專利名稱：刺五加苷分化間充質(zhì)干細(xì)胞成少突膠質(zhì)前體細(xì)胞及試劑盒的研制、用于神經(jīng)系統(tǒng)疾病的藥物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種刺五加苷處理人間充質(zhì)干細(xì)胞得到少突膠質(zhì)前體細(xì)胞 (Oligodendrocyte Progenitor cells,0PC)及其增殖的分化培養(yǎng)基，及其試劑盒研制的方法，以及包括前述方法獲得的前體細(xì)胞的用于治療創(chuàng)傷性脊髓損傷與多發(fā)性硬化癥等疾病的藥物組合物。更具體地，本發(fā)明涉及一種刺五加苷處理人間充質(zhì)干細(xì)胞得到少突膠質(zhì)前體細(xì)胞及其增殖的分化培養(yǎng)基，使用該培養(yǎng)基選擇性的獲得少突膠質(zhì)前體細(xì)胞的方法，以及包括前述方法獲得的少突膠質(zhì)前體細(xì)胞的用于治療創(chuàng)傷性脊髓損傷與多發(fā)性硬化癥等疾病的藥物組合物。
背景技術(shù)：
少突膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的一種大膠質(zhì)細(xì)胞。少突膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)唯一的髓鞘生成細(xì)胞，同時還分泌多種神經(jīng)營養(yǎng)因子維持少突膠質(zhì)細(xì)胞與其他神經(jīng)細(xì)胞之間相互的正常生理作用。主要功能是產(chǎn)生髓鞘包繞神經(jīng)軸突，維持神經(jīng)沖動沿軸突跳躍性傳導(dǎo)。髓鞘(myelin)由成熟少突膠質(zhì)細(xì)胞延伸的胞質(zhì)膜構(gòu)成。脊髓損傷造成少突膠質(zhì)細(xì)胞死亡，是軸突脫髓鞘改變的直接原因。多發(fā)性硬化癥是中樞神經(jīng)系統(tǒng)慢性炎癥性脫髓鞘病，脫髓鞘過程中少突膠質(zhì)細(xì)胞的廣泛丟失，原發(fā)性少突膠質(zhì)細(xì)胞損傷并導(dǎo)致繼發(fā)性脫髓鞘。目前用于神經(jīng)系統(tǒng)疾病治療的干細(xì)胞包括人間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells, MSC)，它們體外向神經(jīng)細(xì)胞分化，國外研究較多使用2-硫基乙醇、二甲亞砜、硫代甘油等作為誘導(dǎo)劑，但這些化學(xué)制劑均有一定毒性。其不能應(yīng)用于人體內(nèi)，使得到的細(xì)胞在制備成藥物組合物時安全性差。例如，CN200480019375. 7公開的由包括人在內(nèi)的哺乳動物的海馬、小腦、脊髓等組織中分離培養(yǎng)獲得少突膠質(zhì)祖細(xì)胞，通過睫狀神經(jīng)細(xì)胞營養(yǎng)因子和3，3’，5’ -三碘甲腺原氨酸可獲得分化的少突膠質(zhì)細(xì)胞，其倫理學(xué)問題可能限制了其的應(yīng)用。CN200710195844. 6公開了人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向少突膠質(zhì)細(xì)胞分化的方法，采用黏附分子F3/Contactin誘導(dǎo)分化，其誘導(dǎo)分化成本可能昂貴，得到少突膠質(zhì)細(xì)胞已終端分化，不具有干細(xì)胞潛能性。綜上，亟需一種操作簡單、成本低、分化純度高、增殖性質(zhì)穩(wěn)定的安全的獲得少突膠質(zhì)前體細(xì)胞的方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有的誘導(dǎo)分化人間充質(zhì)干細(xì)胞成少突膠質(zhì)細(xì)胞的方法操作繁復(fù)、成本高，分化得到的少突膠質(zhì)細(xì)胞純度低，并且在分離和擴(kuò)增過程使用的誘導(dǎo)劑中含有對人體有害的藥物，使誘導(dǎo)分化得到的少突膠質(zhì)細(xì)胞在制備成藥物組合物時安全性差的缺點(diǎn)，提供一種誘導(dǎo)分化人間充質(zhì)干細(xì)胞成少突膠質(zhì)細(xì)胞的分化培養(yǎng)基，使用該培養(yǎng)基的分離和擴(kuò)增少突膠質(zhì)細(xì)胞的方法操作簡單、成本低、分化純度高、性質(zhì)穩(wěn)定。利用經(jīng)臨床驗(yàn)證的傳統(tǒng)中藥作為誘導(dǎo)分化劑具有價廉、安全的優(yōu)點(diǎn)，可望成為今后臨床神經(jīng)細(xì)胞移植安全有效的誘導(dǎo)分化劑。已經(jīng)證實(shí)一些中藥如丹參注射液、天麻、黃芩苷等，具有在體外誘導(dǎo)MSC向神經(jīng)樣細(xì)胞分化的作用，主要為神經(jīng)元樣細(xì)胞。本發(fā)明提供了一種刺五加苷處理人間充質(zhì)干細(xì)胞得到少突膠質(zhì)前體細(xì)胞及其增殖的分化培養(yǎng)基，所述分化培養(yǎng)基包括液體基礎(chǔ)培養(yǎng)基，其中，以所述液體基礎(chǔ)培養(yǎng)基的體積為基準(zhǔn)，所述分化培養(yǎng)基還含有l(wèi)-500ug/mL的刺五加苷、1-20體積％的胎牛血清、 5-300ng/mL人表皮生長因子(EGF)和5_300ng/mL堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)。本發(fā)明還提供了一種刺五加苷處理人間充質(zhì)干細(xì)胞得到少突膠質(zhì)前體細(xì)胞及其增殖的試劑盒研制的方法，其中，所述的試劑盒包括1)間充質(zhì)干細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基；2)刺五加苷；3)細(xì)胞因子(人表皮生長因子和堿性成纖維細(xì)胞生長因子)；4)消化細(xì)胞的酶以及；5)使用說明書；本發(fā)明還提供了一種用于治療創(chuàng)傷性脊髓損傷與多發(fā)性硬化癥等疾病的藥物組合物，其中，所述藥物組合物包括本發(fā)明所述從人間充質(zhì)干細(xì)胞分化方法獲得的少突膠質(zhì)前體細(xì)胞，以及和藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。使用本發(fā)明的分化培養(yǎng)基的本發(fā)明的從人間充質(zhì)干細(xì)胞分化獲得的少突膠質(zhì)前體細(xì)胞及其增殖的方法，能夠高效分化和大量獲得少突膠質(zhì)前體細(xì)胞。由于本發(fā)明的分化培養(yǎng)基選擇性強(qiáng)，獲得少突膠質(zhì)前體細(xì)胞純度即可達(dá)到70%以上。因此，本發(fā)明的方法無需使用營養(yǎng)因子或化學(xué)誘導(dǎo)劑等高成本安全性差的藥物就能達(dá)到更高純度的分離效果，避免了繁復(fù)的操作，因而降低了成本，并且由該方法得到的少突膠質(zhì)前體細(xì)胞的安全性大大提高，可以制備成本發(fā)明用于治療創(chuàng)傷性脊髓損傷與多發(fā)性硬化癥等疾病的藥物組合物。本發(fā)明用于治療創(chuàng)傷性脊髓損傷與多發(fā)性硬化癥等疾病的藥物組合物不僅安全性好，而且能在體內(nèi)修復(fù)創(chuàng)傷性脊髓損傷與多發(fā)性硬化癥等疾病中廣泛丟失或損傷的少突膠質(zhì)細(xì)胞，并有軸突髓鞘質(zhì)的形成。


圖1為實(shí)施例1骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化成少突膠質(zhì)細(xì)胞的生長形態(tài)照片(光學(xué)顯微鏡放大倍數(shù)40倍)；圖2為實(shí)施例1和3的少突膠質(zhì)前體細(xì)胞表達(dá)蛋白的熒光免疫照片(熒光顯微鏡放大倍數(shù)40倍)，其中，圖2A為鼠抗人04 IgM標(biāo)記后二抗顯色熒光免疫照片，圖2B為鼠抗人A2B5 IgM標(biāo)記后二抗顯色熒光免疫照片，圖2C為圖2A和圖2B疊加得到的熒光免疫照片；圖3為使用實(shí)施例2和3少突膠質(zhì)前體細(xì)胞移植治療創(chuàng)傷性脊髓損傷大鼠模型， 移植后隨著時間變化進(jìn)行脊髓損傷BBB (Basso，Beatlie, Bresnahan)功能評分曲線；圖4為使用實(shí)施例2和3少突膠質(zhì)前體細(xì)胞藥物組合物對創(chuàng)傷性脊髓損傷大鼠模型治療前后效果對比的顯微結(jié)構(gòu)照片(光學(xué)顯微鏡放大倍數(shù)400倍)。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明提供了一種刺五加苷處理人間充質(zhì)干細(xì)胞得到少突膠質(zhì)前體細(xì)胞及其增殖的分化培養(yǎng)基，所述分化培養(yǎng)基包括液體基礎(chǔ)培養(yǎng)基，其中，以所述液體基礎(chǔ)培養(yǎng)基的體積為基準(zhǔn)，所述分化培養(yǎng)基還含有l(wèi)-500ug/mL的刺五加苷、1-20體積％的胎牛血清、 5-300ng/mL人表皮生長因子(EGF)和5_300ng/mL堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)。優(yōu)選地，以所述液體基礎(chǔ)培養(yǎng)基的體積為基準(zhǔn)，所述分化培養(yǎng)基還含有5_300ug/ mL的刺五加苷、5-15體積％的胎牛血清、10-200ng/mL人表皮生長因子(EGF)和10-200ng/ mL堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)。進(jìn)一步優(yōu)選地，以所述液體基礎(chǔ)培養(yǎng)基的體積為基準(zhǔn)，所述分化培養(yǎng)基還含有10-200ug/mL的刺五加苷、5_10體積％的胎牛血清、IO-IOOng/ mL人表皮生長因子(EGF)和lO-lOOng/mL堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)。本發(fā)明的人間充質(zhì)于細(xì)胞分化為少突膠質(zhì)前體細(xì)胞及其增殖的分化培養(yǎng)基可以包括本領(lǐng)域常用的各種基本培養(yǎng)基，例如，選自BME細(xì)胞培養(yǎng)基、杜爾貝可改良伊格爾 (Dulbecco' s modified Eagle' s medium, DMEM)細(xì)胞培養(yǎng)基、DMEM/F12 細(xì)胞培養(yǎng)基、 Fischer' s細(xì)胞培養(yǎng)基、IMDM細(xì)胞培養(yǎng)基、199細(xì)胞培養(yǎng)基、MEM細(xì)胞培養(yǎng)基、FlO細(xì)胞培養(yǎng)基、F12細(xì)胞培養(yǎng)基和1640細(xì)胞培養(yǎng)基中的一種或幾種。優(yōu)選包括的所述基本培養(yǎng)基為 MEM細(xì)胞培養(yǎng)基。所述基本培養(yǎng)基的成分為本領(lǐng)域公知，上述列舉的基本培養(yǎng)基名稱為它們的商品名，商業(yè)上可供。本發(fā)明提供的人間充質(zhì)干細(xì)胞可以適用于各種含有間充質(zhì)干細(xì)胞的離體組織，例如骨髓、臍帶血、臍帶、流產(chǎn)胚胎(例如流產(chǎn)的12-14周的胚胎)和流產(chǎn)胎兒等。但考慮到可能有悖于倫理道德、社會風(fēng)俗習(xí)慣甚至法律規(guī)定，因此一般不利用流產(chǎn)胚胎和流產(chǎn)胎兒， 并且胚胎和流產(chǎn)胎兒的來源有限。優(yōu)選所述離體組織選自骨髓、臍帶血和臍帶中的一種或幾種。其中，骨髓和臍帶血可以來自公共臍帶血庫(例如，北京臍帶血庫等)和骨髓庫(例如，中華骨髓庫等)。從來源豐富程度考慮，優(yōu)選所述離體組織是臍帶，其一般作為醫(yī)療廢棄物被處理掉。此外，創(chuàng)傷性脊髓損傷與多發(fā)性硬化癥患者的骨髓可以作為自體間充質(zhì)干細(xì)胞的來源，可以避免免疫排斥反應(yīng)。本發(fā)明所述的用于分化為少突膠質(zhì)前體細(xì)胞的人間充質(zhì)干細(xì)胞出于安全的保守考慮，優(yōu)選使用傳代代數(shù)為第1代到第10代的間充質(zhì)干細(xì)胞，其中，傳代代數(shù)第1代到第4 代的間充質(zhì)干細(xì)胞可以作為種子間充質(zhì)干細(xì)胞使用。出于間充質(zhì)干細(xì)胞數(shù)量和穩(wěn)定性的考慮，優(yōu)選傳代代數(shù)為第4代的間充質(zhì)干細(xì)胞作為種子間充質(zhì)干細(xì)胞使用。所述種子干細(xì)胞可以作為大規(guī)模培養(yǎng)的起始細(xì)胞，也可以采用本領(lǐng)域常規(guī)的冷凍保存細(xì)胞的技術(shù)將其作為細(xì)胞株長期冷凍保存起來，以備復(fù)蘇使用。傳代代數(shù)第5代到第10代間充質(zhì)干細(xì)胞可以作為中間品間充質(zhì)干細(xì)胞使用。所述中間品干細(xì)胞是指大規(guī)模培養(yǎng)后得到的間充質(zhì)干細(xì)胞，可以用作制備本發(fā)明分化為少突膠質(zhì)前體細(xì)胞或藥物組合物的原料。此外，為了便于運(yùn)輸和保存，所述少突膠質(zhì)前體細(xì)胞也可以進(jìn)行冷凍保存，在臨近使用前復(fù)蘇即可。本發(fā)明還提供了一種用于治療創(chuàng)傷性脊髓損傷與多發(fā)性硬化癥等疾病的藥物組合物，其中，所述藥物組合物包括本發(fā)明所述從人間充值干細(xì)胞分化方法獲得的少突膠質(zhì)前體細(xì)胞，以及和藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。所述藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑指無毒固態(tài)、半固態(tài)或液態(tài)填充劑、稀釋劑、包囊材料或其他制劑輔料，例如，包括但不限于鹽水、緩沖鹽液、水、甘油、乙醇及其混合物。所述藥物組合物適于靜脈內(nèi)、腰穿、椎管、介入、肌內(nèi)、皮下、皮內(nèi)注射和輸注等給藥。適于給藥的藥物組合物包括無菌水浴液或非水溶液、分散液、懸浮液或乳液，以及用于在臨近使用前在無菌可注射溶液或分散液中配制的粉末。適宜的水性或非水性載體、 稀釋劑、溶劑或賦形劑包括水、乙醇、甘泊、丙二醇、聚乙二醇、竣甲基纖維素、植物油和可注射的有機(jī)酶如泊酸乙醋。這些組合物還可以含有防腐劑、潤濕劑、乳化劑和分散劑等佐劑。加入等滲劑如糖類、氯化鈉等可能是有利的。優(yōu)選所述藥物組合物為注射液，所述注射液包括藥學(xué)上可接受的載體，以及以所述注射液體積為基準(zhǔn)，1 X IO5至1 X IO8個/毫升的本發(fā)明所述的方法獲得的少突膠質(zhì)前體細(xì)胞。優(yōu)選所述注射液包括以所述注射液體積為基準(zhǔn)，5X105至IXlO7個/毫升的本發(fā)明所述的方法獲得的少突膠質(zhì)前體細(xì)胞。優(yōu)選所述藥學(xué)上可接受的載體為生理鹽水。這里所述的生理鹽水，是指生理學(xué)實(shí)驗(yàn)或臨床上常用的滲透壓與動物或人體血漿的滲透壓相等的溶液。優(yōu)選地，用于哺乳類動物和人體時是0.85-0. 9%的氯化鈉溶液。更優(yōu)選0.9%的氯化鈉溶液。本發(fā)明的發(fā)明人意外地發(fā)現(xiàn)，少突膠質(zhì)前體細(xì)胞可以對少突膠質(zhì)細(xì)胞丟失或損傷進(jìn)行修復(fù)，并且能夠有效作用于軸突髓鞘質(zhì)的形成(參見實(shí)施例5)。因此本發(fā)明的藥物組合物用于治療創(chuàng)傷性脊髓損傷與多發(fā)性硬化癥等疾病。使用由本發(fā)明的方法獲得的少突膠質(zhì)前體細(xì)胞，處于本發(fā)明的分化培養(yǎng)基中，因此在制備用于治療創(chuàng)傷性脊髓損傷與多發(fā)性硬化癥等疾病的藥物組合物之前，可以通過除去本發(fā)明的分化培養(yǎng)基，用生理鹽水洗滌并重懸所述少突膠質(zhì)前體細(xì)胞。所述生理鹽水的洗滌次數(shù)可以通過測定洗出液中殘留的培養(yǎng)基組分來決定。將本發(fā)明的用于治療創(chuàng)傷性脊髓損傷與多發(fā)性硬化癥等疾病的藥物組合物在注射給患者時殘留的培養(yǎng)基組分不會引起患者不適即可。所述組合物包括1 X IO5到1 X IO8個/mL本發(fā)明的新的少突膠質(zhì)前體細(xì)胞； 優(yōu)選為5X105到IXlO7個/mL。本發(fā)明還提供了本發(fā)明的方法獲得的少突膠質(zhì)前體細(xì)胞， 在制備治療創(chuàng)傷性脊髓損傷與多發(fā)性硬化癥等疾病藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明還提供了一種治療創(chuàng)傷性脊髓損傷與多發(fā)性硬化癥等疾病的方法，其包括給患者施用本發(fā)明用于治療創(chuàng)傷性脊髓損傷與多發(fā)性硬化癥等疾病的藥物組合物。施用本發(fā)明用于治療創(chuàng)傷性脊髓損傷與多發(fā)性硬化癥等疾病的藥物組合物的方式可以選自介入注射、靜脈注射、腰穿、皮下注射和皮內(nèi)注射中的一種或幾種；更優(yōu)選所述施用的方式為腰穿。本發(fā)明所述用于治療多發(fā)性硬化癥與創(chuàng)傷性脊髓損傷等疾病的藥物組合物優(yōu)選含有1 X IO5到1 X IO8細(xì)胞/mL的少突膠質(zhì)前體細(xì)胞，其每次注射給藥量為 0. lmL-5mL/個體；更優(yōu)選地，本發(fā)明所述用于治療創(chuàng)傷性脊髓損傷與多發(fā)性硬化癥等疾病的藥物組合物包括IXlO5到5 X107f/mL的少突膠質(zhì)前體細(xì)胞，其每次注射給藥量為 0. lmL-2mL/ 個體。以上個給出了本發(fā)明所述用于治療創(chuàng)傷性脊髓損傷與多發(fā)性硬化癥等疾病的藥物組合物每一次注射的劑量，一個療程三次注射，每兩次注射間隔一周。本發(fā)明所述用于治療多發(fā)性硬化癥與創(chuàng)傷性脊髓損傷等疾病的藥物組合物一般在注射完第二次后的第三天到第七天起效。所述有效的標(biāo)準(zhǔn)是脊髓損傷BBB功能評分明顯提高，可以促使有髓鞘的軸突生成。一個療程結(jié)束后，可以馬上連續(xù)進(jìn)行第二個療程的治療，也可以間隔一到三個月后進(jìn)行第二個療程的治療以鞏固療效，一般治療兩個至四個療程可以消除脊髓損傷病癥；間隔時間為六個月或一年，患者如認(rèn)為有必要，還可進(jìn)行鞏固療效的治療。優(yōu)選使用本發(fā)明的方法來分離創(chuàng)傷性脊髓損傷與多發(fā)性硬化癥等疾病患者的離體組織(例如骨髓)，所得少突膠質(zhì)前體細(xì)胞制備成本發(fā)明的藥物組合物給藥創(chuàng)傷性脊髓損傷與多發(fā)性硬化癥等疾病患者自體，這樣可以最大限度地避免免疫排斥反應(yīng)造成的副作用。以下，對本發(fā)明的具體實(shí)施例進(jìn)行說明，但本發(fā)明的技術(shù)范圍不限于這些示例。實(shí)施例1 本實(shí)施例用于說明使用本發(fā)明的分化培養(yǎng)基從人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化為少突膠質(zhì)前體細(xì)胞的方法。人骨髓來自31歲捐獻(xiàn)者的，與該捐獻(xiàn)者及醫(yī)院方簽署了知情同意書。將人骨髓用IXPBS等體積稀釋，得到人骨髓稀釋液，以人骨髓稀釋液1.077千克/立方米的聚蔗糖-泛影葡胺(Ficoll-Hypaque)的體積比為2 1加入到50ml離心管中，在1500rpm、25度下進(jìn)行密度梯度離心10分鐘，離心后收集中間層細(xì)胞，并使用IXPBS IOOOrpm離心10分鐘，洗滌所得細(xì)胞三次，加入完全培養(yǎng)基，含10%胎牛血清(美國Hyclone公司)的α-MEM 培養(yǎng)基(美國Gibco公司)。細(xì)胞計(jì)數(shù)后，按3 X IO5細(xì)胞/cm2的密度接種于75cm2的培養(yǎng)瓶中，每瓶再加入上述培養(yǎng)基使終體積為10ml。在37°C、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)第三天后，半量換液。換液時將舊培養(yǎng)基緩慢吸出5ml，加入新鮮的間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基，每瓶加入5ml， 繼續(xù)在37°C、5% CO2培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞貼壁生長達(dá)到培養(yǎng)瓶底面的85%時，將培養(yǎng)基傾去，并將細(xì)胞通過用胰酶消化，SOOrpm離心5分鐘收集后在含10%胎牛血清的α -MEM培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)。同樣當(dāng)細(xì)胞貼壁生長達(dá)到培養(yǎng)瓶底面的85%時，進(jìn)行消化傳代培養(yǎng)。1瓶原代培養(yǎng)物可以傳代三瓶，每瓶起始培養(yǎng)的細(xì)胞密度為2 X IO5細(xì)胞/mL。三瓶75cm2培養(yǎng)瓶在37°C、 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6天后，得到貼壁并且生長達(dá)到培養(yǎng)瓶底面的90%的細(xì)胞。獲得的間充質(zhì)干細(xì)胞取1瓶進(jìn)行流式細(xì)胞檢測，經(jīng)胰酶消化，離心后細(xì)胞沉淀用ImL IXPBS重懸，計(jì)數(shù)。取3份20 μ L (1 X IO6個)上述的傳代得到細(xì)胞懸液分別添加到有20 μ L FITC-⑶34 (BD 公司)禾口 20 μ L PE-CD90 (BD 公司)；20 μ L FITC-CD45 (BD 公司)禾口 20 μ L PE-CD44 (BD 公司)；20μ LFITC-HLA-DR(BD公司)禾口 20 μ L PE_CD105(BD公司)的離心管中。置于4°C冰箱染色30分鐘，然后用ImL的IX磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌三次，最后用0. 5mL的IXPBS 重懸洗滌后的細(xì)胞，所得洗滌后的細(xì)胞用FACSCalibur基本型流式細(xì)胞儀檢測。結(jié)果顯示，CD44 > 95. 56%,CD90 > 98. 60%, CD105 > 91. 3%,CD34 < 3. 45%, CD45 < 2. 10%, HLA-DR < 1. 33%，符合間充質(zhì)干細(xì)胞表型特征。取上述培養(yǎng)好的間充質(zhì)干細(xì)胞，傾去培養(yǎng)基，每瓶加入50ug/mL刺五加苷、10%胎牛血清、20ng/mL人表皮生長因子(EGF)和20ng/mL堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)(美國 R&D公司)的α -MEM培養(yǎng)基IOml進(jìn)行分化培養(yǎng)(分化培養(yǎng)基)，48小時后半量換液，換液時將舊培養(yǎng)基緩慢吸出5ml，加入新鮮的分化培養(yǎng)基，每瓶加入5ml，繼續(xù)在37°C、5 % CO2培養(yǎng)。第五天間充質(zhì)干細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化，并進(jìn)行半量換液，繼續(xù)培養(yǎng)到第7天間充質(zhì)基本分化為少突膠質(zhì)前體細(xì)胞。取其中一瓶細(xì)胞，棄去培養(yǎng)基，按前述條件經(jīng)胰酶消化，SOOrpm離心5分鐘后，收集細(xì)胞沉淀用ImL 1XPBS(PH 7. 4的磷酸緩沖液)重懸，計(jì)數(shù)。取6份50yL(每份含IX IO6個細(xì)胞)上述的傳代得到細(xì)胞懸液分別接種在六孔培養(yǎng)板的六個孔中貼壁生長4小時，吸出培養(yǎng)基后用1 XPBS洗滌一次，加入2 %甲醛固定3分鐘，用0. 5 %曲通 100 (Triton-100) IXPBS洗滌三次，再向六孔板的六個孔中分別加入1 XPBS以及用1 XPBS 稀釋的鼠抗人04IgM、1 X PBS稀釋的鼠抗人A2B5IgM和1 X PBS稀釋的鼠抗人髓鞘堿性蛋白 IgG。在4度冰箱過夜進(jìn)行染色/結(jié)合，之后用0.5% Triton-1001 XPBS洗滌3次，向鼠抗人髓鞘堿性蛋白IgG的孔中加入用IXPBS稀釋的二抗IgG-FITC，并向鼠抗人04IgM和鼠抗人A2B5IgM的孔中分別加入用IXPBS稀釋的二抗IgM-PE和二抗IgM-FITC，在37度下孵育lh，孵育后用IXPBS輕輕洗滌3次，洗滌完之后用90%甘油封閉。熒光顯微鏡下觀測， 結(jié)果顯示，70%以上的細(xì)胞呈現(xiàn)A2B5和04為陽性，髓鞘堿性蛋白為陰性，符合少突膠質(zhì)前體細(xì)胞的特異性特征，因而證明使用本發(fā)明的分化培養(yǎng)基從人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞能分化出高純度的少突膠質(zhì)前體細(xì)胞。實(shí)施例2 本實(shí)施例用于說明使用本發(fā)明的分化培養(yǎng)基從臍帶來源間充質(zhì)干細(xì)胞分化為少突膠質(zhì)前體細(xì)胞的方法。臍帶來自沈歲健康孕婦分娩后采集的臍帶。與該孕婦及醫(yī)院方簽署了知情同意書，在其分娩后收集其臍帶。將離體組織臍帶用含2%雙抗(青霉素和鏈霉素)的IXPBS洗滌三次，后用眼科剪剪碎成為約Imm3的小塊。所得剪碎的組織小塊用0. 25%胰酶溶液以1克0. 5mL的重量體積比消化5分鐘后，加入是胰酶溶液體積五分之一的胎牛血清終止消化，以IOOOrpm離心5分鐘收集消化好的組織小塊，傾去胰酶溶液上清，然后所得剪碎的組織小塊用含雙抗的α -MEM培養(yǎng)基洗滌三次，以IOOOrpm離心5分鐘收集洗滌好的組織小塊，傾去洗滌溶液上清。收集所述組織小塊，向其中加入含有10%胎牛血清的α-MEM培養(yǎng)基，沒過組織小塊就行，放置培養(yǎng)皿中，在37°C、5% CO2培養(yǎng)。第三天進(jìn)行換液，緩緩吸取培養(yǎng)基，后加入新鮮培養(yǎng)基，并在371、5%0)2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每隔三天換一次液，直至爬出間充質(zhì)干細(xì)胞長滿培養(yǎng)皿，即可使用胰酶消化進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)，將培養(yǎng)基傾去，并將細(xì)胞通過用胰酶消化， SOOrpm離心5分鐘收集后在含10%胎牛血清的α-MEM培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)。同樣當(dāng)細(xì)胞貼壁生長達(dá)到培養(yǎng)瓶底面的85%時，進(jìn)行消化傳代培養(yǎng)。1瓶原代培養(yǎng)物可以傳代三瓶，每瓶起始培養(yǎng)的細(xì)胞密度為2Χ IO5細(xì)胞/mL。三瓶75cm2培養(yǎng)瓶在37°C、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 6天后，得到貼壁并且生長達(dá)到培養(yǎng)瓶底面的90%的細(xì)胞。上述獲得的間充質(zhì)干細(xì)胞能繼續(xù)擴(kuò)增到第10代，該間充質(zhì)干細(xì)胞仍具有相同的性狀，取1瓶培養(yǎng)到第10代間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞檢測，經(jīng)胰酶消化，離心后細(xì)胞沉淀用ImLlXPBS重懸，計(jì)數(shù)。取3份20 μ L(1 X IO6個)上述的傳代得到細(xì)胞懸液分別添加到有 20 μ L FITC-CD34 (BD 公司)禾口 20 μ LPE-CD90 (BD 公司)；20 μ L FITC-CD45 (BD 公司)和 20 μ L PE-CD44 (BD 公司)；20 μ L FITC-HLA-DR (BD 公司)禾口 20 μ L PE-CD105 (BD 公司)的離心管中。置于4°C冰箱染色30分鐘，然后用ImL的IX磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌三次，最后用0.5mL的IXPBS重懸洗滌后的細(xì)胞，所得洗滌后的細(xì)胞用FACSCalibur基本型流式細(xì)胞儀檢測。結(jié)果顯示，CD44 > 95. 56%,CD90 > 98. 60%,CD105 > 91. 3%,CD34 < 3. 45%, ⑶45 < 2. 10%, HLA-DR < 1. 33%，符合間充質(zhì)干細(xì)胞表型特征。
取上述培養(yǎng)好的間充質(zhì)干細(xì)胞，傾去培養(yǎng)基，每瓶加入50ug/mL刺五加苷、10%胎牛血清、20ng/mL EGF和20ng/mL bFGF的α -MEM培養(yǎng)基IOml進(jìn)行分化培養(yǎng)，48小時后半量換液，換液時將舊培養(yǎng)基緩慢吸出5ml，加入新鮮的分化培養(yǎng)基，每瓶加入5ml，繼續(xù)在 37°C、5%C02培養(yǎng)。第五天間充質(zhì)干細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化，并進(jìn)行半量換液，繼續(xù)培養(yǎng)到第7 天間充質(zhì)基本分化為少突膠質(zhì)前體細(xì)胞。取其中一瓶細(xì)胞，棄去培養(yǎng)基，按前述條件經(jīng)胰酶消化，SOOrpm離心5分鐘后， 收集細(xì)胞沉淀用ImL 1XPBS(PH 7. 4的磷酸緩沖液)重懸，計(jì)數(shù)。取6份50yL(每份含IX IO6個細(xì)胞)上述的傳代得到細(xì)胞懸液分別接種在六孔培養(yǎng)板的六個孔中貼壁生長4小時，吸出培養(yǎng)基后用1 XPBS洗滌一次，加入2 %甲醛固定3分鐘，用0. 5 %曲通 100 (Triton-100) IXPBS洗滌三次，再向六孔板的六個孔中分別加入IXPBS以及用IXPBS 稀釋的鼠抗人04IgM、1 X PBS稀釋的鼠抗人A2B5IgM和1 X PBS稀釋的鼠抗人髓鞘堿性蛋白 IgG。在4度冰箱過夜進(jìn)行染色/結(jié)合，之后用0. 5% Triton-IOOlXPBS洗滌3次，向鼠抗人髓鞘堿性蛋白IgG的孔中加入用IXPBS稀釋的二抗IgG-FITC，并向鼠抗人04IgM和鼠抗人A2B5IgM的孔中分別加入用IXPBS稀釋的二抗IgM-PE和二抗IgM-FITC，在37度下孵育lh，孵育后用IXPBS輕輕洗滌3次，洗滌完之后用90%甘油封閉。熒光顯微鏡下觀測， 結(jié)果顯示，70%以上的細(xì)胞呈現(xiàn)A2B5和04為陽性，髓鞘堿性蛋白為陰性，符合少突膠質(zhì)前體細(xì)胞的特異性特征，因而證明使用本發(fā)明的分化培養(yǎng)基從臍帶來源的間充質(zhì)干細(xì)胞能分化出高純度的少突膠質(zhì)前體細(xì)胞。實(shí)施例3本實(shí)施例用于說明使用本發(fā)明的分化培養(yǎng)基對于少突膠質(zhì)前體細(xì)胞體外傳代擴(kuò)增培養(yǎng)的方法，以及所得少突膠質(zhì)前體細(xì)胞冷凍保存的方法。取實(shí)施例1和2中得到的少突膠質(zhì)前體細(xì)胞，當(dāng)其貼壁生長達(dá)到培養(yǎng)瓶底面的達(dá)到90%時，將細(xì)胞通過用胰酶消化，800rpm離心5分鐘收集后在含50ug/mL刺五加苷、10% 胎牛血清、20ng/mL EGF和20ng/mL bFGF的α-MEM培養(yǎng)基培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)。同樣少突膠質(zhì)前體細(xì)胞貼壁生長達(dá)到培養(yǎng)瓶底面的達(dá)到90%時，重復(fù)上述傳代培養(yǎng)過程。當(dāng)少突膠質(zhì)前體細(xì)胞擴(kuò)增到培養(yǎng)代數(shù)第5代時，將1瓶少突膠質(zhì)前體細(xì)胞用胰酶消化，SOOrpm離心 5分鐘收集得到少突膠質(zhì)前體細(xì)胞沉淀，用胎牛血清重懸該少突膠質(zhì)前體細(xì)胞沉淀，顯微鏡下計(jì)數(shù)使少突膠質(zhì)前體細(xì)胞懸液的濃度達(dá)到5X 106/ml。應(yīng)用二甲基亞砜(DMSO，Sigma) 和胎牛血清先配制成含20% DMSO的胎牛血清，后加入上述重懸液中使得DMSO濃度為10% 并調(diào)整少突膠質(zhì)前體細(xì)胞濃度為5X 106/ml。將每Iml所得少突膠質(zhì)前體細(xì)胞懸液分裝到 2ml凍存管中，放置程序降溫盒(美國Nalgene公司)中按照使用說明書，先在_80度冰箱保存2天后，轉(zhuǎn)至液氮中凍存。取1瓶傳代代數(shù)為第4代的少突膠質(zhì)前體細(xì)胞，經(jīng)胰酶消化，SOOrpm離心5分鐘后細(xì)胞沉淀用ImL IXPBS重懸，計(jì)數(shù)。取6份50 μ L(每份含1 X IO6個細(xì)胞)上述的傳代得到細(xì)胞懸液分別接種在六孔培養(yǎng)板的六個孔中貼壁生長4小時，吸出培養(yǎng)基后用IXPBS洗滌一次，加入2%甲醛固定3分鐘，用0. 5%曲通100 CTriton-100) 1 XPBS洗滌三次，再向六孔板的六個孔中分別加入IXPBS以及用IXPBS稀釋的鼠抗人04IgM、lXPBS稀釋的鼠抗人A2B5IgM和1 X PBS稀釋的鼠抗人髓鞘堿性蛋白IgG。在4度冰箱過夜進(jìn)行染色/結(jié)合，之后用0. 5% Triton-1001 XPBS洗滌3次，向鼠抗人髓鞘堿性蛋白IgG的孔中加入用IXPBS稀釋的二抗IgG-FITC，并向鼠抗人04IgM和鼠抗人A2B5IgM的孔中分別加入用1 XPBS稀釋的二抗IgM-PE和二抗IgM-FITC，在37度下孵育lh，孵育后用IXPBS輕輕洗滌3次，洗滌完之后用90%甘油封閉。熒光顯微鏡下觀測，結(jié)果顯示，70%以上的細(xì)胞呈現(xiàn)A2B5和04 為陽性，髓鞘堿性蛋白為陰性，符合少突膠質(zhì)前體細(xì)胞的特異性特征，因而證明使用本發(fā)明的分化培養(yǎng)基傳代培養(yǎng)的少突膠質(zhì)前體細(xì)胞未出現(xiàn)分化變性的現(xiàn)象，保持了少突膠質(zhì)前體細(xì)胞的細(xì)胞性狀。此外，為了更清楚地顯示本發(fā)明的效果，申請人還將增殖到第4代的少突膠質(zhì)前體細(xì)胞按照實(shí)施例1和3的方法在六孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)，圖2顯示了該少突膠質(zhì)前體細(xì)胞表達(dá)蛋白的熒光免疫照片，其中，圖2A為鼠抗人04IgM標(biāo)記后二抗顯色熒光免疫照片，圖2B 為鼠抗人A2B5IgM標(biāo)記后二抗顯色熒光免疫照片，圖2C為圖2A和圖2B疊加得到的熒光免疫照片。實(shí)施例4 本實(shí)施例說明本發(fā)明方法獲得的試劑盒制備。人間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化少突膠質(zhì)前體細(xì)胞及其增殖的分化培養(yǎng)基試劑盒，其組份配制如下1)間充質(zhì)干細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基，為α-MEM、DMEM/F12(1 1)或者DMEM培養(yǎng)基， 500ml，使用500ml無菌試劑瓶包裝；2)刺五加苷，25mg,使用2ml無菌密封西林瓶或試劑管包裝；3)細(xì)胞因子(人表皮生長因子和堿性成纖維細(xì)胞生長因子)；人表皮生長因子和堿性成纖維細(xì)胞生長因子都為10ug，使用2ml無菌密封西林瓶或試劑管包裝；4)消化細(xì)胞的酶以及；胰酶為IOOml，使用IOOml無菌試劑瓶包裝；5)使用說明書；詳細(xì)介紹間充質(zhì)干細(xì)胞分化為少突膠質(zhì)前體細(xì)胞及其增殖的使用步驟和注意事項(xiàng)。實(shí)施例5本實(shí)施例說明含有本發(fā)明方法獲得的少突膠質(zhì)前體細(xì)胞的用于治療創(chuàng)傷性脊髓損傷的藥物組合物在創(chuàng)傷性脊髓損傷動物模型中應(yīng)用。取實(shí)施例3所得的臍帶來源間充質(zhì)干細(xì)胞分化并傳代5代的少突膠質(zhì)前體細(xì)胞培養(yǎng)物含有2X IO6少突膠質(zhì)前體細(xì)胞。SOOrpm下離心5min后收集間充質(zhì)干細(xì)胞的細(xì)胞沉淀，用0. 9%的氯化鈉溶液洗滌3次，然后用該0. 9%的氯化鈉溶液重懸至2X IO6個/mL的濃度，于4°C下保存?zhèn)溆?。按照與實(shí)施例1和3同樣的方法傳代擴(kuò)增制備臍帶血來源間充質(zhì)干細(xì)胞分化的2X IO6個/mL濃度的少突膠質(zhì)前體細(xì)胞注射液。將購自北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部的脊髓損傷大鼠模型，隨機(jī)分為A、B和C三組組，每組10 只，A組為臍帶來源的間充質(zhì)干細(xì)胞分化并傳代5代的的少突膠質(zhì)前體細(xì)胞注射液治療組， B組為臍帶血來源的間充質(zhì)干細(xì)胞分化的少突膠質(zhì)前體細(xì)胞注射液，C組為同體積0. 9%的氯化鈉溶液空白組。A和B兩組在第O天鼠模型脊髓損傷部位注射2X106個/mL，即ImL少突膠質(zhì)前體細(xì)胞注射液，第7天和第14天以相同劑量再次注射；C組于相同時間點(diǎn)在脊髓損傷部位注射0.5mL生理鹽水。分別于最后一次注射后的第1、2、4、8、12、16和第M周監(jiān)測鼠模型髓鞘形成，并進(jìn)行移植前后BBB功能評分，結(jié)果如下表2所示。表 1
脊隨損傷大鼠模型OPC移植后BBB評分實(shí)驗(yàn)評分結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種人間充質(zhì)干細(xì)胞分化成少突膠質(zhì)前體細(xì)胞及其增殖的分化培養(yǎng)基，所述分化培養(yǎng)基包括液體基礎(chǔ)培養(yǎng)基，其特征在于，以所述液體基礎(chǔ)培養(yǎng)基的體積為基準(zhǔn)，所述分化培養(yǎng)基還含有l(wèi)-500ug/mL的刺五加苷、1-20體積％的胎牛血清、5-300ng/mL人表皮生長因子 (EGF)和5-300ng/mL堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分化培養(yǎng)基，其中，以所述液體基礎(chǔ)培養(yǎng)基的體積為基準(zhǔn)，所述分化培養(yǎng)基還含有5-300ug/mL的刺五加苷、5_15體積％的胎牛血清、10-200ng/mL人表皮生長因子(EGF)和10-200ng/mL堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的分化培養(yǎng)基，其中，以所述液體基礎(chǔ)培養(yǎng)基的體積為基準(zhǔn)，所述分化培養(yǎng)基還含有10-200ug/mL的刺五加苷、5_10體積％的胎牛血清、lO-lOOng/mL人表皮生長因子(EGF)和lO-lOOng/mL堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分化培養(yǎng)基，其中，所述液體基礎(chǔ)培養(yǎng)基選自BME細(xì)胞培養(yǎng)基、杜爾貝可改良伊格爾細(xì)胞培養(yǎng)基、DMEM/F12細(xì)胞培養(yǎng)基、Fischer' s細(xì)胞培養(yǎng)基、IMDM 細(xì)胞培養(yǎng)基、199細(xì)胞培養(yǎng)基、MEM細(xì)胞培養(yǎng)基、FlO細(xì)胞培養(yǎng)基、F12細(xì)胞培養(yǎng)基和1640細(xì)胞培養(yǎng)基中的一種或幾種。
5.一種人間充干細(xì)胞分化獲得的少突膠質(zhì)前體細(xì)胞及其增殖的方法，其特征在于，所述方法使用權(quán)利要求1-5中任意一項(xiàng)所述的分化培養(yǎng)基培養(yǎng)所述人間充質(zhì)干細(xì)胞。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中，所述間充質(zhì)干細(xì)胞來自人骨髓、臍帶血和臍帶中的一種或幾種。
7.由權(quán)利要求1-6所述的方法得到的少突膠質(zhì)前體細(xì)胞。
8.一種制備權(quán)利要求7所述的刺五加苷處理試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括1)間充質(zhì)干細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基；2)刺五加苷；3)細(xì)胞因子(人表皮生長因子和堿性成纖維細(xì)胞生長因子)；4)消化細(xì)胞的酶以及；5)使用說明書。
9.一種用于治療創(chuàng)傷性脊髓損傷與多發(fā)性硬化癥等疾病的藥物組合物，其特征在于， 所述藥物組合物包括權(quán)利要求7-8中任意一項(xiàng)所述的方法獲得的少突膠質(zhì)前體細(xì)胞，以及和藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的藥物組合物，其中，所述藥物組合物為注射液，所述注射液包括藥學(xué)上可接受的載體，以及以所述注射液體積為基準(zhǔn)，1 X IO5至1 X IO8個/毫升的權(quán)利要求7-8中任意一項(xiàng)所述的方法獲得的少突膠質(zhì)前體細(xì)胞。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的藥物組合物，其中，所述注射液包括以所述注射液體積為基準(zhǔn)，5X IO5至5X IO7個/毫升的權(quán)利要求7-8中任意一項(xiàng)所述的方法獲得的少突膠質(zhì)前體細(xì)胞。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的藥物組合物，其中，所述藥學(xué)上可接受的載體為生理鹽水。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種刺五加苷處理人間充質(zhì)干細(xì)胞得到少突膠質(zhì)前體細(xì)胞及其增殖的分化培養(yǎng)基，所述分化培養(yǎng)基包括液體基礎(chǔ)培養(yǎng)基，其中，以所述液體基礎(chǔ)培養(yǎng)基的體積為基準(zhǔn)，所述分化培養(yǎng)基還含有1-500ug/mL的刺五加苷、1-20體積％的胎牛血清、5-300ng/mL人表皮生長因子(EGF)和5-300ng/mL堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)；還提供了使用前述分化培養(yǎng)基的制備該刺五加苷處理試劑盒的方法；還提供了包括前述的方法獲得的少突膠質(zhì)前體細(xì)胞的用于治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的藥物組合物。使用本發(fā)明的分化培養(yǎng)基的本發(fā)明的方法能夠高效分化間充質(zhì)干細(xì)胞，得到少突膠質(zhì)前體細(xì)胞。本發(fā)明用于治療創(chuàng)傷性脊髓損傷與多發(fā)性硬化癥等疾病的藥物組合物能在體內(nèi)修復(fù)損傷的神經(jīng)細(xì)胞，并消除神經(jīng)系統(tǒng)病變。
文檔編號C12N5/0797GK102337246SQ201110307969
公開日2012年2月1日 申請日期2011年10月12日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月12日
發(fā)明者沈麗, 王振光, 郝麗敏, 黃啟明 申請人:北京弘潤天源生物技術(shù)有限公司