizecorngrass1micrornapreventsflowering，improvesdigestibility，andincreasesstarchcontentofswitchgrass.procnatlacadsciusa108:17550-17555)。然而，雖然復雜的年齡途徑調節(jié)系統(tǒng)的一些組件已經被闡明，但是調控mir156水平的上游轉錄調控機制仍然還不清楚。

nf-y蛋白在所有高等真核生物中形成保守的異源三聚體轉錄因子復合物，包括nf-ya，nf-yb和nf-yc亞基(petronik等，2012，thepromiscuouslifeofplantnuclearfactorytranscriptionfactors.plantcell24:4777-4792)。nf-y復合物結合許多基因啟動子中的ccaat基序。在植物中，每個nf-y亞基由8至39個基因編碼，因此可能存在數(shù)千種獨特的異源三聚體nf-y復合物，使其能夠特異性調節(jié)多種轉錄模塊。不過，還不清楚nf-y蛋白在年齡途徑中的作用。

菊花(chrysanthemummorifolium)是典型的短日照(sd)多年生雙子葉植物，其提供了一個有用的模型來研究日照長度在從營養(yǎng)分生組織至花序分生組織身份轉變中的作用。迄今對于菊花開花的研究主要集中在光周期途徑的意義和分子調控上。已經表明，菊花開花所需的營養(yǎng)生長期間的幼年期至成年期的過渡，必須發(fā)生在其對sd期的任何反應發(fā)生之前。然而，并不清楚菊花從幼年期至成年期過渡的機制。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明人通過長期廣泛且深入的研究，發(fā)現(xiàn)菊花核因子cmnf-yb8通過調節(jié)從幼年期到成年期的過渡來調控開花時間，并且是mir156的直接上游調節(jié)因子，從而完成了本發(fā)明。

于是，本發(fā)明在第一方面提供了菊花核因子cmnf-yb8基因，所述基因的開放閱讀框具有如seqidno.1第69至560位所示的核苷酸序列。優(yōu)選的是，所述基因可編碼具有如seqidno.2所示的氨基酸序列的蛋白。更優(yōu)選的是，所述基因具有如seqidno.1所示的核苷酸序列。

本發(fā)明在第二方面提供了一種核因子蛋白，所述蛋白的氨基酸序列如seqidno.2所示，或者相對于seqidno.2所示序列具有80％，優(yōu)選90％，更優(yōu)選95，進一步優(yōu)選99％的同一性并且具有相同生物學功能的蛋白。優(yōu)選的是，所述生物學功能為調控植物花期功能和/或調控植物幼年葉數(shù)量功能。更優(yōu)選的是，所述生物學功能的調控通過年齡開花途徑來實現(xiàn)。

本發(fā)明在第三方面提供了本發(fā)明第一方面所述的基因或本發(fā)明第二方面所述的蛋白在調控植物花期和/或調控植物幼年葉數(shù)量中的應用。

在本發(fā)明中，所述基因或所述蛋白的作用不限于某種植物，可以是短日照植物也可以是長日照植物，只要其能夠在該植物中發(fā)揮調控花期和/或幼年葉數(shù)量調控的作用即可。但是優(yōu)選的是，所述植物為觀賞植物。相對于大田作物和其他經濟作用或者蔬菜等食用的作物，觀賞植物對花期等的調控具有更廣泛和迫切的需求，并且對轉基因技術的應用不受到那么苛刻的限制。在一些更優(yōu)選的實施方式中，所述植物可以為菊科或十字花科。進一步優(yōu)選的是，所述菊科植物為菊花。另外優(yōu)選的是，所述十字花科植物為擬南芥。

在一些優(yōu)選的實施方式中，所述調控通過年齡開花途徑實現(xiàn)，而不是通過其他與花期調控可能相關的機制來實現(xiàn)。而且，本發(fā)明人已經發(fā)現(xiàn)，年齡開花途經調控可以獨立于其他例如赤霉素途徑或者光周期途徑來進行。

在一些實施方式中，所述應用通過如下方式來實現(xiàn)：改變所述基因或所述蛋白在植物中的表達，從而影響mir156(有時也稱為mirna156)在植物中的功能的發(fā)揮，由此實現(xiàn)所述調控。在一些更具體的實施方式中，所述調控可以通過影響mir156在植物中的功能的發(fā)揮，進而影響spl蛋白在植物中的功能發(fā)揮來實現(xiàn)。

改變基因在植物中的表達的方法或技術是已知的，本領域技術人員根據(jù)本申請所公開的內容，完全能夠根據(jù)需要選擇能夠改變已知基因在植物中的表達的。例如，可以通過基因沉默例如各種已知的rna干擾(rnai)技術來阻斷或者降低基因在植物中的表達。促進所述基因或所述蛋白在植物中的表達可以通過已知的各種轉基因技術將所述基因導入到植物中使該基因在植物中過表達來實現(xiàn)。于是，在一些實施方式中，阻斷或者降低所述基因或所述蛋白在植物中的表達通過基因沉默技術來實現(xiàn)，更優(yōu)選通過rnai技術來實現(xiàn)。促進所述基因或所述蛋白在植物中的表達通過轉基因技術導入所述基因并使所述基因或所述蛋白在植物中過表達來實現(xiàn)。

根據(jù)本發(fā)明人的研究結果，cmnf-yb8基因過表達可以使植物的花期提前和/或幼年葉數(shù)量減少；反之，降低或者阻斷所述基因或所述蛋白的表達可以延遲開花和/或增加幼年葉數(shù)量。于是，在一些實施方式中，改變所述基因或所述蛋白在植物中的表達通過如下方式來實現(xiàn)的：降低或阻斷所述基因或所述蛋白在植物中的表達，從而使植物花期提前和/或幼年葉數(shù)量減少；或者通過促進所述基因或所述蛋白在植物中的表達，從而延遲所述植物的開花和/或增加幼年葉的數(shù)量。

在適宜的時間開花是被子植物成功進行有性繁殖的關鍵。年齡，作為影響成花時間的內源性發(fā)育信號，當沒有足夠的生物量時會阻止植物早熟開花，并確保開花獨立于外界條件。然而，年齡調控開花的分子機制在基本上還是未知的。本研究發(fā)現(xiàn)，短日照植物菊花(chrysanthemummorifolium)中沉默核因子cmnf-yb8的表達，導致了在長日和短日條件下轉基因植物從幼年向成年的轉化提前和開花提早，幼年葉減少。在cmnf-yb8-rnai植株中，squamosapromoterbinding-like(spl)家族成員spl3、spl5和spl9的表達上調，而小rna，cmo-mir156的表達下調。染色質免疫沉淀技術和酵母單雜交分析表明cmnf-yb8與菊花中的cmo-mir156基因的啟動子結合。通過瞬時的microrna表達系統(tǒng)，在cmnf-yb8-rnai植株中過表達cmo-mir156，恢復了由cmnf-yb8沉默引起的早期開花表型和幼年葉減少表型。這些結論證明在年齡開花途徑中，cmnf-yb8通過直接調控cmo-mir156的表達來影響開花時間。因此，本發(fā)明人通過研究發(fā)現(xiàn)了cmnf-yb8的新的作用和作用機制，從而提供了一種通過改變cmnf-yb8在植物中的表達來便捷有效地調控植物的花期和幼年葉數(shù)量的措施。

附圖說明

圖1.cmnf-yb8(un69086)推定的氨基酸序列與來自其他植物物種的nf-yb8蛋白序列的比較。(a)cmnf-yb8保守結構域與來自其他植物物種的nf-yb蛋白的序列比對。二級結構、α-螺旋(實心藍色矩形)和鏈環(huán)(黑線)在比對上方表示。dna結合和亞基相互作用結構域在比對下方用彩色條表示。(b)cmnf-yb8和13個擬南芥nf-yb蛋白的系統(tǒng)進化分析。引導值表示每個分支的分散，標度指示分支長度。

圖2.菊花cmnf-yb8的轉錄本豐度。(a)在不同器官中cmnf-yb8的轉錄本豐度。植株移植5天后在長日照條件下培養(yǎng)，在頂芽(ab)、葉(l)、莖(st)和根(r)器官中分析。(b)不同年齡菊花頂芽和葉片中cmnf-yb8的轉錄本豐度。植株在長日照條件下生長。在移植5天后，每隔10天取樣。(c)在不同日照條件(包括ld和sd)下、在低溫(4℃)條件下或在用赤霉酸(ga4/7)處理后的菊花中cmnf-yb8的轉錄本豐度。每種處理30天后取葉片進行分析。用ubiquitin作為內參。進行三次獨立實驗。duncan’s多重范圍檢驗(p<0.05)檢驗顯著性差異。

圖3.cmnf-yb8-rnai菊花植株的幼年營養(yǎng)階段。(a)通過qrt-pcr測定野生型(wt)和cmnf-yb8-rnai植物中cmnf-yb8的轉錄本豐度。rnai-4、-13和-20對應于3個獨立的cmnf-yb8-rnai株系。(b)七葉大小的wt和cmnf-yb8-rnai菊花的葉片形態(tài)。幼葉被定義為很小的葉片，沒有或有最小的邊緣鋸齒。(c)在wt和cmnf-yb8-rnai菊花植株的前五片葉中幼葉的百分比。進行三次獨立實驗，誤差條表示標準偏差。星號表示根據(jù)student’st-test(**p<0.01)的顯著性差異。

圖4.長日照(ld)和短日照(sd)條件下cmnf-yb8-rnai菊花的開花時間。(a,c)記錄在ld(a)和sd(c)條件下生長的野生型(wt)和rnai植物的開花表型，并在不同時間點(移植后天數(shù))拍照。(b,d)ld(b)和sd(d)條件下生長的wt和rnai植株中的花芽出現(xiàn)時間。進行三次獨立實驗。星號表示student’st-test(**p<0.01)驗證的顯著性差異。

圖5.cmspl基因和cmo-mir156在cmnf-yb8-rnai菊花植株中的表達。通過qrt-pcr檢測每個基因的表達量。ubiquitin用作cmspl3、cmspl5、cmspl9和pri-cmo-mir156表達的內參基因。u6用作cmo-mir156的內參基因。進行三次獨立實驗。星號表示student’st-test(*p<0.05，**p<0.01)驗證的顯著性差異。

圖6.cmnf-yb8與cmo-mirna156的啟動子結合。(a)cmo-mir156前體-1和-2(分別為pre-mir156-1和pre-mir156-2；綠色框)的折疊結構的上游區(qū)域的示意圖。tss表示主要轉錄起始位點。藍色框表示cmo-mir156基因的啟動子。星號對應于推定的ccaat框，藍框上方的線表示在chip-pcr分析中擴增的片段。p0:+175～+321、p1:-266～-498、p2:-473～-720、p3:-701～-914、p4:-893～-1086、p5:-1121～-1318、p6:-1289～-1621、p7:-1599～-1754和cmo-mir156的主要tss相關。藍色框下面的線表示在小圖中顯示的酵母單雜交分析中使用的片段。p8:-1421～-1754、p9:-1083～-1436、p10:-610～-1082和p11:-263～-501與cmo-mir156主要的tss相關。(b)cmo-mir156啟動子中指定片段(p0至p7)的chip富集。來自35s：cmnf-yb8-gfp菊花植物的染色質用抗gfp抗體免疫沉淀，通過qpcr測定免疫復合物中指定的dna的量。擴增pre-cmo-mir156-1片段(p0)作為陰性對照。(c)下劃線表示p9野生型順式元件(caat框)及其在突變型(p9m)中的核苷酸代替。(d)cmnf-yb8與酵母單雜交系統(tǒng)中cmo-mir156啟動子結合的分析。用融合好的誘餌載體(p8至p11和p9m)和捕獲載體(ad-cmnf-yb8)共轉化酵母y187菌株。捕獲載體(ad)用作陰性對照。細胞生長在缺乏trp、leu和his，并含有3mm3-氨基-1,2,4-三唑(3-at)的合成營養(yǎng)缺陷培養(yǎng)基上，來測定誘餌蛋白和捕獲蛋白之間的相互作用。進行三次獨立實驗。

圖7.cmo-mir156在cmnf-yb8-rnai菊花株系中的異源表達導致開花時間恢復。(a)在用calcuv或calcuv-pre-cmo-mir156-1(calcuv+mir156)侵染的野生型(wt)和cmnf-yb8-rnai植株中的cmo-mir156的轉錄本豐度。(b)在短日照(sd)條件下生長50天后的花序掃描電鏡照片。(c)在sd條件下65天后記錄的野生型(wt)和rnai植株的表型。(d)在sd條件下，用calcuv或calcuv+mir156侵染的wt和cmnf-yb8-rnai植物中花芽出現(xiàn)的時間。進行三次獨立實驗。星號表示student’st-test(**p<0.01)檢驗的顯著性差異。

圖8.cmnf-yb8參與菊花年齡途徑的模式圖。

圖9.cmnf-yb8過表達擬南芥株系的幼年營養(yǎng)期和花期。(a)cmnf-yb8過表達擬南芥株系中cmnf-yb8的轉錄本豐度。(b)在長日照(ld)條件下生長28天后記錄的野生型(wt)和cmnf-yb8-過表達植株的表型。(c)在ld條件下，開花時wt和cmnf-yb8過表達株系的蓮座葉葉片數(shù)。(d)葉背表皮毛在wt和cmnf-yb8過表株系葉片上的分布。蓮座葉用苯胺藍染色，并用紫外光激發(fā)顯現(xiàn)葉背表皮毛的自發(fā)熒光。ox7、ox8和ox11對應于3個獨立的cmnf-yb8過表達株系。進行三次獨立試驗。星號表示student'st-test(*p<0.05，**p<0.01)驗證的顯著性差異。

圖10.qrt-pcr分析spl基因和mir156在cmnf-yb8過表達擬南芥株系中的轉錄本豐度。ox7、ox8和ox11對應于3個獨立的super:cmnf-yb8株系。進行三次獨立實驗。星號表示student'st-test(*p<0.05，**p<0.01)驗證的顯著性差異。

圖11.cmnf-yb8與mirna156a和mirna156c的啟動子結合的chip-qpcr試驗。(a)mir156a和mir156c前體的折疊結構上游區(qū)域的示意圖。藍色框表示在chip-pcr分析中擴增的片段。主要轉錄起始位點(tss)用彎曲箭頭表示。mir156a主要tss與a1：-824～-351、a2：-1034～-861、a3：-1353～-1173、a4相關；mir156c主要tss與c1：-298～-183、c2：-759～-446、c3：-1124～-724相關。(b和c)mir156a(b)和mir156c(c)啟動子中指定片段的chip互作峰值。來自super:cmnf-yb8-gfp擬南芥植株的染色質用抗gfp抗體免疫沉淀，并且通過定量pcr測定免疫復合物中指定的dna的量。擴增actin2片段作為對照。進行三次具有相似結果的獨立實驗。

具體實施方式

為使本發(fā)明實施例的目的、技術方案和優(yōu)點更加清楚，下面將結合實施例對本發(fā)明的技術方案進行更加清楚、完整地描述。不過，應當理解的是，所描述的實施例是本發(fā)明的一部分實施例，而不是全部的實施例?；诒景l(fā)明中的實施例，本領域普通技術人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動的前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發(fā)明保護的范圍。

實施例

材料與方法

植物材料和處理

本研究實驗材料為綠化小菊品種‘秋艷’(chrysanthemummorifoliumcv.fallcolor)。菊花植株通過組織培養(yǎng)方式進行擴繁。然后移植到含有1:1(v/v)泥炭和蛭石混合物的9cm直徑的盆中，在長日照(16小時光照/8小時黑暗)培養(yǎng)室，在23±1℃、40％相對濕度和100μmolm^-2s^-1光照強度下進行培養(yǎng)。

對于短日照處理，將移植后生長5天的植株轉移到培養(yǎng)室中并保持在短日照(8小時光照/16小時黑暗)條件。低溫處理，將植株轉移至4℃的培養(yǎng)室中，并在長日照(16小時光照/8小時黑暗)下培養(yǎng)30天。ga處理，將移植5天后的植株用100μmga4/7(sigma)處理并維持在長日照(16小時光照/8小時黑暗)下。ga4/7處理每周進行兩次，共處理30天(yang等，2014)。

cmnf-yb8基因克隆

從菊花rna-seq數(shù)據(jù)集中獲得cmnf-yb8基因序列片段，使用smart^tmracecdna擴增試劑盒(clontech)獲得基因全長序列。cmnf-yb8全長氨基酸序列與擬南芥中的nf-yb的比對使用bioedit(http://www.mbio.ncsu.edu/bioedit/bioedit.html)和clustalw(http：///www.ch.embnet.org/software/clustalw.html)程序。用mega5和具有1,000個自舉重復的鄰接法進行系統(tǒng)發(fā)育分析。

定量rt-pcr分析

使用trizol試劑(invitrogen)從菊花頂芽、葉、莖和根中提取總rna樣品，并用無rna酶的dnasei(promega)處理。使用oligod(t)引物和superscriptiiirt-pcr系統(tǒng)，以1μg總rna為模板合成第一鏈cdna。使用steponereal-timepcrsystem(appliedbiosystems)，用kapasybrfastuniversalqrt-pcr試劑盒(kapabiosystems)進行qrt-pcr反應(含有1μlcdna模板的20μl體積)。用菊花ubiquitin基因(genbank登錄號nm_112764)作內參基因。

通過莖環(huán)反轉錄pcr驗證cmo-mir156的表達(varkonyi-gasic等，2007)。使用mir156莖環(huán)引物(表2)和superscriptiiirt-pcr系統(tǒng)合成cdna。利用steponereal-timepcrsystem(appliedbiosystems)進行qrt-pcr反應(20μl體積，含有1μlcdna和cmo-mir156f/stemloopuniversal-r引物組；表2)。u6基因用作stem-loopqrt-pcr的內參基因(zhan等，2012)。

每個反應進行三次生物學重復，并通過熔解曲線分析驗證。所有反應用至少進行三次生物學重復。pcr引物列于表2中。

菊花轉化

為了構建rnai載體，通過兩對含有xhoi/kpni和xbai/bamhi位點的引物(表2)分別擴增cm-nf-yb8的361bp正義和反義片段。pcr產物用相應的限制酶消化，并定向插入在phannibal載體中的pdkintron的兩側，以形成含有'發(fā)卡'rna(ihprna)構建體。然后將含有35s啟動子和nos終止子的ihprna構建體亞克隆到part27雙元載體中用于轉化(wesley等，2001)。pcr引物列于表2中。

為了構建35s：cmnf-yb8-gfp過表達載體，將來自super：cmnf-yb8-gfp載體的gfp與cmnf-yb8orf經xbai和smai消化后融合，然后克隆到pbi121載體中。

將所得質粒轉入根癌土壤桿菌eha105菌株中，通過農桿菌介導的轉化轉入到菊花中(hong等，2006)。

rna-seq分析

使用rneasyplantminikit(qiagen)，在移植15天后，從cmnf-yb8-rnai株系4和wt植物(每種基因型3個獨立植株)中提取總rna樣品。制備6個rna測序文庫(zhong等，2011)，并使用hiseq2000(illumina)在ribobiotechnologyco.ltd(www.ribobio.com)測序。rna-seq數(shù)據(jù)如先前所述(yang等，2014)進行處理、組裝和注釋，將其存儲在國家生物技術信息中心sra數(shù)據(jù)庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/βterm＝)，基因號為srp038981-sra091277。

5'rlm-race

利用m-race試劑盒(ambion)，檢測cmspl轉錄本上cmo-mirna切割位點(pei等，2013)。使用連接酶將1μg總rna直接連接到5'銜接子(不用小牛腸堿性磷酸酶和煙酸酸性焦磷酸酶處理)。通過m-mlv逆轉錄酶，使用連接rna合成cdna。將pcr產物凝膠純化并克隆到pgemt-easy載體(promega)中，隨機選擇10個克隆并測序。該試驗使用的引物列于表2中。

染色質共沉淀chip分析

使用35s：cmnf-yb8-gfp菊花植株進行chip測定。在移植7天后從展開葉中分離染色質復合物，并用超聲波儀(bransons-250d)通過超聲處理使其碎裂。將溶解的染色質與anti-gfpantibody-proteinabeads孵育過夜。經洗滌后，在65℃下孵育6小時以逆轉交聯(lián)。純化共沉淀的dna，并使用qrt-pcr分析。用于chip-qpcr的引物列于表2中。

酵母單雜交試驗

對于誘餌載體構建，從菊花基因組dna擴增cmo-mir156的啟動子片段。通過不對稱重疊延伸pcr方法將突變引入一個cmo-mir156啟動子片段(p9)的ccaat盒中(xiao和pei，2011)。然后將pcr產物克隆到phis2.1載體的ecori/spei位點。對于捕獲載體構建，從菊花頂芽cdna中擴增cmnf-yb8的編碼區(qū)，克隆到pgadt7載體的ndei/xhoi位點。使用matchmaker^tmgoldyeastone-hybridlibraryscreeningsystem(clontech)方法進行酵母單雜交試驗。簡言之，將轉化體在sd/-trp-leu培養(yǎng)基上生長以進行點試驗。然后將轉化體點樣到sd/-trp-leu-his和sd/-trp-leu-his+3-氨基-1,2,4-三唑(3-at)培養(yǎng)基上。

基于病毒誘導的mirna過表達體系

使用基于病毒誘導的microrna過表達系統(tǒng)在菊花中異源表達com-mir156(tang等，2010)。構建包含pre-cmo-mir156-1(calcu+mir156)的修飾的卷心菜葉卷曲雙生病毒載體(calculus)，并轉化到根癌土壤桿菌gv3101菌株中。將轉化的根癌土壤桿菌接種在含有30mgl^-1利福平、50μgml^-1卡那霉素和50μgml^-1硫酸慶大霉素的luria-bertani培養(yǎng)基中。通過在4,000rpm離心10分鐘獲得培養(yǎng)物，再懸浮于滲透緩沖液(10mmmgcl2，200mm乙酰丁香酮，10mmmes，ph5.6)中至最終od600為1.5。將含有pcvb和calcuv(對照)或pcvb和calcuv+mir156的培養(yǎng)物以1:1的比例混合，并在黑暗中室溫放置3-4小時，然后真空滲入到菊花植株。對照樣品僅用于滲透緩沖液處理。將菊花rnai和wt植株浸入滲透緩沖液中并在0.7mpa的真空下浸潤3分鐘，然后用去離子水沖洗。浸潤后，將植物移植到含有1:1(v/v)泥炭和蛭石的混合物的盆中，并在23±1℃、相對濕度40％、光照強度100μmolm^-2s^-1，8h光照/16h黑暗下進行培養(yǎng)。在每個實驗中用40個植株進行三個獨立實驗。在測定開花時間之前，通過pcr篩選植株以確定cmo-mir156的表達。成功過表達的cmo-mir156的植株用于開花時間測定。

結果與分析

cmnf-yb8表達與菊花的年齡相關

為了探討nf-yb家族基因在菊花年齡途徑中的功能，在菊花轉錄組數(shù)據(jù)庫中鑒定到8個編碼推定的nf-yb家族蛋白的基因，其中，cmnf-yb8在菊花頂芽中的表達隨年齡的增加呈現(xiàn)降低表達的趨勢，它被預測編碼具有保守的nf-yb結構域的蛋白質，這個結構域包括dna結合結構域、nf-ya和nf-yc亞基相互作用結構域(圖1a)。cmnf-yb8和13個擬南芥nf-yb蛋白的系統(tǒng)發(fā)育樹分析顯示，其與atnf-yb8和atnf-yb10(圖1b)最接近(圖1b)，其中與atnf-yb8最相似。

對移植5天后菊花幼苗不同器官中cmnf-yb8的時空表達模式進行分析。研究發(fā)現(xiàn)cmnf-yb8在頂芽和葉片中的轉錄豐度相對較高(圖2a)。在這兩個組織中，轉錄本水平在幼年植株中最高，并隨著植株發(fā)育逐漸下降(圖2b)。本發(fā)明人還評估了在低溫條件下、在赤霉酸(ga)處理后，以及在不同日照長度下植物中cmnf-yb8的表達。在長日(ld)和短日(sd)條件之間，在室溫和低溫條件下，或ga處理和未處理的植物之間，都沒有觀察到cmnf-yb8表達上的差異(圖2c)。這些結果表明cmnf-yb8的表達受年齡調控，但不受其他已知的開花信號(如光周期，春化或ga)調控。

cmnf-yb8沉默促進了幼年期至成年期的轉變和開花時間

為了研究cmnf-yb8是否影響菊花的生長和開花時間，使用cmnf-yb8基因的3'非翻譯區(qū)在菊花中特異性沉默cmnf-yb8，獲得了23個cmnf-yb8-rnai株系。通過qrt-pcr分析證實轉基因株系與野生型(wt)植物相比較cmnf-yb8表達降低了(圖3a)。選擇3個代表性的cmnf-yb8-rnai株系(4,13和22)進行了以下的功能分析(圖3a)。

本發(fā)明人比較了wt和cmnf-yb8-rnai株系的葉的形態(tài)：幼年葉的數(shù)量可以用作幼年期至成年期過渡的指標。wt植株兩片最早出現(xiàn)的葉和89％的第三片葉通常都是幼年葉，因為它們很小，沒有邊緣鋸齒或有最小的邊緣鋸齒(圖3b)。相反的是，cmnf-yb8-rnai株系的第一、第二和第三片出現(xiàn)的葉，分別有20％，65％和93％具有成體形態(tài)，因為它們葉片更大并且具有邊緣鋸齒(圖3c)。

本發(fā)明人還觀察到cmnf-yb8-rnai植株和wt植株之間在開花時間上有顯著差異(圖4)，但花直徑和花數(shù)量并沒有差異。在長日照條件下培養(yǎng)62天時，在cmnf-yb8-rnai株系4中觀察到花芽出現(xiàn)，株系13和22中分別在66天和68天時出現(xiàn)花芽(圖4a和4b)，然而在wt植株中花芽僅在第89天出現(xiàn)(圖4a和4b)。cmnf-yb8-rnai植株的花期較wt植株提前20天(圖4b)。在短日照條件下，wt植株的花芽在第67天時出現(xiàn)，但是cmnf-yb8-rnai植株的花芽僅在第42天時就出現(xiàn)(圖4c和4d)較wt植株出現(xiàn)花芽提前約25天(圖4d)。

為了進一步探討在擬南芥中cmnf-yb8是否具有調控幼年葉至成年葉轉變和開花時間的能力，本發(fā)明人在擬南芥中異源過表達了cmnf-yb8(cmnf-yb8-ox)(圖9a)。在擬南芥中，幼年葉片上沒有表皮毛標記，或者在葉片背面上有少量表皮毛標記。與wt植株相比，cmnf-yb8-ox植株的遠軸毛狀體的出現(xiàn)延遲了超過1.3個葉原基形成間隔期，表明cmnf-yb8-ox植株的幼年期被延長了(圖9c和9d)。此外，在抽苔階段，擬南芥轉基因植株具有比wt植株更多的蓮座葉，此現(xiàn)象證明了在擬南芥中cmnf-yb8-ox植株比wt植株更晚開花(圖9b和9c)。

綜上所述，這些結果表明cmnf-yb8在植物幼年期到成年期的轉化和開花時間上具有調控作用，且這種作用可能是通過年齡途徑來進行的。

cmnf-yb8調節(jié)了年齡途徑相關的基因的表達

通過rna-seq方法，在cmnf-yb8-rnai和wt菊花植株之間進行了差異表達基因的高通量篩選。本發(fā)明人在cmnf-yb8-rnai的株系4中鑒定了683個上調的和74個下調的差異轉錄基因(dtg)(表2)。在cmnf-yb8調控開花時間的背景下，本發(fā)明人專注于作為開花途徑組分的dtgs。這些基因包括3個推定的年齡途徑基因，編碼spl蛋白，其在cmnf-yb8-rnai株系中比在wt植株中有更高的表達水平(表1)。

由于mir156是年齡途徑的關鍵組分，本發(fā)明人首先從菊花頂芽rna-seq數(shù)據(jù)庫中鑒定了一個mir156，命名為cmo-mir156。然后，本發(fā)明人確定了菊花基因組中cmo-mir156基因的序列。qrt-pcr分析表明，沉默cmnf-yb8后，cmo-mir156的表達量和cmo-mir156的初級轉錄本(pri-cmo-mir156)的表達量均被下調(圖5d和5e)。

cmnf-yb8是cmo-mir156的上游調節(jié)子

為了確定cmnf-yb8是否與cmo-mir156啟動子的特異性調節(jié)區(qū)域結合，本發(fā)明人使用過表達cmnf-yb8-gfp的菊花進行染色質免疫共沉淀(chip)試驗。本發(fā)明人觀察到cmnf-yb8與cmo-mir156啟動子在p5片段有互作峰值，p5處在距離起始位點(tss)的區(qū)域(圖6a和6b)。

通過酵母單雜交分析，本發(fā)明人觀察到cmnf-yb8結合到cmo-mir156啟動子的p9片段(tss與相關)(圖6d)。一個推定的ccaat順式元件是已知的nf-y蛋白結合位點(laloumt等，2013，ccaat-boxbindingtranscriptionfactorsinplants:ysomany？trendsplantsci18:157-166)，定位在p5和p9的重疊區(qū)域(圖6a)。當該ccaat順式元件突變后，nf-y蛋白便不能與其結合(圖6c和6d)。

本發(fā)明人進一步探討了cmnf-yb是否可以與擬南芥中的mir156啟動子結合。在cmnf-yb8-ox擬南芥株系中觀察到spl3、5、9的表達量減少，同時mir156的表達量增加(圖10)通過染色質免疫共沉淀技術，證明了cmnf-yb8與擬南芥中的mir156a、mir156c的啟動子結合(圖11)。

cmnf-yb8沉默引起的早期開花表型可通過cmo-mirna156的異源表達恢復

為了證實cmnf-yb8是否通過cmo-mir156-spl模塊影響開花時間，本發(fā)明人通過包含pre-cmo-mir156-1的卷心菜葉卷曲雙生病毒載體(calcuv)(calcuv+mir156)，在wt和cmnf-yb8rnai菊花中過表達cmo-mir156。結果表明在wt和rnai植株中，與對照和僅calcuv侵染的植物(對照植株)相比，在calcuv+mir156侵染的植株中cmo-mir156的表達量增加(圖7a)。在短日照條件下培養(yǎng)50天時，掃描電鏡觀察表明在wt和rnai植物中，calcuv+mir156侵染植株的花序發(fā)育比對照植物緩慢(圖7b)。在rnai植株中，calcul+mir156侵染使花序發(fā)育恢復到與wt對照植株相同的總苞形成階段(圖7b)。隨后，在calcuv+mir156侵染后，wt和rnai植株分別在第98天和第77天時出現(xiàn)花芽，其與對照植株相比顯著延遲(圖7c和7d)。

討論

cmnf-yb8參與幼年至成年的轉換

植物在萌發(fā)后經歷了從營養(yǎng)生長階段到生殖生長階段的轉換，其中前者可以進一步分為幼年階段和成年階段。這兩個階段可以通過葉形狀、大小和表皮分化的模式在形態(tài)學上進行區(qū)分。比如，擬南芥的幼年葉比成熟葉更小和更圓，并且它們沒有遠軸毛狀體。在本研究中，本發(fā)明人注意到菊花的幼葉具有與擬南芥類似的形態(tài)特征(圖3b)。

植物在從幼年到成年的轉換期間獲得了開花能力。mirna156及其靶標spl基因是年齡途徑的重要組分，在幼年至成年的轉換過程中起關鍵作用。在本研究中，在菊花中沉默了nf-yb亞基成員，cmnf-yb8，導致幼年葉數(shù)量的顯著減少，表明了植株提前從幼年到成年的轉換并伴隨著向開花轉變的加速(圖3b和3c)。這些結果與cmnf-yb8通過年齡途徑影響開花時間相一致。

原則上，年齡相關途徑中的基因表達受年齡影響，而不是其他開花信號。事實上，在幾種植物中，mirna156和spl基因表現(xiàn)出典型的時間調節(jié)表達模式，而不受其他開花信號影響。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)cmnf-yb8的表達受年齡調控，但不是受日照長度、低溫或ga調控(圖2)。此外，通過沉默cmnf-yb8來調節(jié)開花時間也不受其他開花信號的影響，比如日照長度(圖4)。這些觀察表明，cmnf-yb8是通過年齡途徑調節(jié)開花時間。

cmnf-yb8直接作用于cmo-mir156上游

mir156通過在轉錄后水平直接調節(jié)spl轉錄因子而在年齡途徑中起關鍵作用。本發(fā)明人通過chip試驗和酵母單雜交發(fā)現(xiàn)，cmnf-yb8通過與其啟動子結合來調節(jié)cmo-mir156基因的轉錄。本發(fā)明人經過深入研究，發(fā)現(xiàn)cmnf-yb8是協(xié)調年齡信號感知的調節(jié)劑，并直接觸發(fā)mir156spl調控分子過程，從而調節(jié)菊花開花時間(圖8)。

表1.在cmnf-yb8-rnai植株中開花相關差異表達基因。

注：cnc表示無法運算。*表示該基因已被報道為菊花開花整合子基因。wt表示野生型。

表2.引物列表

最后應說明的是：以上實施例僅用以說明本發(fā)明的技術方案，而非對其限制；盡管參照前述實施例對本發(fā)明進行了詳細的說明，本領域的普通技術人員應當理解：其依然可以對前述各實施例所記載的技術方案進行修改，或者對其中部分技術特征進行等同替換；而這些修改或者替換，并不使相應技術方案的本質脫離本發(fā)明各實施例技術方案的精神和范圍。

sequencelisting

<110>中國農業(yè)大學

<120>菊花核因子cmnf-yb8及其在花期調控和幼年葉數(shù)量調控中的應用

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