本發(fā)明屬于植物基因工程技術領域，涉及一種中山杉品種406（taxodiumhybrids‘zhongshansha406’）葉肉原生質體分離、純化及高效轉化的方法。

背景技術：

植物原生質體即指“通過質壁分離，能夠和細胞壁分開的那部分細胞物質”，換言之原生質體就是除去全部細胞壁的“細胞”，仍具有細胞全能性。近年來，隨著基因組學和蛋白質組學的發(fā)展，植物原生質體的瞬時表達已被科學家們廣泛利用進行基因功能高通量分析，由于原生質體的代謝過程、對植物激素的應答、以及對環(huán)境因素的反應都與完整的植物細胞或組織細胞完全相同，因此原生質體為我們提供了一個分析植物信號轉導途徑的方便而有力的工具。這項技術己經被廣泛的應用于啟動子活性分析，基因亞細胞定位以及蛋白質間的相互作用等。而目前植物原生質體的研究主要集中于草本模式植物擬南芥、煙草，木本模式植物楊樹等一些雙子葉植物中。

中山杉是江蘇省中國科學院植物研究所從落羽杉×墨杉雜交組合中選育出來的優(yōu)良無性系，具有速生，耐水淹，耐鹽堿，抗病蟲害，干形優(yōu)美等特點。目前中山杉的生理學，形態(tài)學研究已經獲得一定成果，但是同大多數針葉樹種一樣，由于其遺傳轉化體系尚不成熟，造成中山杉分子生物學相關功能研究受到限制。

技術實現要素：

發(fā)明目的：針對現在技術中存在的不足，本發(fā)明的目的是提供一種中山杉品種406葉肉原生質體分離、純化方法。本發(fā)明的另一目的是提供一種中山杉品種406葉肉原生質體質粒高效轉化的方法。

技術方案：為了實現上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術方案為：

一種中山杉品種406葉肉原生質體分離、純化及高效轉化的方法，包括以下步驟：

1）以中山杉生長30天長勢良好的組培苗幼嫩葉片為材料，對材料進行30h的黑暗預處理；

2）對葉肉原生質體進行分離和純化；

3）從15~20ml過夜培養(yǎng)菌液抽提50~80μg質粒，質粒為載體p2fgw7.0；

4）peg介導進行原生質體轉化。

步驟2）中，具體操作：

1）用刀片將中山杉片從葉柄上迅速分離下來，輕輕將葉片切成0.5-1mm寬的葉條；

2）配制酶液：500μl200mmmes溶液，3.75ml0.8m甘露醇，500μl0.2mkcl，25μlddh2o混合后，70℃水浴10min后，立即加入150μl纖維素酶cellulase，75μl果膠酶pectinase，55℃水浴15min，0.20mm的膜過濾滅菌，酶液應新鮮制備，且呈淺棕色；

3）將葉片切好后舒展地放入酶液中，25℃恒溫培養(yǎng)箱中暗陪5小時酶解，當酶解液體變綠時，輕輕搖晃培養(yǎng)容器促使原生質體釋放出來；

4）沿培養(yǎng)容器邊沿輕輕加入預冷的10mlw5溶液，稀釋含有原生質體的酶液；

5）輕輕混勻后，使用200目的篩子過濾除去未酶解的葉子以及雜質；

6）將濾液加入50ml的圓底離心管，4℃，900rpm離心5min，沉淀原生質體；

7）小心除去上清后，用5mlw5溶液重懸沉淀在圓底管底部的原生質體；

8）普通光學顯微鏡下使用血球計數器觀察計數；

9）冰上靜止30min，再次去除上清，然后用適量的mmg溶液重懸原生質體，使其終濃度達到6×10⁵/ml，用于后期的質粒轉化。

步驟3）中，具體操作：

1）向吸附柱cp4中加入500μl的平衡液bl，12000rpm離心1min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中；

2）取5~15ml過夜培養(yǎng)的菌液加入離心管中，12000rpm離心1min，盡量吸除上清；

3）向留有菌體沉淀的離心管中加入500μl溶液p1，使用移液器或渦旋振蕩器徹底懸浮細菌細胞沉淀；

4）向離心管中加入500μl溶液p2，溫和地上下翻轉6~8次使菌體充分裂解；

5）向離心管中加入700μl溶液p3，立即溫和地上下翻轉6~8離心管底部形成沉淀；

6）將上一步收集的上清液分次加入過濾柱cs，12000rpm離心2min，小心地將離心后收集管中得到的溶液分次加入吸附柱cp4中；

7）12000rpm離心lmin，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱cp4放入收集管中；

8）向吸附柱cp4中加入500μl去蛋白液pd，12000rpm離心lmin，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱cp4放入收集管中；

9）向吸附柱cp4中加入600μl漂洗液pw，12000rpm離心1min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱cp4放入收集管中；

10）向吸附柱cp4中加入600μl漂洗液pw，12000rpm離心lmin，倒掉收集管中的廢液；

11）將吸附柱cp4重新放回收集管中置于12000rpm離心2min，目的是將吸附柱中殘余的漂洗液去除；

12）將吸附柱置于一個干凈的離心管中，向吸附膜的中間部位懸空滴加100~300μlddh2o洗脫，室溫放置2min，12000rpm離心lmin將質粒溶液收集到離心管中。

步驟4）中，具體操作：

1）加入20μl的已提純的質粒（10-20ug）至2ml離心管中；

2）加入200μl的已經分離純化的中山杉葉肉原生質體，輕柔混合；

3）加入220μl的peg溶液，0.2mmannitol，100mmcacl2），輕柔拍打離心管完全混合；

4）黑暗環(huán)境中，冰浴誘導轉化混合物5-15分鐘；

5）室溫下用800μl的w5溶液稀釋轉化混合液，然后輕柔顛倒搖動離心管使之混合完好以終止轉化反應；

6）室溫下用臺式離心機1000rpm，離心6min，然后利用移液槍輕輕去除上清；

7）用200μl的wi溶液（4mmmes，0.5mmannitol，20mmkcl（ph5.7））輕柔重懸原生質體于多2ml的離心管中；

8）室溫下黑暗培養(yǎng)，誘導原生質體表達轉化的載體18小時以上；

9）熒光顯微鏡下觀察gfp標簽的表達。

有益效果：與現有技術相比，本發(fā)明的中山杉品種406葉肉原生質體分離、純化及高效轉化的方法，其操作簡單易行，除可以獲得大量、完整、純凈的中山杉葉肉原生質體外，還可以達到高達80%的質粒轉化率。從而解決了無法深入研究中山杉基因功能的難題，也為其他針葉樹種原生質體瞬時表達體系建立提供一定的參考及借鑒，將在林木基因工程領域有重要的應用價值。

附圖說明

圖1是組培苗幼嫩葉片材料圖；

圖2是含有的植物瞬時表達載體的元件圖；

圖3是酶解時間對中山杉葉肉原生質體分離的影響圖；

圖4是中山杉原生質體酶解體系優(yōu)化前后的對比圖；

圖5是中山杉葉肉原生質體轉化情況（gfp）圖。

具體實施方式

下面結合具體實施例對本發(fā)明做進一步的說明。

以下實施例中的測定方法如下：

原生質體產量測定：原生質體產量，即每克鮮重材料所制備的原生質體的量，采用血球計數板進行計數。吸取少量原生質體懸浮液（20μl）滴加在血球計數板上，當原生質體充滿計數室后，在顯微鏡下觀察計數。依次逐個計數中央大方格內25個中方格內的原生質體數，重復3次，然后按照下式計算出每毫升中原生質體數量。

原生質體密度（個/ml）=大方格內（0.lmm³，即0.1μl）的原生質體數×10⁴

原生質體產量（個/g）=[原生質體密度（個/ml）×原生質體懸浮液總體積（ml）]/制備原生質體所用材料鮮重（gfw）

實施例1原生質體分離與純化

1、材料的選擇與預處理

一般而言，要想獲得產量高、活性強、完整的原生質體，一般會選擇角質化、纖維化低的幼嫩組織，且易獲得的材料。本發(fā)明選擇中山杉生長30天長勢良好的組培苗幼嫩葉片材料（如圖1所示），為了提高原生質體分離的效率和活性，需要對材料進行30h的黑暗預處理（將組培苗放置恒溫培養(yǎng)箱中，25℃遮光生長30h）。

2、中山杉葉肉原生質體的分離與純化

1）用刀片將中山杉片從葉柄上迅速分離下來，輕輕將葉片切成0.5-1mm寬的葉條。

2）配制酶液：500μl200mmmes溶液，3.75ml0.8m甘露醇，500μl0.2mkcl，25μlddh2o混合后，70℃水浴10min后，立即加入150μl纖維素酶cellulase，75μl果膠酶pectinase，55℃水浴15min，0.20mm的膜過濾滅菌，酶液應新鮮制備，且呈淺棕色。

3）將葉片切好后舒展地放入酶液中，25℃恒溫培養(yǎng)箱中暗陪5小時酶解，當酶解液體變綠時，輕輕搖晃培養(yǎng)容器促使原生質體釋放出來。

4）沿培養(yǎng)容器邊沿輕輕加入預冷的10mlw5（2mmmes，154mmnacl，125mmcacl2，5mmkcl（ph5.7））溶液，稀釋含有原生質體的酶液。

5）輕輕混勻后，使用200目的篩子過濾除去未酶解的葉子以及雜質。

6）將濾液加入50ml的圓底離心管，4℃，900rpm離心5min，沉淀原生質體。

7）小心除去上清后，用5mlw5溶液重懸沉淀在圓底管底部的原生質體。

8）普通光學顯微鏡下使用血球計數器觀察計數。

9）冰上靜止30min，再次去除上清，然后用適量的mmg（4mmmes，0.4mmannitol，15-100mmmgcl2/cacl2（ph5.7））溶液重懸原生質體，使其終濃度達到6×10⁵/ml，用于后期的質粒轉化。

實施例2

1、質粒提取

本實施例中用于轉化的載體p2fgw7.0為商業(yè)載體，載體圖如圖2所示，該載體含有一個組成型強表達啟動子p35s，可以在原生質體內部高效表達，含有一個egfp標簽，可以在紫外燈下照射下觀察到綠色熒光信號。使用天根公司生產的小提中量試劑盒提取包含載體的質粒，一般15~20ml過夜培養(yǎng)菌液可以抽提50~80μg左右質粒。

1）柱平衡步驟：向吸附柱cp4中加入500μl的平衡液bl，12000rpm離心1min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。

2）取5~15ml過夜培養(yǎng)的含有p2fgw7.0為載體的菌液（菌液濃度控制在0.3-1.5od），加入離心管中，12000rpm離心1min，盡量吸除上清。

3）向留有菌體沉淀的離心管中加入500μl溶液p1，使用移液器或渦旋振蕩器徹底懸浮細菌細胞沉淀。

4）向離心管中加入500μl溶液p2，溫和地上下翻轉6~8次使菌體充分裂解。

5）向離心管中加入700μl溶液p3，立即溫和地上下翻轉6~8離心管底部形成沉淀。

6）將上一步收集的上清液分次加入過濾柱cs，12000rpm離心2min，小心地將離心后收集管中得到的溶液分次加入吸附柱cp4中。

7）12000rpm離心lmin，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱cp4放入收集管中。

8）向吸附柱cp4中加入500μl去蛋白液pd，12000rpm離心lmin，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱cp4放入收集管中。

9）向吸附柱cp4中加入600μl漂洗液pw，12000rpm離心1min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱cp4放入收集管中。

10）向吸附柱cp4中加入600μl漂洗液pw，12000rpm離心lmin，倒掉收集管中的廢液。

11）將吸附柱cp4重新放回收集管中置于12000rpm離心2min，目的是將吸附柱中殘余的漂洗液去除。

12）將吸附柱置于一個干凈的離心管中，向吸附膜的中間部位懸空滴加100~300μlddh2o洗脫，室溫放置2min，12000rpm離心lmin將質粒溶液收集到離心管中。

2、peg介導的原生質體轉化

1）加入20μl的已提純的質粒（10-20ug）至2ml離心管中。

2）加入200μl的已經分離純化的中山杉葉肉原生質體，輕柔混合。

3）加入220μl的peg溶液（30~40%（wt/vol）peg4000，0.2mmannitol，100mmcacl2），輕柔拍打離心管完全混合。

4）黑暗環(huán)境中，冰浴誘導轉化混合物5-15分鐘。

5）室溫下用800μl的w5溶液稀釋轉化混合液，然后輕柔顛倒搖動離心管使之混合完好以終止轉化反應。

6）室溫下用臺式離心機1000rpm，離心6min，然后利用移液槍輕輕去除上清。

7）用200μl的wi溶液（4mmmes，0.5mmannitol，20mmkcl（ph5.7））輕柔重懸原生質體于多2ml的離心管中。

8）室溫下（20-25℃）黑暗培養(yǎng)，誘導原生質體表達轉化的載體18小時以上。

9）熒光顯微鏡（olympusbx51，japan）下觀察gfp標簽的表達。

本實施例以其他植物葉肉原生質體轉化體系為基礎，進行優(yōu)化，最終建立了穩(wěn)定且高效的中山杉葉肉原生質體轉化體系。由圖4可見：中山杉葉肉原生質體轉化體系轉化效率一般可達到80%以上，為后期針葉樹種基因亞細胞定位，啟動子活性分析，蛋白互作等研究的開展提供了堅實的保障。

實施例3

本發(fā)明以中山杉406組培苗的葉片為材料，以哈佛大學shenj實驗室2007年在natureprotocol上發(fā)表的擬南芥葉肉原生質體轉化體系為基礎，進行中山杉葉肉原生質體酶解體系的優(yōu)化，纖維素酶從1%~4%每1%設置一個梯度，果膠酶從0.5%~2%每0.5%設置一個梯度，共16組酶液配比，酶解12小時后觀察酶解情況并計數，每次計數重復三次，結果如表1所示，顯示：當纖維素酶為3%，果膠酶為1.5%，酶解效果最好。

表1不同酶組合及濃度對中山杉培苗原生質體產量（×10⁶/gfw）的影響

酶解時間對中山杉葉肉原生質體分離的影響：如果酶解時間太短，不僅浪費材料，而且原生質體得率也低；酶解時間太長，酶液的毒害作用增強，原生質體破碎，活力降低。在不同酶液配比對葉肉原生質體分離及活力的影響結果基礎上，每間隔1小時（共6小時）對原生質體產量進行計數，每次計數重復三次。結果如圖3所示，顯示：酶解5小時，效果最好。

中山杉葉肉原生質體轉化含有瞬時表達載體p2fgw7.0的質粒成功后，暗培養(yǎng)20h，在紫外燈照射下，綠色熒光被激發(fā)，如圖5所示，可以觀察到原生質體細胞核、細胞質、細胞膜均均有熒光產生。