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一種雜合抗菌肽MLH的制備方法與流程

文檔序號:11767651閱讀:632來源:國知局
一種雜合抗菌肽MLH的制備方法與流程

本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域,具體涉及一種雜合抗菌肽mlh的制備方法。



背景技術(shù):

近些年來,隨著抗生素廣泛使用甚至濫用,出現(xiàn)越來越多的抗生素耐藥性菌株,甚至耐多重藥物菌株。細(xì)菌耐藥性問題已經(jīng)成為公共健康、環(huán)境與食品安全問題??咕囊蚱浞€(wěn)定的理化性質(zhì)、廣譜的抗菌性以及對靶菌株不易產(chǎn)生耐藥性等特點(diǎn)有望成為新型抗生素。具有與抗生素不同的作用靶點(diǎn)和機(jī)制,對抗生素耐藥菌也有很好的抑菌效果,具有廣譜的抗菌性,對g+、g菌以及真菌等均有一定的抑制作用。

目前抗菌肽的獲得主要有三種途徑:從生物體中直接分離提取;化學(xué)方法直接合成;運(yùn)用基因工程方法獲得。天然來源抗菌肽資源有限,化學(xué)合成抗菌肽成本高且工藝復(fù)雜,因此采用基因工程生產(chǎn)抗菌肽成為目前研究工作的首選,具有良好的應(yīng)用前景。



技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素:

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于針對上述現(xiàn)有技術(shù)中的不足,提供一種雜合抗菌肽mlh的制備方法,通過融合表達(dá)對包涵體進(jìn)行變性以及復(fù)性處理提高重組蛋白表達(dá)產(chǎn)量。

本發(fā)明采用以下技術(shù)方案:

一種雜合抗菌肽mlh的制備方法,通過合成mlh基因并克隆至質(zhì)粒形成重組質(zhì)粒pet-32a-mlh;然后轉(zhuǎn)化感受態(tài)e.colibl21,構(gòu)建重組基因工程菌株pet-32a-mlh/bl21;經(jīng)過iptg強(qiáng)誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)菌體表達(dá),獲得融合蛋白;對融合蛋白的分離純化及復(fù)性;最后經(jīng)ek酶切獲得雜合抗菌肽mlh,所述雜合抗菌肽mlh的氨基酸序列如序列表中seqidno.1所示;所述雜合抗菌肽mlh的核苷酸序列如序列表中seqidno.2所示。

優(yōu)選的,包括以下步驟:

s1、以家蠅抗菌肽、ll-37和幽門螺桿菌肽為母體肽,獲得mlh的氨基酸序列,在mlh基因的5’端加入腸激酶酶切位點(diǎn)序列,合成基因并將其克隆至質(zhì)粒pet-32a中,構(gòu)建重組質(zhì)粒pet-32a-mlh;

s2、將步驟s1構(gòu)建的重組質(zhì)粒pet-32a-mlh轉(zhuǎn)化至感受態(tài)e.colibl21(de3)中,構(gòu)建重組基因工程菌株pet-32a-mlh/bl21;

s3、挑取步驟s2獲得的陽性菌株進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng),12000rpm,離心15min,收集菌體;

s4、對步驟s3收集的菌體進(jìn)行超聲破碎,分別收集細(xì)胞破碎后的上清液和沉淀;

s5、將步驟s4所得沉淀進(jìn)行包涵體純化和復(fù)性處理,得到包含目的蛋白的融合蛋白;

s6、將步驟s5所得融合蛋白加入ek酶,25℃過夜酶切,用截留分子量為10kda超濾管進(jìn)行超濾濃縮,得到雜合抗菌肽mlh。

優(yōu)選的,步驟s1中重組質(zhì)粒pet-32a-mlh質(zhì)粒表達(dá)含有his標(biāo)簽融合的mlh。

優(yōu)選的,步驟s2中,將構(gòu)建重組基因工程菌株pet-32a-mlh/bl21(de3)經(jīng)過氨芐青霉素抗性平板篩選陽性菌株。

優(yōu)選的,步驟s3中,按照1%的接種量將菌體培養(yǎng)至od600達(dá)到0.6,加入1.0mmiptg、16℃、220rpm,誘導(dǎo)10h,收集菌體。

優(yōu)選的,步驟s5中,將步驟s4所得沉淀充分溶解于bindingbuffer中,進(jìn)行ni2+離子親和層析純化,收集流穿液,使用15倍柱體積的bindingbuffer沖洗柱子,洗去雜蛋白,使用elutionbuffer洗脫,收集洗脫峰,將純化后的蛋白經(jīng)透析脫鹽。

優(yōu)選的,對步驟s4的上清液和沉淀進(jìn)行sds-page和westernblot檢測,目的蛋白主要以包涵體形式存在,其中,所述westernblot檢測具體為:

分別將重組菌株未經(jīng)iptg誘導(dǎo)和經(jīng)iptg誘導(dǎo)的產(chǎn)物進(jìn)行sds-page檢測后,200ma,濕電轉(zhuǎn)膜2h;5%脫脂奶粉封閉;加入1:1000比例稀釋的his抗體,4℃過夜孵育;tbst洗滌3次,每次5min;加入1:1000比例稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠二抗,室溫孵育1h;tbst洗滌4次,每次5min;beyoeclstarkit顯色。

與現(xiàn)有技術(shù)相比,本發(fā)明至少具有以下有益效果:

1、本發(fā)明創(chuàng)造性的將家蠅抗菌肽、ll-37和幽門螺桿菌肽做為母體肽,經(jīng)iptg誘導(dǎo),目的蛋白主要以包涵體形式存在,之后通過進(jìn)行包涵體變性和復(fù)性處理,經(jīng)過腸激酶酶切,最終獲得具有活性的雜合抗菌肽,對研發(fā)新型抗菌肽具有重要意義。

2、由于抗菌肽在宿主細(xì)胞中會產(chǎn)生毒性,且表達(dá)量較低,易被宿主降解,為了便于目的蛋白的分離純化,本發(fā)明使用pet-32a表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行融合表達(dá),pet-32a含有his等標(biāo)簽,可以與鎳離子特異性結(jié)合,通過親和層析達(dá)到純化的目的。

3、大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)具有成本低、操作簡單、產(chǎn)量高等特點(diǎn),同時大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)外源蛋白時容易形成不溶性包涵體,包涵體的形成可以有效的防止蛋白質(zhì)的降解、減少對宿主細(xì)胞的毒害作用、提高重組蛋白表達(dá)產(chǎn)量。本發(fā)明通過包涵體進(jìn)行變性和復(fù)性處理以提高重組蛋白的表達(dá)產(chǎn)量。

下面通過附圖和實(shí)施例,對本發(fā)明的技術(shù)方案做進(jìn)一步的詳細(xì)描述。

附圖說明

圖1為本發(fā)明制備方法流程圖;

圖2為本發(fā)明雜合肽mlh對大腸桿菌抑菌性測定;

圖3為本發(fā)明雜合肽mlh對金黃色葡萄球菌抑菌性測定。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明提供了一種雜合抗菌肽mlh的制備方法,以家蠅抗菌肽、ll-37和幽門螺桿菌肽為母體肽,獲得mlh的氨基酸序列,并在該mlh基因的5’端加入腸激酶酶切位點(diǎn)序列,化學(xué)合成mlh基因并克隆至質(zhì)粒pet-32a,構(gòu)建重組質(zhì)粒。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至表達(dá)菌株,構(gòu)建重組基因工程菌pet-32a-mlh/bl21(de3)。經(jīng)iptg誘導(dǎo),目的蛋白與載體標(biāo)簽蛋白進(jìn)行融合表達(dá),sds-page和westernblot進(jìn)行檢測,目的蛋白主要以包涵體形式存在,之后通過進(jìn)行包涵體變性和復(fù)性處理,經(jīng)過腸激酶酶切,最終獲得具有活性的雜合抗菌肽mlh。

請參閱圖1,本發(fā)明一種雜合抗菌肽mlh的制備方法,具體步驟如下:

1、設(shè)計雜合基因mlh的基因片斷。

雜合基因mlh的氨基酸序列為:

gwlkkigkkiervgqhtrkrivqrikakkvfkrleklfskiqn;

編碼雜合基因mlh的堿基序列為:

ggttggctgaaaaaaatcggtaaaaaaatcgaacgtgttggtcagcacacccgtaaacgtatcgttcagcgtatcaaagctaaaaaagttttcaaacgtctggaaaaactgttctctaaaatccagaac。

在該mlh基因的5’端加入腸激酶酶切位點(diǎn)序列(asp-asp-asp-asp-lys),根據(jù)e.coli密碼子偏愛性設(shè)計編碼雜合基因mlh的基因片斷,由生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行全基因的合成,并直接克隆至質(zhì)粒pet-32a中,構(gòu)建重組質(zhì)粒pet-32a-mlh,該質(zhì)粒表達(dá)含有his等多種標(biāo)簽融合的mlh。

2、采用cacl2法制備感受態(tài)宿主細(xì)胞e.colibl21細(xì)胞,并將步驟1構(gòu)建重組質(zhì)粒pet-32a-mlh轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞中,菌落pcr進(jìn)行驗(yàn)證。將陽性克隆的培養(yǎng)物送測序公司進(jìn)行重組質(zhì)粒的序列測定,分析重組質(zhì)粒中外源基因是否正確插入。

菌落pcr驗(yàn)證步驟:挑取一些菌落分別接種于5mllb培養(yǎng)基中(含50μg/ml氨芐青霉素),37℃振蕩過夜培養(yǎng)后,取培養(yǎng)物pcr反應(yīng)篩選陽性克隆。

20ulpcr體系為:premixtaq10ul,上游引物1ul,下游引物1ul,模板1ul,水7ul,pcr條件:94℃預(yù)熱5min;94℃、30s,62℃、30s,72℃、30s,共35個循環(huán);72℃延伸5min。

3、將步驟2中鑒定正確的陽性菌株進(jìn)行過夜培養(yǎng)。

按照1%的接菌量將過夜培養(yǎng)液接種于4mllb培養(yǎng)基中,37℃,220rpm培養(yǎng)至od600約為0.6,加入1.0mmiptg,18℃,220rpm誘導(dǎo)10h。12000rpm,離心15min,收集菌體。

將菌體重懸與適量pbs中超聲破碎細(xì)胞,4℃,12000rpm離心15min,分別收集細(xì)胞破碎后上清液和沉淀。

4、將步驟3收集細(xì)胞破碎后上清液和沉淀進(jìn)行sds-page和westernblot檢測,結(jié)果表明,融合蛋白成功在大腸桿菌中表達(dá)且主要以包涵體形式存在。

westernblot:分別將重組菌株未經(jīng)iptg誘導(dǎo)和經(jīng)iptg誘導(dǎo)的產(chǎn)物進(jìn)行sds-page檢測后,200ma,濕電轉(zhuǎn)膜2h;5%脫脂奶粉封閉;加入1:1000比例稀釋的his抗體,4℃過夜孵育;tbst洗滌3次,每次5min;加入1:1000比例稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠二抗,室溫孵育1h;tbst洗滌4次,每次5min;beyoeclstarkit顯色。

5、將步驟4所得沉淀進(jìn)行包涵體純化和復(fù)性處理,獲得具有活性的融合蛋白。

包涵體變性處理:將步驟4所得沉淀充分溶解于bindingbuffer(tris-hcl(ph7.9)20mm、咪唑5mm、nacl0.5m、尿素8m)中。

ni2+親和層析純化:離心后以10倍柱體積/小時流速上樣,收集流穿液。使用15倍柱體積的bindingbuffer沖洗柱子,洗去雜蛋白,使用適量elutionbuffer(tris-hcl(ph7.9)20mm、咪唑500mm、nacl0.5m、尿素8m)洗脫,收集洗脫峰,將純化后的蛋白經(jīng)透析脫鹽。

包涵體復(fù)性:tge透析復(fù)性(復(fù)性液:tris50mm,edta0.5mm,nacl50mm,10%甘油,1%甘氨酸,ph7.9,4~8h換一次透析液,透析24h)。

6、對步驟5所得融合蛋白中加入ek酶,25℃過夜酶切,用截留分子量為10kda超濾管進(jìn)行超濾濃縮,所得產(chǎn)物即為雜合抗菌肽mlh。

7、將步驟6所得雜合抗菌肽mlh采用瓊脂孔穴擴(kuò)散法進(jìn)行抑菌活性驗(yàn)證。

請參閱圖2和圖3,雜合抗菌肽mlh對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌均有明顯的抑菌活性。

以上內(nèi)容僅為說明本發(fā)明的技術(shù)思想,不能以此限定本發(fā)明的保護(hù)范圍,凡是按照本發(fā)明提出的技術(shù)思想,在技術(shù)方案基礎(chǔ)上所做的任何改動,均落入本發(fā)明權(quán)利要求書的保護(hù)范圍之內(nèi)。

核苷酸序列表

<110>陜西科技大學(xué)

<120>一種雜合抗菌肽mlh的制備方法

<160>2

<210>1

<211>43

<212>prt

<213>人工合成

<400>1

glytrpleulyslysileglylyslysilegluargvalglyglnhisthrarglysarg

15101520

ilevalglnargilelysalalyslysvalphelysargleuglulysleupheserlys

25303540

ileglnasn

43

<210>2

<211>130

<212>dna

<213>人工合成

<400>2

ggttggctgaaaaaaatcggtaaaaaaatcgaacgtgttggtcagcacacccgtaaacgt60

atcgttcagcgtatcaaagctaaaaaagttttcaaacgtctggaaaaactgttctctaaa120

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