本發(fā)明涉及細(xì)胞制備技術(shù)領(lǐng)域，具體來說，涉及一種mscs來源的少突膠質(zhì)細(xì)胞的制備方法及試劑盒。

背景技術(shù)：

多發(fā)性硬化癥、白血病、營養(yǎng)不良等多種神經(jīng)退行性疾病，以及中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷等都會導(dǎo)致髓鞘損失，目前缺乏有效的治療手段。少突膠質(zhì)前體細(xì)胞（oligodendrocyteprecursorcells，opcs）在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中分化產(chǎn)生少突膠質(zhì)細(xì)胞形成髓鞘結(jié)構(gòu)，其異常會導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)脫髓鞘病變，繼而導(dǎo)致神經(jīng)元損傷和精神類疾病，是重要的治療靶點。少突膠質(zhì)前體細(xì)胞替代治療或再生修復(fù)治療是維持和修復(fù)損傷的軸突、重建軸突電傳導(dǎo)功能的最新進(jìn)展和最有前景的治療手段。

現(xiàn)有技術(shù)中的少突膠質(zhì)細(xì)胞的制備采用胚胎干細(xì)胞（embryonicstemcells，escs）、誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（inducedpluripotentstemcells，ipscs）體外分化獲得。escs來源的少突膠質(zhì)細(xì)胞細(xì)胞制劑關(guān)系到嚴(yán)重的倫理問題和體內(nèi)移植致瘤的嚴(yán)重臨床風(fēng)險，ipscs來源的少突膠質(zhì)細(xì)胞制劑關(guān)系到外源基因轉(zhuǎn)染和更嚴(yán)重的體內(nèi)移植致瘤性的嚴(yán)重臨床風(fēng)險。而且escs或ipscs體外誘導(dǎo)分化制備opcs工藝復(fù)雜，使用血清等動物源成分，對opcs制劑質(zhì)量和臨床安全性產(chǎn)生不可預(yù)估的影響，同時限制了opcs制劑產(chǎn)率，影響了臨床研究和產(chǎn)業(yè)化轉(zhuǎn)化潛力。

針對相關(guān)技術(shù)中的問題，目前尚未提出有效的解決方案。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

針對相關(guān)技術(shù)中的上述技術(shù)問題，本發(fā)明提出一種mscs來源的少突膠質(zhì)細(xì)胞的制備方法及試劑盒，既避免了采用escs來源的少突膠質(zhì)細(xì)胞細(xì)胞制劑而產(chǎn)生的的嚴(yán)重的倫理問題和體內(nèi)移植致瘤的嚴(yán)重臨床風(fēng)險，也避免了采用ipscs來源的少突膠質(zhì)細(xì)胞制劑產(chǎn)生的外源基因轉(zhuǎn)染和更嚴(yán)重的體內(nèi)移植致瘤性的嚴(yán)重臨床風(fēng)險，操作簡單，opcs收率高、無動物源成分。

為實現(xiàn)上述技術(shù)目的，本發(fā)明的技術(shù)方案是這樣實現(xiàn)的：

一種mscs來源的少突膠質(zhì)細(xì)胞制備試劑盒，包括opcs無血清基礎(chǔ)培養(yǎng)基、opcs培養(yǎng)添加劑1、opcs培養(yǎng)添加劑2及opcs培養(yǎng)表面包被液，其中，

所述opcs無血清基礎(chǔ)培養(yǎng)基為含有b27，n2，l-谷氨酰胺，1,25-二羥維生素d3，三碘甲狀腺氨酸，人褪黑素的dmem/f12培養(yǎng)基；

所述opcs培養(yǎng)添加劑1為含有重組人堿性成纖維細(xì)胞生長因子、重組人表皮生長因子的dmem/f12培養(yǎng)基；

所述opcs培養(yǎng)添加劑2為含有重組人血小板來源生長因子aa、重組人神經(jīng)營養(yǎng)因子3的dmem/f12培養(yǎng)基；

所述opcs培養(yǎng)表面包被液為含有重組人層黏連蛋白、重組人玻連蛋白的dmem/f12培養(yǎng)基。

進(jìn)一步地，

所述opcs無血清基礎(chǔ)培養(yǎng)基含有1×b27，1×n2，2mml-谷氨酰胺，1um1,25-二羥維生素d3，40ng/ml三碘甲狀腺氨酸，0.5ug/ml人褪黑素；

所述opcs培養(yǎng)添加劑1為含有1ug/ml重組人堿性成纖維細(xì)胞生長因子、1ug/ml重組人表皮生長因子的dmem/f12；

所述opcs培養(yǎng)添加劑2為含有1ug重組人血小板來源生長因子aa、100ng/ml重組人神經(jīng)營養(yǎng)因子3的dmem/f12；

所述opcs培養(yǎng)表面包被液為含有100ng/ml重組人層黏連蛋白、100ng/ml重組人玻連蛋白的dmem/f12。

根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了一種mscs來源的少突膠質(zhì)細(xì)胞制備方法，包括如下步驟：

s1.用opcs培養(yǎng)表面包被液室溫包被培養(yǎng)表面1小時，吸棄包被液，經(jīng)pbs漂洗后置于4℃保存不超過1周；

s2.p2代的mscs按6000個/cm²接種，以含10%無動物源成分血清替代品的mscs培養(yǎng)基培養(yǎng)至60-70%匯合；

s3.換含opcs培養(yǎng)添加劑1的opcs無血清基礎(chǔ)培養(yǎng)基，培養(yǎng)至80-90%匯合，用胰蛋白酶溶液消化收獲細(xì)胞，記為神經(jīng)上皮預(yù)誘導(dǎo)細(xì)胞；

s4.以含opcs培養(yǎng)添加劑1和opcs培養(yǎng)添加劑2的opcs無血清基礎(chǔ)培養(yǎng)基重懸神經(jīng)上皮預(yù)誘導(dǎo)細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度至1.5×10⁴/cm²，接種至被opcs培養(yǎng)表面包被液包被的培養(yǎng)表面，培養(yǎng)至60-80%匯合時傳代，記為p0代opcs。

進(jìn)一步地，

所述opcs培養(yǎng)表面包被液為經(jīng)dmem/f12稀釋10倍的opcs培養(yǎng)表面包被液；

所述含opcs培養(yǎng)添加劑1的opcs無血清基礎(chǔ)培養(yǎng)基中opcs培養(yǎng)添加劑1含量為2%；

所述含opcs培養(yǎng)添加劑1和opcs培養(yǎng)添加劑2的opcs無血清基礎(chǔ)培養(yǎng)基中opcs培養(yǎng)添加劑1的含量為2%，opcs培養(yǎng)添加劑2的含量為2%。

進(jìn)一步地，所述步驟s4后還包括如下步驟：將p0代opcs按常規(guī)貼壁細(xì)胞傳代方法傳代，收獲p2代細(xì)胞。

進(jìn)一步地，所述常規(guī)貼壁細(xì)胞傳代方法傳代過程中的接種密度為1.5×10⁴/cm²，培養(yǎng)體系為含1%opcs培養(yǎng)添加劑1和1%opcs培養(yǎng)添加劑2的opcs無血清基礎(chǔ)培養(yǎng)基；培養(yǎng)表面為經(jīng)opcs培養(yǎng)表面包被液包被的培養(yǎng)表面。

進(jìn)一步地，所述mscs來源于人臍帶、羊膜、羊水、胎盤、臍帶血、宮膜、牙髓、骨髓、皮膚、肌腱、骨骼肌。

本發(fā)明的有益效果：本發(fā)明提供了以mscs為來源制備少突膠質(zhì)細(xì)胞的方法，并提供了一種以mscs為來源制備少突膠質(zhì)細(xì)胞的試劑盒。mscs是組織來源最豐富的成體干細(xì)胞之一，使用mscs制備少突膠質(zhì)細(xì)胞既避免了采用escs來源的少突膠質(zhì)細(xì)胞細(xì)胞制劑而產(chǎn)生的的嚴(yán)重的倫理問題和體內(nèi)移植致瘤的嚴(yán)重臨床風(fēng)險，也避免了采用ipscs來源的少突膠質(zhì)細(xì)胞制劑產(chǎn)生的外源基因轉(zhuǎn)染和更嚴(yán)重的體內(nèi)移植致瘤性的嚴(yán)重臨床風(fēng)險，并且操作簡單，opcs收率高、無動物源成分。

附圖說明

圖1是p2代mscs的細(xì)胞形態(tài)圖;

圖2是p2代mscs細(xì)胞表達(dá)nestin形態(tài)圖；

圖3是p2代mscs細(xì)胞表達(dá)a2b5形態(tài)圖；

圖4是神經(jīng)上皮預(yù)誘導(dǎo)細(xì)胞形態(tài)圖；

圖5是神經(jīng)上皮預(yù)誘導(dǎo)細(xì)胞表達(dá)nestin形態(tài)圖；

圖6是神經(jīng)上皮預(yù)誘導(dǎo)細(xì)胞表達(dá)a2b5形態(tài)圖；

圖7是p0代opcs的細(xì)胞形態(tài)圖;

圖8是p0代opcs細(xì)胞表達(dá)nestin形態(tài)圖；

圖9是p0代opcs細(xì)胞表達(dá)a2b5形態(tài)圖；

圖10是p2代opcs的細(xì)胞形態(tài)圖;

圖11是p2代opcs細(xì)胞表達(dá)nestin形態(tài)圖；

圖12是p2代opcs細(xì)胞表達(dá)a2b5形態(tài)圖；

圖13是不同培養(yǎng)階段細(xì)胞標(biāo)志蛋白的表達(dá)的統(tǒng)計圖；

圖14是不同培養(yǎng)階段細(xì)胞得率統(tǒng)計圖；

圖15是少突膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)圖；

圖16是少突膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)nestin形態(tài)圖；

圖17是少突膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)a2b5形態(tài)圖；

圖18是少突膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)mbp形態(tài)圖。

具體實施方式

下面將結(jié)合具體實施例對本發(fā)明實施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述。實施例中所使用的各種試劑、機(jī)械未經(jīng)特殊說明均可從商業(yè)途徑獲得。

首先，對本申請中出現(xiàn)的英文名稱及實施例中所具體使用的各種產(chǎn)品的生產(chǎn)廠家、貨號進(jìn)行簡要說明。

opcs:少突膠質(zhì)前體細(xì)胞，oligodendrocyteprecursorcells。

escs：胚胎干細(xì)胞，embryonicstemcells。

mscs：間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞，mesenchymalstromacells。

dmem/f12：是一種細(xì)胞培養(yǎng)基，實施例中所使用的dmem/f12貨號是12400-024，生產(chǎn)廠家是gibco。

b27:人體白細(xì)胞抗原。

n2:是一種細(xì)胞培養(yǎng)添加劑，實施例中所使用的n2貨號是17502-048，生產(chǎn)廠家是gibco。

pbs:磷酸鹽緩沖液。

無動物源成分血清替代品:實施例中所使用的無動物源成分血清替代品貨號是c08003c，生產(chǎn)廠家是stemboscience。

0.25%胰蛋白酶溶液：實施例中所使用的0.25%胰蛋白酶溶液貨號是t6424-1vl，成產(chǎn)廠家是biologicalindustries。

抑肽酶溶液：實施例中所使用的抑肽酶溶液貨號是a1250000，成產(chǎn)廠家是sigma。

fbs：胎牛血清，貨號04-400-1a，生產(chǎn)廠家bi。

t3：三碘甲狀腺氨酸，貨號709611，生產(chǎn)廠家sigma-aldrich。

sonichedgehog：音猬因子，實施例中所使用的sonichedgehog貨號是srp3156，生產(chǎn)廠家是sigma。

noggin：頭蛋白，實施例中所使用的noggin貨號是h6416，生產(chǎn)廠家是sigma。

雙丁酰c-amp：實施例中所使用的雙丁酰c-amp貨號是d0627，生產(chǎn)廠家是sigma。

igf-1：類胰島素生長因子1，貨號cyt-216，生產(chǎn)廠家prospec-tany。

nt3：神經(jīng)營養(yǎng)因子3，貨號cyt-257，生產(chǎn)廠家prospec-tany。

實施例一：試劑盒的構(gòu)成

mscs來源的少突膠質(zhì)細(xì)胞制備試劑盒包括opcs無血清基礎(chǔ)培養(yǎng)基（obm）、opcs培養(yǎng)添加劑1（os1）、opcs培養(yǎng)添加劑2（os2）及opcs培養(yǎng)表面包被液（ocb）。

其中，opcs無血清基礎(chǔ)培養(yǎng)基（obm）為包含以下物質(zhì)的dmem/f12培養(yǎng)基：

1×b27，

1×n2，

2mml-谷氨酰胺，

1um1,25-二羥維生素d3（1,25(oh)2d3），

40ng/ml三碘甲狀腺氨酸（3,3',5-tri-iodo-thyronine，t3），

0.5ug/ml人褪黑素（melatonin）。

opcs培養(yǎng)添加劑1（os1）為包含以下物質(zhì)的dmem/f12培養(yǎng)基：

1ug/ml重組人堿性成纖維細(xì)胞生長因子（rhb-fgf），

1ug/ml重組人表皮生長因子（rhegf）。

opcs培養(yǎng)添加劑2（os2）為包含以下物質(zhì)的dmem/f12培養(yǎng)基：

1ug重組人血小板來源生長因子aa（rhpdgf-aa），

100ng/ml重組人神經(jīng)營養(yǎng)因子3（rhnt-3）。

opcs培養(yǎng)表面包被液（ocb）為包含以下物質(zhì)的dmem/f12培養(yǎng)基：

100ng/ml重組人層黏連蛋白（liminin，ln），

100ng/ml重組人玻連蛋白（vitronectin(vn)）。

實施例二：opcs的制備

opcs的制備使用的試劑，除pbs、消化液、凍存保護(hù)液外，均為實施例一中所述的mscs來源的少突膠質(zhì)細(xì)胞制備試劑盒提供。

s1.4℃條件下將-20℃以下凍存的os1、os2、ocb過夜解凍備用;

s2.用10×ocb（即將試劑盒中的ocb經(jīng)dmem/f12稀釋至終濃度為10%）按每毫升包被35cm²培養(yǎng)表面室溫包被培養(yǎng)表面1小時，吸棄包被液，以2-8℃pbs漂洗3次，置于4℃保存不超過1周；

s3.人臍帶、羊膜、羊水、胎盤、臍帶血、宮膜、牙髓、骨髓、皮膚、肌腱、骨骼肌等組織來源的p2代mscs，按6000個/cm²接種，以含10%無動物源成分血清替代品的mscs培養(yǎng)基培養(yǎng)至60-70%匯合；

s4.換含2%os1的obm培養(yǎng)基，培養(yǎng)至80-90%匯合，用0.25%胰蛋白酶溶液消化收獲細(xì)胞,記為神經(jīng)上皮預(yù)誘導(dǎo)細(xì)胞；

s5.以含2%os1和2%os2的obm培養(yǎng)基重懸神經(jīng)上皮預(yù)誘導(dǎo)細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度至1.5×10⁴/cm²，接種至ocb包被的培養(yǎng)表面培養(yǎng)4-6天60-80%匯合時傳代，記為p0代opcs；

s6.p0代opcs按常規(guī)貼壁細(xì)胞傳代方法傳代，消化液為accutase^tm消化液（貨號40506es60，生產(chǎn)廠家innovativecelltechnologies,inc.），接種密度為1.5×10⁴/cm²，培養(yǎng)體系為含1%os1和1%os2的obm培養(yǎng)基；培養(yǎng)表面為ocb包被的培養(yǎng)表面；

s7.收獲p2代細(xì)胞，可以直接制備制劑，也可以低溫凍存，凍存保護(hù)液使用貨號為cellbanker-ii，生產(chǎn)廠家為zenoaq的凍存保護(hù)液，凍存細(xì)胞密度為2×10⁶/ml。

實施例三：臍帶mscs來源的opcs體外制備

3.1臍帶mscs分離培養(yǎng)

以組織塊法原代培養(yǎng)臍帶mscs，培養(yǎng)體系為mscs培養(yǎng)基，即含10%無動物源成分血清替代品的dmem/f12培養(yǎng)基，培養(yǎng)至12天時，輕輕震蕩培養(yǎng)瓶，懸浮殘余組織塊，小心吸棄培養(yǎng)上清，pbs洗滌培養(yǎng)表面1次，加入0.25%胰蛋白酶溶液，室溫消化5分鐘，加入1ml抑肽酶溶液終止消化；400g離心5min，棄上清，收獲沉淀物；以pbs洗滌2次，以100um尼龍細(xì)胞篩過濾，收集濾液；400g離心5min，棄上清，收獲沉淀細(xì)胞，記為p0代mscs；p0代mscs以mscs培養(yǎng)基重懸，調(diào)整細(xì)胞密度為6000/cm²，接種至175cm²組織培養(yǎng)瓶（easyflask，nunc），培養(yǎng)至70-80%匯合時收獲p1代mscs；按細(xì)胞密度6000個/cm²繼續(xù)傳代，收獲p2代mscs。

3.2mscs源opcs制備

以mscs培養(yǎng)基重懸p2代臍帶來源的mscs，按6000個/cm²接種至175cm²組織培養(yǎng)瓶，培養(yǎng)至60-70%匯合，換含2%os1的obm培養(yǎng)基，培養(yǎng)至80-90%匯合，吸棄培養(yǎng)上清，pbs洗滌培養(yǎng)表面1次，加入0.25%胰蛋白酶溶液，室溫消化5分鐘，加入1ml抑肽酶溶液終止消化；400g離心，5min，棄上清，收獲沉淀細(xì)胞，記為神經(jīng)上皮預(yù)誘導(dǎo)細(xì)胞；

以含2%os1和2%os2的obm培養(yǎng)基重懸神經(jīng)上皮預(yù)誘導(dǎo)細(xì)胞，按1.5×10⁴/cm²接種至ocb包被的175cm²組織培養(yǎng)瓶，隔天換液，60-80%匯合時，吸棄培養(yǎng)上清，pbs洗滌培養(yǎng)表面1次，加入accutase^tm消化液（貨號40506es60，生產(chǎn)廠家innovativecelltechnologies,inc.）5ml，室溫消化5分鐘，加入1ml抑肽酶溶液終止消化；400g離心5min，棄上清，收獲沉淀細(xì)胞，記為p0代opcs；

以含2%os1和2%os2的obm培養(yǎng)基重懸p0代opcs，按1.5×10⁴/cm²接種至ocb包被的175cm²組織培養(yǎng)瓶，培養(yǎng)至60-80%匯合時收獲，記為p1代opcs；p1代opcs繼續(xù)傳代培養(yǎng)至p2代，收獲。

實施例四：p2代mscs來源的opcs分化潛能檢測

4.1少突膠質(zhì)細(xì)胞分化培養(yǎng)

按5×10⁴/ml接種p2代opcs于ocb包被的24孔組織培養(yǎng)板培養(yǎng)，每兩天半量換液，第8天時行組織學(xué)檢測。少突膠質(zhì)細(xì)胞分化培養(yǎng)基為含有如下成分的dmem/f12培養(yǎng)基：

2%無動物源成分血清替代品，

2%fbs，

1×n2，

40ng/mlt3，

100ng/mlsonichedgehog，

100ng/mlnoggin，

10μm雙丁酰，

100ng/mligf-1，

10ng/nt3。

4.2mscs、神經(jīng)上皮預(yù)誘導(dǎo)細(xì)胞、opcs、少突膠質(zhì)細(xì)胞的一般生物學(xué)檢測

4.2.1免疫組織學(xué)檢測

貼壁細(xì)胞免疫組織學(xué)檢測時，吸棄培養(yǎng)基，以pbs漂洗2次，以4％多聚甲醛（pfa）固定細(xì)胞10分鐘，以pbs漂洗2次，滴加一抗，4℃過夜；pbs洗滌2次，滴加fitc標(biāo)記二抗，室溫孵育1小時；pbs漂洗2次，滴加1μg/ml4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（dapi），孵育5分鐘，pbs漂洗2次，鏡檢。

免疫組織化學(xué)檢測使用抗體包括：

mouseanti-nestin【clone10c2(1:400)，生產(chǎn)廠家millipore】；

mouseanti-a2b5【clone105(1:500)，生產(chǎn)廠家r&dsystems】；

rabbitanti-mbp【(1:200)，生產(chǎn)廠家sigma-aldrich】；

fitc標(biāo)記二抗：猴抗鼠igg(1:200)和羊抗兔igg(1:200)（生產(chǎn)廠家lifetechnologies）。

4.2.2細(xì)胞得率統(tǒng)計

以細(xì)胞成像系統(tǒng)（cytellcellimagingsystem，gehealthcare）行活細(xì)胞計數(shù)和免疫組織學(xué)染色計數(shù)，包括：p2代mscs、nestin+dapi+神經(jīng)上皮預(yù)誘導(dǎo)細(xì)胞數(shù)量，nestin+dapi+、a2b5+dapi+的p0代opcs和p2代opcs數(shù)量，mbp+、dapi+的p2代opcs和少突膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量。

統(tǒng)計學(xué)分析采用spss17.0進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理。數(shù)據(jù)以±s表示，均值比較采用獨立樣本t-test，p<0.05有統(tǒng)計學(xué)意義。

實施例五：統(tǒng)計結(jié)果

5.1神經(jīng)上皮預(yù)誘導(dǎo)細(xì)胞培養(yǎng)

不同培養(yǎng)階段細(xì)胞標(biāo)志蛋白的表達(dá)統(tǒng)計結(jié)果如圖13所示。

如圖1~3所示，

p2代mscs隨培養(yǎng)時間延長呈典型的漩渦狀生長，多數(shù)細(xì)胞為長梭形，少數(shù)為三角形、多角形（圖1）;

11.87±1.15%的細(xì)胞表達(dá)nestin（圖2）；

7.84±0.56%的細(xì)胞表達(dá)a2b5（圖3）；

如圖4~6所示，

經(jīng)含2%os1的obm培養(yǎng)基培養(yǎng)后，細(xì)胞逐漸相互平行,縮回細(xì)胞質(zhì),形成明顯拉長的細(xì)胞體（圖4）；

95.84±8.61%的細(xì)胞表達(dá)nestin（圖5）；

21.84±5.56%的細(xì)胞表達(dá)a2b5（圖6）。

5.2p0代opcs培養(yǎng)

如圖7~9所示

以含2%os1和2%os2的obm培養(yǎng)基培養(yǎng)神經(jīng)上皮預(yù)誘導(dǎo)細(xì)胞4-6天，部分貼壁細(xì)胞獲得雙極性的opcs形態(tài)（圖7）；

45.21±4.66%的細(xì)胞表達(dá)nestin（圖8）；

46.22±7.39%的細(xì)胞表達(dá)a2b5（圖9）。

5.3p2代opcs培養(yǎng)

以含1%os1和1%os2的obm培養(yǎng)基繼代培養(yǎng)p0代opcs至p2代，多數(shù)細(xì)胞表現(xiàn)出雙極性或三極性，少數(shù)細(xì)胞表現(xiàn)出多極性形態(tài)（圖10）；

41.83±3.91%的細(xì)胞表達(dá)nestin（圖11）；

92.09±11.43%的細(xì)胞表達(dá)a2b5（圖12）。

5.4opcs細(xì)胞得率

不同培養(yǎng)階段細(xì)胞得率統(tǒng)計結(jié)果如圖14所示。

1.05×10⁶p2代mscs按6000個/cm²接種到175cm²組織培養(yǎng)瓶（easyflask，nunc）中，獲得5.74±1.48×10⁶神經(jīng)上皮預(yù)誘導(dǎo)細(xì)胞；

神經(jīng)上皮預(yù)誘導(dǎo)細(xì)胞約按1.5×10⁴/cm²接種至ocb包被的2個175cm²組織培養(yǎng)瓶（easyflask，nunc）中，獲得15.66±3.39×10⁶p0代opcs；

p0代opcs約按1.5×10⁴/cm²接種至ocb包被的6個175cm²組織培養(yǎng)瓶（easyflask，nunc）中，獲得46.51±8.82×10⁶p1代opcs，繼而約按1.5×10⁴/cm²接種至ocb包被的18個175cm²組織培養(yǎng)瓶（easyflask，nunc）中，獲得139.89±36.22×10⁶p2代opcs。

p2代opcs按5×10⁴/ml接種于ocb包被的24孔組織培養(yǎng)板培養(yǎng)8天，誘導(dǎo)少突膠質(zhì)細(xì)胞分化。結(jié)果表明，培養(yǎng)第4天開始，細(xì)胞停止增殖，大量細(xì)胞死亡，至第8天時，平均存活細(xì)胞數(shù)為2.24±0.88×104/孔，所有細(xì)胞分化成典型少突膠質(zhì)細(xì)胞樣形態(tài)（圖15）。

免疫組織化學(xué)檢測結(jié)果表明，2.83±0.52%存活細(xì)胞表達(dá)nestin（圖16），9.95±2.22%存活細(xì)胞表達(dá)a2b5（圖17），而98.31±11.42%存活細(xì)胞表達(dá)mbp（圖18）。

實施例六：結(jié)果分析

哺乳動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷，軸突脫髓鞘和少突膠質(zhì)細(xì)胞細(xì)胞死亡引起髓鞘損傷、缺失后引起的動作電位傳播中斷是造成神經(jīng)傳導(dǎo)功能喪失的重要原因，損傷發(fā)生后細(xì)胞難以再生阻礙了神經(jīng)功能恢復(fù)。既往的研究表明，細(xì)胞移植，特別是神經(jīng)前體細(xì)胞移植誘導(dǎo)產(chǎn)生髓磷脂能促進(jìn)軸突髓鞘再生，恢復(fù)完整動作電位傳導(dǎo)和神經(jīng)功能。胚胎干細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞等多種胚胎、成體干細(xì)胞能分化為opcs，為髓鞘損失的細(xì)胞治療提供了潛在的細(xì)胞來源。但是，胚胎干細(xì)胞臨床應(yīng)用的倫理障礙和體內(nèi)移植致瘤性成為胚胎干細(xì)胞來源的opcs治療脫髓鞘疾病的最大障礙之一。出生后的成體獲取神經(jīng)干細(xì)胞極其困難，細(xì)胞量難以保證，因此成體神經(jīng)干細(xì)胞多來源于流產(chǎn)胎兒，倫理障礙更大。所以更多的研究關(guān)注于成體多能干細(xì)胞體外誘導(dǎo)、擴(kuò)增產(chǎn)生的opcs。

mscs是存在于多種組織的多能干細(xì)胞，具有三胚層分化潛能。除成體骨髓、脂肪、皮膚等組織外，圍產(chǎn)期胎兒附屬物，包括臍帶、羊膜、羊水、胎盤、臍帶血等組織中均能分離出大量的mscs。其中臍帶來源的mscs最易于規(guī)?；囵B(yǎng)和擴(kuò)增，細(xì)胞均一性好，且具有成骨、成脂肪、成軟骨、成內(nèi)皮祖細(xì)胞、成神經(jīng)干細(xì)胞等分化潛能，免疫原性低，移植后沒有明顯的不良反應(yīng)和致瘤性。目前，國內(nèi)已經(jīng)建立了多個mscs庫，從而mscs成為除造血干細(xì)胞之外，最適于用于細(xì)胞治療的種子細(xì)胞，開發(fā)mscs來源的opcs制備體系是opcs移植治療脫髓鞘疾病產(chǎn)業(yè)化途徑中最重要的工藝問題。既往的研究多集中與胚胎干細(xì)胞、誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的opcs誘導(dǎo)體系，即采用“擬胚體培養(yǎng)—神經(jīng)球—opcs誘導(dǎo)分化”三步制備體系，近幾年來，有團(tuán)隊采用這個體系制備mscs來源的opcs，但因工藝復(fù)雜，很難滿足mscs來源的opcs標(biāo)準(zhǔn)化、規(guī)?；苽洹?/p>

基于上述情況，申請人開發(fā)了一種試劑盒，用于mscs來源的opcs產(chǎn)業(yè)化制備，無需經(jīng)過神經(jīng)球培養(yǎng)階段，按常規(guī)傳代即可，工藝簡單，而且本試劑盒不含任何血清等動物源成分，滿足臨床研究對培養(yǎng)基的要求。細(xì)胞制劑用于臨床研究和臨床應(yīng)用，其細(xì)胞數(shù)量不僅需要滿足臨床劑量的要求，還需要滿足質(zhì)量控制的要求。既往的研究表明，除了胚胎干細(xì)胞能大量誘導(dǎo)分化產(chǎn)生神經(jīng)干細(xì)胞，再誘導(dǎo)分化產(chǎn)生opcs外，很難通過神經(jīng)球培養(yǎng)和誘導(dǎo)獲得數(shù)量足夠的、a2b5陽性率高的opcs。使用本試劑盒制備mscs來源的p2代opcs，除了a2b5表達(dá)率高達(dá)92.09±11.43%（附圖13），體外少突膠質(zhì)細(xì)胞誘導(dǎo)得率高達(dá)44.04%（附圖14）外，相比于p2代mscs，擴(kuò)增倍率高達(dá)133.23倍（附圖14）。以本實驗室制備p2代臍帶來源的mscs為例，一根10cm的臍帶，p2代mscs得率平均為1.34±1.10×10⁹，體外制備應(yīng)可收獲1.79×10¹¹p2代opcs，完全滿足建立opcs庫的產(chǎn)業(yè)化制備需求。因此，本試劑盒是一款使用方便、無血清等動物源成分的、高效制備a2b5+opcs的試劑盒。