本發(fā)明涉及一種原核生物表達(dá)體系，尤其是一種可高效、低成本地獲得重組蛋白的可溶性表達(dá)載體。

背景技術(shù)：

在基因工程藥物研究中，由于大腸埃希菌具有遺傳背景清楚、繁殖快、成本低、表達(dá)量高、易于操作等優(yōu)點(diǎn)，但不可避免地也存在著一定的缺點(diǎn)。雖然人們開發(fā)出了多種表達(dá)體系，以克服大腸埃希菌表達(dá)產(chǎn)物中含有內(nèi)毒素、缺少翻譯后修飾、高表達(dá)時(shí)易折疊錯誤等不足，但大腸埃希菌表達(dá)體系仍然是基因表達(dá)的重要工具。

在利用大腸埃希菌高水平表達(dá)外源基因，尤其是表達(dá)產(chǎn)物富含二硫鍵時(shí)，易于形成包涵體，而經(jīng)變性/復(fù)性后，正確折疊的蛋白質(zhì)的產(chǎn)量不穩(wěn)定，有時(shí)會很低，甚至有些蛋白尤其是高分子量的蛋白基本上不能正確折疊。雖然目前已經(jīng)開發(fā)出多種可促進(jìn)的外源蛋白正確折疊、提高其產(chǎn)量的表達(dá)載體，但由于促進(jìn)蛋白正確折疊的生物分子，如分子伴侶dnak、groel等，其分子量與某些目的蛋白相近，混入其中，導(dǎo)致所獲得蛋白的純度不高，而且各種促進(jìn)蛋白正確折疊的生物分子適用不同的目的蛋白。

一般情況下，利用基因重組技術(shù)，可以實(shí)現(xiàn)低成本、高效地獲取具有藥用價(jià)值的重組多肽或蛋白，但所獲得的蛋白純度不高、純化步驟繁瑣。通常采用親和標(biāo)簽與目的蛋白融合表達(dá)的方式來簡化重組蛋白的分離純化步驟，但所獲得的目的蛋白的一端帶有親和標(biāo)簽。而對于很多蛋白質(zhì)藥物而言，藥典規(guī)定其不能含有親和標(biāo)簽，故親和標(biāo)簽的去除又成為了一個(gè)難題。目前，常見的親和標(biāo)簽去除方法有化學(xué)法切割和酶法切割。其中，化學(xué)法切割對目的蛋白的活性影響較大，酶法切割成本較高，均不適合大規(guī)模應(yīng)用。

綜合來看，目前還沒有一種載體能夠在保證目的蛋白正確折疊的情況下通過自我剪切獲得不含任何標(biāo)簽的目的蛋白的低成本、高收率的方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供了一種可高效獲得重組蛋白的大腸埃希菌可溶性表達(dá)載體及其構(gòu)建方法，利用該載體進(jìn)行外源蛋白的表達(dá)克服了現(xiàn)有技術(shù)中存在的外源蛋白表達(dá)量少、純度低、操作步驟多、以包涵體形式表達(dá)的缺陷。

本發(fā)明解決當(dāng)前技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是：

所述的高效獲得重組蛋白的大腸埃希菌可溶性表達(dá)載體通過異丙基-β-d-硫代半乳糖苷誘導(dǎo)外源蛋白質(zhì)表達(dá)，載體結(jié)構(gòu)中同時(shí)含有內(nèi)含肽基因與硫氧還蛋白基因，且所表達(dá)的內(nèi)含肽與硫氧還蛋白用六聚組氨酸標(biāo)記。其結(jié)構(gòu)基因，按順序?yàn)榱劢M氨酸標(biāo)簽-柔性連接肽-幾丁質(zhì)結(jié)合域-內(nèi)含肽復(fù)合體編碼基因、外源目的基因、核糖體結(jié)合位點(diǎn)、硫氧還蛋白-柔性連接肽-六聚組氨酸標(biāo)簽復(fù)合體編碼基因。

本發(fā)明的表達(dá)載體通過如下方法構(gòu)建：分別獲取內(nèi)含肽與硫氧還蛋白的核酸序列，通過設(shè)計(jì)合適的引物，對兩個(gè)基因(內(nèi)含肽和硫氧還蛋白)的核酸序列進(jìn)行優(yōu)化和修飾，以市售的通用型表達(dá)載體為母核，通過酶切、酶連，獲得特征結(jié)構(gòu)序列依次為六聚組氨酸標(biāo)簽-柔性連接肽-幾丁質(zhì)結(jié)合域-內(nèi)含肽復(fù)合體編碼基因、外源目的基因、核糖體結(jié)合位點(diǎn)、硫氧還蛋白-六聚組氨酸標(biāo)簽復(fù)合體編碼基因的重組可溶性表達(dá)載體。其中，將六聚組氨酸標(biāo)簽-柔性連接肽-幾丁質(zhì)結(jié)合域-內(nèi)含肽復(fù)合體命名為i復(fù)合體蛋白，硫氧還蛋白-六聚組氨酸標(biāo)簽復(fù)合體命名為h復(fù)合體蛋白，整個(gè)載體命名為psypu-ih。

其中，在內(nèi)含肽基因序列的5'端依次連接上幾丁質(zhì)結(jié)合域基因、柔性連接肽基因、六聚組氨酸標(biāo)簽基因。

在硫氧還蛋白基因3'端進(jìn)行六聚組氨酸基因標(biāo)記。

所述的外源目的基因的結(jié)構(gòu)中含有二硫鍵。

所用的限制性核酸內(nèi)切酶為bspi、bamhi，宿主菌為bl21。

外源目的基因與硫氧還蛋白基因非融合表達(dá)。

本發(fā)明的有益效果是：①利用結(jié)構(gòu)中含內(nèi)含肽的i蛋白的高效自我切割能力，簡化操作步驟，可獲得不帶有親和標(biāo)簽的外源目的蛋白。②利用結(jié)構(gòu)中含硫氧還蛋白的h復(fù)合體蛋白與目的蛋白在兩個(gè)轉(zhuǎn)錄單位中非融合表達(dá)，促進(jìn)目的蛋白正確折疊，獲得表達(dá)量高、有生物活性的目的蛋白，低成本地解決了大腸埃希菌基因工程表達(dá)產(chǎn)物易形成包涵體的問題。同時(shí)，通過親和標(biāo)簽介導(dǎo)，實(shí)現(xiàn)硫氧還蛋白的柱上結(jié)合，避免其混入，提高目的蛋白質(zhì)的純度。③應(yīng)用價(jià)值高，可適用于規(guī)?；a(chǎn)。

總體來看，該表達(dá)載體是一種能夠在保證目的蛋白正確折疊的情況下通過自我剪切獲得不含任何標(biāo)簽的目的蛋白的低成本、高收率的良好工具。

下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)一步說明。

附圖說明

圖1為可溶性表達(dá)載體psypu-ih的構(gòu)建及特征圖譜

圖1-1：(histag)6-柔性連接肽-cdb-intein基因獲??；

圖1-2：proh-柔性連接肽-(histag)6蛋白基因的pcr擴(kuò)增圖譜；

圖1-3：可溶性表達(dá)載體psypu-ih質(zhì)粒構(gòu)建圖譜；

圖1-4：psypu-ih特征區(qū)域的結(jié)構(gòu)順序；

圖2為重組蛋白angp的可溶性表達(dá)及分離純化

圖2-1：重組體psypu-ih-angp的pcr驗(yàn)證圖譜；

圖2-2：重組體psypu-ih-angp的菌落pcr驗(yàn)證圖譜；

圖2-3：重組蛋白angp可溶性分析的sds-page分析圖譜；

圖2-4：intein自我剪切的條件優(yōu)化電泳圖譜；

圖2-5：chealtingsepharose4bfastflow層析圖譜；

圖2-6：spsepharosefastflow離子交換層析圖譜；

圖2-7：q-sepharosefastflow層析圖譜。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1:可溶性表達(dá)載體psypu-ih構(gòu)建

菌株：e.colibl21(de3)為本實(shí)驗(yàn)室保藏

引物：

lg4s-f1：5'-ggtggcggcggtagtggcggcggtggtagtaaaatcgaagaaggtaaactgacaaatcc-3'

lg4s-f2：5'-cgccatatg(cat)5cacggtggcggcggtagtggcggcggtggtagt-3'

lg4s-r1：5'-cgcggatccgaattcgagctcgctcttccgttgtgtacaatgat-3'

proh-f1：5'-cgcgaattctaagaaggagatatacatatgagcgataaaattattcacctgac-3'

proh-r1：5'-actaccaccgccgccactaccgccgccaccgctgctggccaggttagc-3'

proh-f2：5'-ggtggcggcggtagtggcggcggtggtagtatgagcgataaaattattcacctgac-3'

proh-r2：5'-cgcggatccttagctatgatgatgatgatggtggctgctggccaggttag-3'

proh-f：5'-cgcgaattctaagaaggagatatacatatgagcgataaaattattcacctgac-3'

proh-r：5'-cgcggatccttagctatgatgatgatgatggtggctgctggccaggttag-3'

angp-f1：5'-ggtggttgctcttccaacgatggatatataagaggaagtaacg-3'

angp-r1：5'-cgcgaattcttactttttgccaccgcatgtattact-3'

1.1(his)6-柔性連接肽-cdb-intein編碼基因獲取

a.第一輪pcr擴(kuò)增。以ptwin-1為pcr模板，以lg4s-f1和lg4s-r1為引物，pcr擴(kuò)增內(nèi)含肽片段，按表1-1配制pcr反應(yīng)混合液，表1-2所示條件進(jìn)行第一輪pcr擴(kuò)增，1.5％瓊脂糖凝膠電泳檢pcr擴(kuò)增產(chǎn)物，回收備用。

b.以步驟a中回收產(chǎn)物為模板，以lg4s-f2和lg4s-r1為引物，按照上述第一輪pcr擴(kuò)增條件進(jìn)行第二輪pcr擴(kuò)增，1.5％瓊脂糖凝膠電泳檢測pcr擴(kuò)增產(chǎn)物，電泳檢測獲得目的基因大小產(chǎn)物，見附圖1-1。

1.2psypu-i載體構(gòu)建

質(zhì)粒ptwin-1和intein基因雙酶切：質(zhì)粒ptwin-1和intein進(jìn)行ndei和bamhi雙酶切，成為帶有兩個(gè)粘性末端的線性dna分子，按照表1-3和1-4分別配制酶切反應(yīng)混合液，于37℃保溫酶切過夜，65℃20min終止反應(yīng)。

酶切后的質(zhì)粒進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，進(jìn)行膠回收，按表1-5重組進(jìn)行酶連接。連接反應(yīng)混合物，于40℃孵育過夜，熱轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞。

表1-5酶連體系

1.3psypu-i載體的鑒定

pcr擴(kuò)增目的基因片段并電泳檢查陽性的單克隆菌落，小量提取質(zhì)粒，t7terminator為引物進(jìn)行測序，測序圖譜正確。

1.4硫氧還蛋白基因(h蛋白基因)獲取

以特定質(zhì)粒psypu-1b為模板，prohf1/r1、prohf2/r2、prohf/r為引物通過三輪pcr擴(kuò)增，獲得357bp長度的含有proh、柔性連接肽(ggtggcggcggtagtggcggcggtggtagt)、組氨酸標(biāo)簽和的基因。瓊脂糖電泳檢測pcr擴(kuò)增產(chǎn)物如附圖1-2。

1.5psypu-ih表達(dá)載體的構(gòu)建

膠回收片段proh的pcr產(chǎn)物，用ecori和bamhi酶切對其進(jìn)行雙酶切，載體psypu-i同樣雙酶切，酶連后的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌，涂布于lb-amp瓊脂平板，小提質(zhì)粒。pcr擴(kuò)增目的基因片段并電泳檢查呈陽性的單克隆菌落，提取質(zhì)粒，以t7terminator引物進(jìn)行測序，測序結(jié)果正確。

如圖1-3和1-4所示，構(gòu)建成功的psypu-ih的結(jié)構(gòu)特征為：利用氨芐青霉素，或卡那霉素，或氯霉素對載體進(jìn)行抗性標(biāo)記；將兩個(gè)復(fù)制起點(diǎn)(ori、m13ori)串聯(lián)，提高復(fù)制效率；嵌入乳糖操縱子序列(lac),使外源蛋白在特定的條件下實(shí)現(xiàn)表達(dá)；在內(nèi)含肽核酸序列的基礎(chǔ)上，通過設(shè)計(jì)合適的引物，在內(nèi)含肽基因序列的5'端依次連接上幾丁質(zhì)結(jié)合域基因、柔性連接肽基因、六聚組氨酸標(biāo)簽基因；利用同樣的方式，在硫氧還蛋白基因3'端進(jìn)行六聚組氨酸基因標(biāo)記；在內(nèi)含肽基因序列后，添加合適的酶切位點(diǎn)，便于外源基因的插入；在硫氧還蛋白基因與標(biāo)記好的內(nèi)含肽基因前，分別嵌入一個(gè)核糖體結(jié)合位點(diǎn)(rbs)，使二者在兩個(gè)轉(zhuǎn)錄單位中各自表達(dá)，其中外源蛋白與被標(biāo)記的內(nèi)含肽融合表達(dá)，與硫氧還蛋白非融合表達(dá)。

實(shí)施例2：重組蝎毒活性肽angp可溶性表達(dá)、分離純化

2.1重組質(zhì)粒psypu-ih-angp的構(gòu)建

以pet28a-angp為模板，以帶有bspi和ecori限制性內(nèi)切酶識別位點(diǎn)angpf/r為引物，pcr擴(kuò)增angp基因(見附圖2-1)。于37℃進(jìn)行angp基因的ecori單酶切2hr，1.5％瓊脂糖凝膠電泳分離并用膠回收angp基因(見附圖2-2)，將angp的基因經(jīng)ecori單酶切后的回收產(chǎn)物進(jìn)行bspi單酶切，于50℃進(jìn)行angp基因的bspi單酶切1hr，膠回收后進(jìn)行酶連轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受肽。lb-amp篩選重組子，測序驗(yàn)證正確。

2.2重組質(zhì)粒psypu-ih-angp的誘導(dǎo)表達(dá)

取重組質(zhì)粒psypu-ih-angp，熱轉(zhuǎn)化大腸桿菌bl21(de3)感受態(tài)細(xì)胞，涂于含氨芐霉素抗性lb平板，于37℃倒置培養(yǎng)12～16小時(shí)。挑平挑平板單菌落至3mllb(ampicillin120ug/ml)，于37℃，250rpm培養(yǎng)過夜。按照1：100將過夜培養(yǎng)物接種至400ml含120ug/ml氨芐霉素的新鮮lb培養(yǎng)基的三角瓶中，于37℃，250rpm培養(yǎng)至od為0.6-0.8，加入終濃度為0.166mm/l的iptg，繼續(xù)培養(yǎng)4個(gè)小時(shí)。3500轉(zhuǎn)、4℃離心20分鐘，收集菌體沉淀，加入startbuffer(50mmol/lpbs,0.5mnacl,ph8.020ml，溶解菌體沉淀，超聲破碎，得上清、沉淀。對目的蛋白進(jìn)行可溶性分析。從附圖2-3中可知，外源基因得以表達(dá)，并且90％以上的誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物存在于上清液中，說明外源基因在該載體中得到了較高的可溶性表達(dá)。

2.3重組蛋白angp的分離純化

1.上清總蛋白的獲得

取重組質(zhì)粒psypu-ih-angp，熱轉(zhuǎn)化大腸桿菌bl21(de3)感受態(tài)細(xì)胞，涂于含氨芐霉素抗性lb平板，于37℃倒置培養(yǎng)12～16小時(shí)。挑平挑平板單菌落至3mllb(ampicillin120ug/ml)，于37℃，250rpm培養(yǎng)過夜。按照1：100將過夜培養(yǎng)物接種至400ml含120ug/ml氨芐霉素的新鮮lb培養(yǎng)基的三角瓶中，于37℃，250rpm培養(yǎng)至od為0.6～0.8，加入終濃度為0.166mm/l的iptg，繼續(xù)培養(yǎng)4個(gè)小時(shí)。3500轉(zhuǎn)、4℃離心20分鐘，收集菌體沉淀，加入startbuffer(50mmol/lpbs,0.5mnacl,ph8.020ml，溶解菌體沉淀，超聲破碎，140000轉(zhuǎn)、4℃離心20分鐘，得上清、沉淀，獲得上清總蛋白后，樣品上chelatingsepharosefastflow柱，進(jìn)行純化。

2.誘導(dǎo)剪切條件

在改變緩沖液ph值的條件下，誘導(dǎo)上清蛋白中的(his)6-柔性連接肽-cdb-intein-angp發(fā)生自剪切，釋放目的蛋白angp。分別將緩沖液ph值調(diào)至5.0，5.5，6.0，6.5，7.0，室溫下靜置16～24hr后，15％sds-page對剪切效果檢測分析，6.5的剪切條件為最佳(見附圖2-4)。

3.重組蛋白angp的分離純化

a.chealtingsepharose4bfastflow層析

由于重組蛋白(histag)6-柔性連接肽-cdb-intein-angp在成熟肽angp的n末端具有his-tag，其可與nⁱ²⁺特異性結(jié)合，柱上通過改變?nèi)芤簆h值，誘導(dǎo)intein發(fā)生自切割，切除his-tag，釋放目的蛋白angp，所以采用chelatingsepharosefastflow柱層析對樣品進(jìn)行初步分離，純化出目的蛋白。

細(xì)胞破碎上清液上樣至起始緩沖液平衡好的chelatingsepharosefastflow層析柱，然后用起始緩沖液洗滌不能吸附于柱上的蛋白。用a溶液除去內(nèi)毒素，然后用b溶液除去a溶液，最后用起始緩沖液洗至基線。用剪切緩沖液(ph6.5)平衡ni柱，至流出液ph值與剪切緩沖液一致后，常溫下靜置ni柱16～24hr，誘導(dǎo)內(nèi)含肽蛋白intein發(fā)生自剪切。對目的蛋白采用咪唑濃度梯度洗脫。用15％sds-page對層析結(jié)果進(jìn)行檢測分析(附圖2-5)。

b.spsepharosefastflow離子交換層析

利用spsepharosefastflow將經(jīng)過chelatingsepharosefastflow柱層析所獲得的咪唑峰進(jìn)一步分離純化，先采用ph值逐漸升高的方法去除雜蛋白，再通過鹽濃度升高的梯度洗脫目標(biāo)蛋白，附圖2-6中目標(biāo)蛋白在鹽濃度梯度洗脫中出現(xiàn)在(a)-c2峰中。

c.q-sepharosefastflow層析圖譜

經(jīng)spsepharosefastflow柱層析洗脫組分c2經(jīng)q-sepharosefastflow柱層再次分離純化，通過提高鹽濃度梯度洗脫目的蛋白，目的蛋白集中在附圖2-7中c2-2組分中，且目標(biāo)重組蛋白達(dá)到電泳純。

2.5重組蛋白angp鎮(zhèn)痛活性檢測

采用小鼠醋酸扭體法。取昆明種小鼠雌雄各半，體重18g～22g，隨機(jī)分組，每組18～20只，給藥組尾靜脈注射一定劑量樣品，對照組尾靜脈注射0.2ml生理鹽水。20分鐘后按0.1ml/10g體重腹腔注射0.8％(w/w)冰醋酸溶液，致使小鼠產(chǎn)生“扭體反應(yīng)”(腹部內(nèi)凹，軀干與后腿伸張、臀部高起)。從小鼠第一次扭體開始計(jì)算時(shí)間，統(tǒng)計(jì)10分鐘內(nèi)的扭體次數(shù)；若5分鐘內(nèi)小鼠沒有扭體，則5分鐘后開始計(jì)時(shí)，計(jì)數(shù)小鼠在隨后10分鐘內(nèi)的扭體次數(shù)。取平均值作為該組小鼠的扭體數(shù)。按下列公式計(jì)算各給藥組小鼠的扭體反應(yīng)抑制率：

蝎毒活性肽angp具有較好的鎮(zhèn)痛活性，經(jīng)小鼠醋酸扭體實(shí)驗(yàn)表明，利用該載體表達(dá)的蛋白與野生型蛋白在活性上相當(dāng)，沒有顯著性差異，見表2-1。說明該載體表達(dá)的蛋白保持自身的結(jié)構(gòu)和活性。

表2-1.在醋酸扭體模型中獲得的重組rangp和天然angp的鎮(zhèn)痛活性

^a抑制率為(t0-tx)/t0×100％,t0為空白組扭體次數(shù)均值，tx為實(shí)驗(yàn)組扭體次數(shù)均值^b相對活性為tr/tm×100％,tr為陽性組扭體扭體抑制率，tm為實(shí)驗(yàn)組扭體抑制率，*和空白比對顯著性差異(0.05level.n＝18,p<0.05vsns)

本實(shí)例中采用的限制性核酸內(nèi)切酶為bspi、bamhi，宿主菌為bl21(de3)，所獲得的目的蛋白的前端連有i復(fù)合體蛋白。并與proh-柔性連接肽-(histag)6非融合表達(dá)。利用該載體表達(dá)目的蛋白angp，實(shí)現(xiàn)了其原核可溶性表達(dá)，利用親和層析等方法，可實(shí)現(xiàn)了angp快速、高純度的分離，采用自我切割的策略，低成本切除親和標(biāo)簽，獲得的重組活性肽活性不變，且收率為從每升發(fā)酵液中可獲得約3.2mg目的蛋白。

我們針對bmkangm3、anep和lqhit2等蝎毒素和芋螺毒素也做了同樣的實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明均可實(shí)現(xiàn)這些富含二硫鍵的多肽原核可溶性表達(dá)，分離純化的收率在2.5-3.5mg/發(fā)酵液。