本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種金離子檢測及吸附系統(tǒng)及其宿主菌、金離子回收方法。

背景技術(shù)：

金是人類較早發(fā)現(xiàn)和利用的貴金屬，由于其資源稀少及特有的理化性質(zhì)，自古以來被視為五金之首，有“金屬之王”的稱號。金是重金屬中少有的化學(xué)、物理、電子性能優(yōu)異的金屬，具有較高的穩(wěn)定性，它的應(yīng)用領(lǐng)域非常廣泛。由于金具備非常穩(wěn)定的理化性質(zhì)，如抗腐蝕性、導(dǎo)電性、導(dǎo)熱性和穩(wěn)定性，使它能夠廣泛用到許多現(xiàn)代高新技術(shù)當(dāng)中去，金離子在免疫系統(tǒng)能夠作為白細(xì)胞等免疫細(xì)胞的抑制劑。此外，金在生物學(xué)及醫(yī)藥學(xué)領(lǐng)域同樣扮演重要的作用，如細(xì)菌抗性及抗癌藥物研發(fā)等。

當(dāng)今社會重金屬對土壤、水、環(huán)境的污染問題越來越受到重視。重金屬金的礦產(chǎn)資源被開發(fā)的同時，有一部分進(jìn)入環(huán)境中，然后通過地大氣、地表水、地下水和生物鏈直至大氣圈等傳播途徑，對人民的生產(chǎn)生活以及生態(tài)系統(tǒng)產(chǎn)生污染、破壞乃至威脅到人們的生存環(huán)境及生命健康。此外，在不合理的開采和黃金的冶煉及二次加工等生產(chǎn)過程中產(chǎn)生一些副產(chǎn)物，這些問題已經(jīng)嚴(yán)重影響到黃金產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。眾所周知，黃金的含量是十分有限的，屬于稀有的貴金屬資源，如果我們能夠合理地開發(fā)金礦產(chǎn)資源，減少資源的浪費(fèi)，可以很大程度上提高金礦產(chǎn)資源的有效利用率。所以，能夠?qū)Νh(huán)境中的金離子的檢測，以及能夠合理的回收環(huán)境中的金離子十分重要。隨著金應(yīng)用范圍的不斷擴(kuò)大，尤其是金在食品安全方面以及醫(yī)藥健康的使用，從而致使許多金離子通過食物鏈的富集作用進(jìn)入到動植物體內(nèi)，能使蛋白質(zhì)變性引起環(huán)境以及人的健康危害。由于金離子在環(huán)境中不能被分解，還能夠在水中的其他的有毒物質(zhì)結(jié)合生成毒性更大的產(chǎn)物，這些有毒產(chǎn)物通過動植物吸收，對消化系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)造成嚴(yán)重破壞。金離子還能夠在人體內(nèi)與各種酶發(fā)生的結(jié)合形成復(fù)合物，使酶本身失去活性，進(jìn)而使人的身體機(jī)能遭到破壞，危害人體的健康，嚴(yán)重時甚至威脅生命。特別三價金離子能夠與生物體內(nèi)發(fā)生作用，導(dǎo)致生物體中毒，影響生物體的健康。所以重金屬金離子的檢測和回收逐漸為社會所關(guān)注，尋找準(zhǔn)確、靈敏、快速的金檢測方法在當(dāng)今科學(xué)界具有非常重要的意義，如何檢測和回收環(huán)境中的金離子成為當(dāng)今時代的熱點(diǎn)問題。

現(xiàn)有的重金屬離子回收方法主要是化學(xué)方法，通過加入化學(xué)試劑與重金屬離子形成沉淀或者懸浮達(dá)到回收重金屬的目的。但是化學(xué)方法有三個缺點(diǎn)：第一是化學(xué)方法有可能由于加入的化學(xué)試劑的量不合適而造成二次污染；第二是化學(xué)方法選擇性不夠高，尤其是處理性質(zhì)極相近的各種重金屬效果不好，即使回收得到了一定的目的金屬，純度也不高，還需要進(jìn)一步處理；第三是化學(xué)方法回收工業(yè)廢水中的重金屬，所產(chǎn)生污水對于環(huán)境不友好，沉淀劑等化學(xué)試劑可能對于自然環(huán)境造成更大的破壞。因此，現(xiàn)有的方法很難實(shí)現(xiàn)對工業(yè)廢水中金離子的高效選擇性檢測及富集和回收。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的上述不足，提供一種金離子檢測及吸附系統(tǒng)及其宿主菌、金離子回收方法，旨在解決現(xiàn)有金離子回收純度低、效果不理想，以及污染環(huán)境的技術(shù)問題。

為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：

一方面，本發(fā)明提供一種金離子檢測及吸附系統(tǒng)，包括檢測單元和與所述檢測單元連接的吸附單元，所述檢測單元包括熒光蛋白dna序列，且所述熒光蛋白dna序列與第一啟動子連接；所述吸附單元包括互相連接的大腸桿菌外膜蛋白o(hù)mpadna序列和金離子結(jié)合蛋白golbdna序列，且所述大腸桿菌外膜蛋白o(hù)mpadna序列與第二啟動子連接；所述檢測單元位于所述吸附單元的上游。

另一方面，本發(fā)明提供一種金離子檢測及吸附蛋白表面展示系統(tǒng)，包括由上述金離子檢測及吸附系統(tǒng)表達(dá)的熒光蛋白、大腸桿菌外膜蛋白o(hù)mpa和金離子結(jié)合蛋白golb。

另一方面，本發(fā)明提供一種表達(dá)載體，包括上述金離子檢測及吸附系統(tǒng)。

又一方面，本發(fā)明提供一種宿主菌，所述宿主菌包括上述表達(dá)載體或所述宿主菌表達(dá)上述金離子檢測及吸附蛋白表面展示系統(tǒng)。

再一方面，本發(fā)明提供一種上述金離子檢測及吸附系統(tǒng)的制備方法，包括如下步驟：

從大腸桿菌基因組中擴(kuò)增出大腸桿菌外膜蛋白o(hù)mpadna序列，從鼠傷寒沙門氏菌基因組dna中擴(kuò)增出金離子結(jié)合蛋白golbdna序列；

以所述大腸桿菌外膜蛋白o(hù)mpadna序列和所述金離子結(jié)合蛋白golbdna序列為模板，擴(kuò)增出ompa-golb融合蛋白dna序列；

從大腸桿菌表達(dá)載體基因組中擴(kuò)增熒光蛋白dna序列；

將第一啟動子、所述熒光蛋白dna序列、第二啟動子、所述ompa-golb融合蛋白dna序列依次連接。

最后，本發(fā)明提供一種金離子回收方法，包括如下步驟：

提供含有金離子的液體；

將權(quán)利要求6所述的宿主菌培養(yǎng)后加入所述液體中，靜置處理；

待所述溶液中出現(xiàn)沉淀后，進(jìn)行過濾處理得到吸附有金離子的所述宿主菌；

用酸處理吸附有金離子的所述宿主菌，分離后得到金離子。

本發(fā)明的金離子檢測及吸附系統(tǒng)基于鼠傷寒沙門氏菌中金離子的調(diào)控機(jī)制設(shè)計，其中包含了檢測單元和吸附單元，檢測單元包括報告熒光蛋白dna序列，其可以可視化檢測金離子，而吸附單元包括ompa-golb吸附部分，高效吸附金離子。將該系統(tǒng)連接到質(zhì)粒中后導(dǎo)入非致病性的大腸桿菌細(xì)胞體內(nèi)，在啟動子調(diào)控下可視化檢測和吸附金離子，因此該種經(jīng)過改造后的工程菌對金離子的檢測及吸附具有很好的效果；因報告熒光蛋白、大腸桿菌外膜蛋白o(hù)mpa和金離子結(jié)合蛋白golb的高效表達(dá)，其工程菌可以表達(dá)金離子檢測及吸附蛋白表面展示系統(tǒng)，因此金離子檢測及吸附系統(tǒng)容易制備、成本較低、操作方便。

本發(fā)明提供的金離子回收方法，可以集金離子檢測及吸附一體化，用本發(fā)明的工程菌對含金工業(yè)廢水的處理：將工程菌液加入到廢水中，菌體能夠在檢測到含金廢水的同時在細(xì)胞膜外大量表達(dá)golb蛋白，將廢水中的金離子結(jié)合。在完成金離子的結(jié)合吸附后，對菌體進(jìn)行聚集和沉淀，菌體回收方便。通過對菌體的處理和二次使用，本發(fā)明最終能夠通過生物手段實(shí)現(xiàn)對工業(yè)廢水中重金屬金的檢測及可循環(huán)富集和回收；因此，本發(fā)明能夠克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)，不會造成二次污染，對環(huán)境友好。

附圖說明

圖1是本發(fā)明實(shí)施例1金離子檢測系統(tǒng)質(zhì)粒構(gòu)建圖譜；

圖2是本發(fā)明實(shí)施例1金離子檢測系統(tǒng)質(zhì)粒的電泳鑒定圖；其中，m是dna分子量標(biāo)準(zhǔn)，1是金離子檢測系統(tǒng)質(zhì)粒泳道；

圖3是本發(fā)明實(shí)施例2金離子吸附系統(tǒng)質(zhì)粒構(gòu)建圖譜；

圖4是本發(fā)明實(shí)施例2金離子吸附系統(tǒng)質(zhì)粒的電泳鑒定圖；其中，m是dna分子量標(biāo)準(zhǔn)，1是融合蛋白表達(dá)lpp-ompa-golb質(zhì)粒泳道；

圖5是本發(fā)明實(shí)施例3金離子檢測及吸附系統(tǒng)質(zhì)粒構(gòu)建圖譜；

圖6是本發(fā)明實(shí)施例5水體中金離子敏感性檢測效果示意圖；

圖7(a)是本發(fā)明實(shí)施例6水體中金離子選擇性檢測效果示意圖；

圖7(b)是本發(fā)明實(shí)施例5水體中金離子選擇性檢測效果示意圖；

圖8是本發(fā)明實(shí)施例7蛋白表達(dá)驗證圖；

圖9是本發(fā)明實(shí)施例5水體中金離子的濃度和誘導(dǎo)時間對檢測的影響；

圖10是本發(fā)明實(shí)施例8金離子吸附能力效果圖。

具體實(shí)施方式

為了使本發(fā)明要解決的技術(shù)問題、技術(shù)方案及有益效果更加清楚明白，以下結(jié)合附圖和實(shí)施例，對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。

一方面，本發(fā)明實(shí)施例提供了一種金離子檢測及吸附系統(tǒng)，包括檢測單元和與該檢測單元連接的吸附單元，檢測單元包括熒光蛋白dna序列，且該熒光蛋白dna序列與第一啟動子連接；吸附單元包括互相連接的大腸桿菌外膜蛋白o(hù)mpadna序列和金離子結(jié)合蛋白golbdna序列，且大腸桿菌外膜蛋白o(hù)mpadna序列與第二啟動子連接；該檢測單元位于吸附單元的上游。

在一實(shí)施例中，第一啟動子為pgols-gols-pgolb，其序列如seqidno:10所示；第二啟動子為pgolb，其序列如seqidno:19所示。大腸桿菌外膜蛋白o(hù)mpadna序列如seqidno:3所示，金離子結(jié)合蛋白golbdna序列如seqidno:6所示。

具體地，熒光蛋白是一種發(fā)光、可視化的蛋白，可為紅色熒光蛋白rfp或綠色熒光蛋白egfp，在本實(shí)施例中主要起對金離子可視化檢測報告作用，在本發(fā)明一優(yōu)選的實(shí)施例中，熒光蛋白為紅色熒光蛋白rfp，其dna序列如seqidno:13所示。

在本發(fā)明一優(yōu)選實(shí)施例的金離子檢測及吸附系統(tǒng)中，第二啟動子與大腸桿菌外膜蛋白o(hù)mpadna序列之間還連接有脂蛋白lppdna序列，脂蛋白lppdna序列如seqidno:22所示。在該條件下，該系統(tǒng)表達(dá)的lpp蛋白可以增強(qiáng)大腸桿菌外膜蛋白o(hù)mpa的表面展示能力，從而使金離子結(jié)合蛋白golb在細(xì)胞膜上結(jié)合更穩(wěn)固更緊密。

另一方面，本發(fā)明實(shí)施例提供一種金離子檢測及吸附蛋白表面展示系統(tǒng)，其包括本發(fā)明實(shí)施例的金離子檢測及吸附系統(tǒng)表達(dá)的熒光蛋白、大腸桿菌外膜蛋白o(hù)mpa和金離子結(jié)合蛋白golb；或包括本發(fā)明另一實(shí)施例的金離子檢測及吸附系統(tǒng)表達(dá)的熒光蛋白、脂蛋白lpp、大腸桿菌外膜蛋白o(hù)mpa和金離子結(jié)合蛋白golb。

另一方面，本發(fā)明實(shí)施例提供了一種表達(dá)載體，該表達(dá)載體包括本實(shí)施例的金離子檢測及吸附系統(tǒng)。同時，本發(fā)明實(shí)施例提供了一種宿主菌，該宿主菌包括本實(shí)施例的表達(dá)載體；或表達(dá)本實(shí)施例的金離子檢測及吸附蛋白表面展示系統(tǒng)。

又一方面，本發(fā)明實(shí)施例提供一種上述金離子檢測及吸附系統(tǒng)的制備方法，其特征在于，包括如下步驟：

s011：從大腸桿菌基因組中擴(kuò)增出大腸桿菌外膜蛋白o(hù)mpadna序列，從鼠傷寒沙門氏菌基因組dna中擴(kuò)增出金離子結(jié)合蛋白golbdna序列；

s012：以上述大腸桿菌外膜蛋白o(hù)mpadna序列和金離子結(jié)合蛋白golbdna序列為模板，擴(kuò)增出ompa-golb融合蛋白的dna序列；

s013：從大腸桿菌表達(dá)載體基因組中擴(kuò)增熒光蛋白dna序列；

s014：將第一啟動子、所述熒光蛋白dna序列、第二啟動子、所述ompa-golb融合蛋白dna序列依次連接。

在一實(shí)施例中，擴(kuò)增大腸桿菌外膜蛋白o(hù)mpadna序列的引物如seqidno:1、seqidno:2所示；擴(kuò)增金離子結(jié)合蛋白golbdna序列的引物seqidno:4、seqidno:5所示。

而根據(jù)具體熒光蛋白不同，選擇的擴(kuò)增引物也不同，本實(shí)施例的熒光蛋白dna序列為紅色熒光蛋白rfpdna序列，其可以從本實(shí)驗室的大腸桿菌表達(dá)載體基因組中擴(kuò)增紅色熒光蛋白rfpdna序列，且擴(kuò)增引物如seqidno:11、seqidno:12所示。而在一實(shí)施例中，第一啟動子為pgols-gols-pgolb，且其擴(kuò)增引物如seqidno:8、seqidno:9所示，第二啟動子為pgolb，且其擴(kuò)增引物如seqidno:17、seqidno:18所示，兩種啟動子都可以從從鼠傷寒沙門氏菌基因組擴(kuò)增得到，而本實(shí)施例的pgolb優(yōu)選從本實(shí)驗室的大腸桿菌生物磚表達(dá)載體pzh2中擴(kuò)增，效率更高。

又一實(shí)施例中，通過從表達(dá)脂蛋白lpp的菌種中擴(kuò)增出脂蛋白lpp的dna序列，連接在第二啟動子pgolb與大腸桿菌外膜蛋白o(hù)mpadna序列之間，使金離子結(jié)合蛋白golb在細(xì)胞膜上結(jié)合更穩(wěn)固更緊密。

最后，本發(fā)明實(shí)施例提供一種金離子回收方法，包括如下步驟：

s021：提供含有金離子的液體；

s022：將本發(fā)明實(shí)施例的宿主菌培養(yǎng)后加入到上述液體中，靜置處理；

s023：待溶液中出現(xiàn)沉淀后，進(jìn)行過濾處理得到吸附有金離子的宿主菌；

s024：用酸處理吸附有金離子的宿主菌，分離后得到金離子。

在一優(yōu)選實(shí)施例中，上述步驟s021中，含有金離子的液體可以是各種工業(yè)廢水、礦業(yè)廢水等中含有金離子回收液，在該液體中金離子的濃度范圍為0.01μm～20μm；本實(shí)施例提供宿主菌在金離子濃度為0.01μm時就有很好的檢測效果，且在金離子濃度為10μm時檢測效果最佳。上述步驟s022中，靜置處理的時間范圍為10h～15h，該范圍內(nèi)宿主菌對液體中金離子的吸附效果達(dá)到最佳。

本發(fā)明先后進(jìn)行過多次試驗，現(xiàn)舉一部分試驗結(jié)果作為參考對發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)描述，下面結(jié)合具體實(shí)施例進(jìn)行詳細(xì)說明。

實(shí)施例1金離子檢測系統(tǒng)表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定

1.檢測系統(tǒng)中金離子誘導(dǎo)基因pgols-gols-pgolb片段的擴(kuò)增

使用特異引物pgolts1(seqidno:8)和pgolts2(seqidno:9)從鼠傷寒沙門氏菌基因組dna(ncbi中的引用位置：nc_003197)中擴(kuò)增出編碼金誘導(dǎo)基因的dna序列(seqidno:10)；本實(shí)施例的金離子誘導(dǎo)基因(goldinductivegene)即為啟動子pgols-gols-pgolb，其可以表達(dá)gols蛋白，gols蛋白平時起到阻遏作用，在有金離子存在時才會從啟動子pgolb的dna序列上脫落，引發(fā)下游基因表達(dá)。

pcr反應(yīng)體系(50μl)：

pcr反應(yīng)條件：

第一步：95℃，3分鐘

第二步：95℃，1分鐘

第三步：60℃，2分鐘

第四步：72℃，4分鐘

第五步：重復(fù)第二步至第四步，29個循環(huán)

第六步：72℃10分鐘

第七步：4℃保溫。

回收pcr產(chǎn)物，備用。

2.檢測系統(tǒng)中報告基因rfp-terminator片段的擴(kuò)增

1)紅色熒光蛋白rfp片段基因的擴(kuò)增

使用特異引物rfp1(seqidno:11)和rfp2(seqidno:12)從本實(shí)驗室的大腸桿菌表達(dá)載體基因組dna中擴(kuò)增出編碼紅色熒光蛋白rfp的dna序列(seqidno:13)，反應(yīng)條件如下。

pcr反應(yīng)體系(50μl)：

pcr反應(yīng)條件：

第一步：94℃，2分鐘

第二步：94℃，0.5分鐘

第三步：60℃，0.5分鐘

第四步：72℃，1分鐘

第五步：重復(fù)第二步至第四步，29個循環(huán)

第六步：72℃。10分鐘

第七步：10℃保溫。

回收pcr產(chǎn)物，備用。

2)終止子terminator片段的基因擴(kuò)增

根據(jù)所需擴(kuò)增目的dna序列和堿基互配原理，設(shè)計特異引物term1(seqidno:14)和term2(seqidno:15)，從本實(shí)驗室所有的大腸桿菌表達(dá)載體基因組dna中擴(kuò)增出終止子terminator的dna序列(seqidno:16)，反應(yīng)條件如下。

pcr反應(yīng)體系(50μl)：

pcr反應(yīng)條件：

第一步：94℃，2分鐘

第二步：94℃，0.5分鐘

第三步：60℃，0.5分鐘

第四步：72℃，0.5分鐘

第五步：重復(fù)第二步至第四步，29個循環(huán)

第六步：72℃，10分鐘

第七步：10℃保溫。

回收pcr產(chǎn)物，備用。

3)rfp-terminator片段的基因擴(kuò)增

根據(jù)所需擴(kuò)增目的dna序列和堿基互配原理，使用特異引物rfp1(seqidno:11)和term2(seqidno:15)，以上述第1和2點(diǎn)回收的擴(kuò)增產(chǎn)物為模版，擴(kuò)增出rfp-terminator片段的dna序列，反應(yīng)條件如下。

pcr反應(yīng)體系(50μl)：

pcr反應(yīng)條件：

第一步：94℃，2分鐘

第二步：94℃，0.5分鐘

第三步：65℃，0.5分鐘

第四步：72℃，1分鐘

第五步：重復(fù)第二步至第四步，29個循環(huán)

第六步：72℃，10分鐘

第七步：10℃保溫。

回收pcr產(chǎn)物，備用。

3.檢測系統(tǒng)中金離子誘導(dǎo)基因和報告基因融合蛋白表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定

1)使用dna限制性內(nèi)切酶ecori和psti酶切上述金離子誘導(dǎo)基因：啟動子pgols-gols-pgolb擴(kuò)增得到的dna片段(seqidno:10)，然后使用t4dna連接酶插入到本實(shí)驗室所有的大腸桿菌生物磚表達(dá)載體pzh2中。

酶切反應(yīng)體系(20μl)：

反應(yīng)條件：37℃，水浴10小時。

dna連接反應(yīng)體系(10μl，100ngdna)：

反應(yīng)條件：16℃，水浴16小時。

2)使用dna限制性內(nèi)切酶xbai和psti酶切上述rfp-terminator的擴(kuò)增dna片段，然后使用t4dna連接酶插入1)步驟構(gòu)建完成的大腸桿菌生物磚表達(dá)載體pzh2中。

酶切反應(yīng)體系(20μl)：

反應(yīng)條件：37℃，水浴10小時。

dna連接反應(yīng)體系(10μl，100ngdna)：

反應(yīng)條件：16℃，水浴16小時。

3)檢測系統(tǒng)中金離子誘導(dǎo)基因和報告基因融合蛋白表達(dá)質(zhì)粒的提取結(jié)果請見圖1(圖中g(shù)olb啟動子即為啟動子pgols-gols-pgolb)，電泳鑒定結(jié)果請見圖2。

實(shí)施例2金離子吸附系統(tǒng)表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定

1.吸附系統(tǒng)中金離子誘導(dǎo)基因pgolb片段的擴(kuò)增

根據(jù)所需擴(kuò)增目的dna序列和堿基互配原理，設(shè)計特異引物pgolb1(seqidno:17)和pgolb2(seqidno:18)，從本實(shí)驗室所有的大腸桿菌生物磚表達(dá)載體pzh2中擴(kuò)增出金離子調(diào)控基因的啟動子的pgolbdna序列(seqidno:19)，反應(yīng)條件如下。

pcr反應(yīng)體系(50μl)：

pcr反應(yīng)條件：

第一步：95℃，2分鐘

第二步：95℃，0.5分鐘

第三步：63℃，0.5分鐘

第四步：72℃，0.5分鐘

第五步：重復(fù)第二步至第四步，29個循環(huán)

第六步：72℃，10分鐘

第七步：4℃保溫。

回收pcr產(chǎn)物，備用。

2.吸附系統(tǒng)中金離子吸附基因片段的擴(kuò)增

1)大腸桿菌外膜蛋白a(ompa)片段的基因擴(kuò)增

根據(jù)所需擴(kuò)增目的dna序列和堿基互配原理，設(shè)計特異引物ompa1(seqidno:1)和ompa2(seqidno:2)，從大腸桿菌基因組dna(ncbi中的引用位置：nc_000913)中擴(kuò)增出編碼大腸桿菌外膜蛋白a(ompa)第1位至第159位氨基酸的dna序列(seqidno:3)。

反應(yīng)條件如下：

pcr反應(yīng)體系(50μl)：

pcr反應(yīng)條件：

第一步：95℃，2分鐘

第二步：95℃，0.5分鐘

第三步：63℃，0.5分鐘

第四步：72℃0.5分鐘

第五步：重復(fù)第二步至第四步，29個循環(huán)

第六步：72℃，10分鐘

第七步：4℃保溫。

回收pcr產(chǎn)物，備用。

2)金離子結(jié)合蛋白golb片段的基因擴(kuò)增

根據(jù)所需擴(kuò)增目的dna序列和堿基互配原理，設(shè)計特異引物golb1(seqidno:4)和golb2(seqidno:5)從鼠傷寒沙門氏菌基因組dna(ncbi中的引用位置：nc_003197)中擴(kuò)增出編碼金離子結(jié)合蛋白golb的dna序列(seqidno:6)，并在其c端加上編碼flag-tag的序列，反應(yīng)條件如下。

pcr反應(yīng)體系(50μl)：

pcr反應(yīng)條件：

第一步：95℃，2分鐘

第二步：95℃，0.5分鐘

第三步：60℃，0.5分鐘

第四步：72℃，0.5分鐘

第五步：重復(fù)第二步至第四步，29個循環(huán)

第六步：72℃，10分鐘

第七步：4℃保溫。

回收pcr產(chǎn)物，備用。

3)終止子terminator片段的基因擴(kuò)增

根據(jù)所需擴(kuò)增目的dna序列和堿基互配原理，設(shè)計特異引物term1(seqidno:14)和term2(seqidno:15)，從本實(shí)驗室所有的大腸桿菌表達(dá)載體基因組dna中擴(kuò)增出終止子terminator的dna序列(seqidno:16)，反應(yīng)條件如下。

pcr反應(yīng)體系(50μl)：

pcr反應(yīng)條件：

第一步：94℃，2分鐘

第二步：94℃，0.5分鐘

第三步：60℃，0.5分鐘

第四步：72℃，0.5分鐘

第五步：重復(fù)第二步至第四步，29個循環(huán)

第六步：72℃，10分鐘

第七步：10℃保溫。

回收pcr產(chǎn)物，備用。

3.lpp-ompa-golb融合蛋白表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定

1)設(shè)計特異引物l1(seqidno:20)和l2(seqidno:21)，從表達(dá)脂蛋白lpp的大腸桿菌中擴(kuò)增出脂蛋白lppdna(seqidno:22)產(chǎn)物，使用dna限制性內(nèi)切酶xbai和psti酶解該脂蛋白lpp片段以及上述pgolb片段、ompa片段、golb片段、terminator片段的擴(kuò)增產(chǎn)物，然后使用t4dna連接酶插入大腸桿菌生物磚表達(dá)載體pzh2中，lpp-ompa-golb融合蛋白表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建圖譜請詳見圖3；其中ompa-golb融合蛋白的dna序列為：seqidno:7。。

酶切反應(yīng)體系(20μl)：

反應(yīng)條件：37℃水浴10小時。

dna連接反應(yīng)體系(10μl，100ngdna)：

反應(yīng)條件：16℃水浴16小時。

2)lpp-ompa-golb融合蛋白表達(dá)質(zhì)粒的提取與鑒定，結(jié)果請見圖4。

實(shí)施例3金離子檢測及吸附系統(tǒng)表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定

1.使用dna限制性內(nèi)切酶psti和spei酶解上述實(shí)施例1中得到的pgols-gols-pgolb-rfp-terminator酶解片段，使其具有粘性末端，使用dna限制性內(nèi)切酶psti和xbai酶解上述實(shí)施例2中得到的pgolb-lpp-ompa-golb-terminator酶解片段，使其具有粘性末端然后使用t4dna連接酶插入到大腸桿菌生物磚質(zhì)粒骨架pzh2中。

酶切反應(yīng)體系(20μl)：

反應(yīng)條件：37℃水浴10小時。

dna連接反應(yīng)體系(10μl，100ngdna)：

反應(yīng)條件：16℃水浴16小時。

2.金離子檢測及吸附一體化表達(dá)質(zhì)粒的提取結(jié)果請見圖5。

實(shí)施例4金離子檢測及吸附系統(tǒng)質(zhì)粒轉(zhuǎn)入宿主菌

1)將上述實(shí)施例4得到的重組質(zhì)粒pzh2通過化學(xué)轉(zhuǎn)化方法導(dǎo)入大腸桿菌細(xì)胞dh5α中，通過在含有氨芐青霉素(50μgml^-1)的lb固體培養(yǎng)基上于37℃中培養(yǎng)16小時，從中篩選出陽性克隆并加以保存。

感受態(tài)細(xì)胞的熱激轉(zhuǎn)化和稀釋涂布步驟如下：將連接反應(yīng)的產(chǎn)物于感受態(tài)細(xì)胞(dh5α)中，手指輕彈混勻；冰浴30分鐘后42℃熱激95秒，快速轉(zhuǎn)移至冰上；冰浴2分鐘后每管加入事先37℃預(yù)熱好的lb培養(yǎng)基900μl，37℃，200rpm培養(yǎng)1小時使其復(fù)蘇；3000rpm離心30秒，移去0.9ml上清后，取下層0.1ml涂布相應(yīng)的抗性平板，37℃培養(yǎng)10小時。

2)重組菌的篩選和鑒定

采用常規(guī)菌落pcr法和抽提陽性克隆的質(zhì)粒后酶切鑒定法，具體可參見《takara限制性內(nèi)切酶采購目錄和技術(shù)指南》。測序由上海生物工程技術(shù)服務(wù)公司完成，金離子檢測及吸附系統(tǒng)質(zhì)粒的提取與鑒定。

實(shí)施例5金離子檢測及吸附系統(tǒng)檢測金離子能力的測試

1.金離子的濃度對檢測的影響

1)將用于檢測金離子的大腸桿菌菌種接入適量含有氨芐青霉素(50μgml^-1)的lb液體培養(yǎng)基中于37℃中培養(yǎng)過夜；將過夜培養(yǎng)菌液1:100稀釋入適量含有氨芐青霉素(50μgml^-1)lb液體培養(yǎng)基中于37℃中培養(yǎng)至培養(yǎng)液od600＝0.6，向培養(yǎng)液中加入終濃度為0；0.001；0.01；0.1；0.25；0.5；1；5；10；20μm的金離子，培養(yǎng)液在37℃中繼續(xù)培養(yǎng)過夜；

2)培養(yǎng)10h的細(xì)菌培養(yǎng)液通過離心(8000轉(zhuǎn)/分鐘，2min)收集后，用去離子水清洗1次；

3)清洗后的菌體使用1×pbs緩沖液重懸；

4)使用酶標(biāo)儀檢測重懸后的菌液。

5)具體檢測結(jié)果請見圖6，經(jīng)改造的工程菌在金離子濃度為0.01μm時就有很好的檢測效果，且在金離子濃度為10μm時檢測效果最好。

2.金離子的濃度和誘導(dǎo)時間對檢測的影響

1)將用于檢測金離子的大腸桿菌菌種接入適量含有氨芐青霉素(50μgml^-1)的lb液體培養(yǎng)基中于37℃中培養(yǎng)過夜；將過夜培養(yǎng)菌液1:100稀釋入適量含有氨芐青霉素(50μgml^-1)lb液體培養(yǎng)基中于37℃中培養(yǎng)至培養(yǎng)液od600＝0.6，設(shè)置四個不同的濃度梯度，在四個不同的濃度梯度下設(shè)置不同的時間梯度。四個不同的金濃度梯度，分別為0.1、1、5、20μmol，時間梯度分別為0.5、1、1.5、2、3、5、7.5、10h。培養(yǎng)10h。

2)培養(yǎng)10h的細(xì)菌培養(yǎng)液通過離心(8000轉(zhuǎn)/分鐘，2min)收集后，用去離子水清洗1次；

3)清洗后的菌體使用1×pbs緩沖液重懸；

4)使用酶標(biāo)儀檢測重懸后的菌液。

具體檢測結(jié)果請見圖9，經(jīng)改造的工程菌在金離子濃度為0.01μm時就有很好的檢測效果，且在金離子濃度為10μm時檢測效果最好。對菌體進(jìn)行熒光檢測的結(jié)果顯示在金離子濃度為0.1μmol時，熒光強(qiáng)度依次增加，在10h時達(dá)到最大值16000左右。在金離子濃度為1μmol時，熒光強(qiáng)度呈現(xiàn)峰形分布，在5h時達(dá)到最大值45000左右。在金離子濃度為5μmol時，熒光強(qiáng)度呈現(xiàn)峰形分布，在5h時達(dá)到最大值65000左右。

如此可知：此系統(tǒng)可等效為一個濃度依賴性的化學(xué)反應(yīng)與一個分解反應(yīng)的偶聯(lián)，滿足動力學(xué)方程的濃度作用規(guī)律，即起始濃度越高，反應(yīng)達(dá)到平衡所需的時間就越短，而由于分解反應(yīng)的存在，綠色熒光蛋白最終會降解，因此熒光強(qiáng)度相對時間的函數(shù)會呈現(xiàn)峰型分布。

3.混合金屬溶液中金離子選擇性檢測

1)將用于檢測金離子的大腸桿菌菌種接入適量含有氨芐青霉素(50μgml^-1)的lb液體培養(yǎng)基中于37℃中培養(yǎng)過夜；將過夜培養(yǎng)菌液1:100稀釋入適量含有氨芐青霉素(50μgml^-1)lb液體培養(yǎng)基中于37℃中培養(yǎng)至培養(yǎng)液od600＝0.6，加入金，金、銀、銅、鎘、鎳、鋅和銀、銅、鎘、鎳、鋅，培養(yǎng)液在37℃中繼續(xù)培養(yǎng)過夜；

2)培養(yǎng)10h的細(xì)菌培養(yǎng)液通過離心(8000轉(zhuǎn)/分鐘，2min)收集后，用去離子水清洗1次；

3)清洗后的菌體使用1×pbs緩沖液重懸；

4)使用酶標(biāo)儀檢測重懸后的菌液。

5)具體檢測結(jié)果請見圖7(b)，對菌體進(jìn)行熒光檢測的結(jié)果顯示混合金屬對金離子的熒光檢測有微弱影響，金的選擇性依然很高。

實(shí)施例6金離子檢測及吸附系統(tǒng)對金離子選擇性能力的檢測

1.將用于檢測金離子的大腸桿菌菌種接入適量含有氨芐青霉素(50μgml^-1)的lb液體培養(yǎng)基中于37℃中培養(yǎng)過夜；將過夜培養(yǎng)菌液1:100稀釋入適量含有氨芐青霉素(50μgml^-1)lb液體培養(yǎng)基中于37℃中培養(yǎng)至培養(yǎng)液od600＝0.6，向培養(yǎng)液中分別加入終濃度為10μm的銀、鎳、鋅、銅、鎘、鉻、汞、鉛離子，培養(yǎng)液在37℃中繼續(xù)培養(yǎng)10h；

2.培養(yǎng)10h的細(xì)菌培養(yǎng)液通過離心(8000轉(zhuǎn)/分鐘，2min)收集后，用去離子水清洗1次；

3.清洗后的菌體使用1×pbs緩沖液重懸；

4.使用酶標(biāo)儀檢測重懸后的菌液。

具體檢測結(jié)果請見圖7(a)，經(jīng)改造的工程菌對金離子有較好的選擇性。

實(shí)施例7表達(dá)lpp-ompa、lpp-ompa-golb融合蛋白的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入宿主菌及宿主菌的培養(yǎng)

1.表達(dá)lpp-ompa融合蛋白的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入宿主菌

1)將用于表達(dá)lpp-ompa融合蛋白的質(zhì)粒通過化學(xué)轉(zhuǎn)化方法導(dǎo)入大腸桿菌細(xì)胞dh5α中，通過在含有氨芐青霉素(50μgml^-1)的lb固體培養(yǎng)基上于37℃中培養(yǎng)16小時，從中篩選出陽性克隆并加以保存。

感受態(tài)細(xì)胞的熱激轉(zhuǎn)化和稀釋涂布步驟如下：將連接反應(yīng)的產(chǎn)物于感受態(tài)細(xì)胞(dh5α)中，手指輕彈混勻；冰浴30分鐘后42℃熱激95秒，快速轉(zhuǎn)移至冰上；冰浴2分鐘后每管加入事先37℃預(yù)熱好的lb培養(yǎng)基900μl，37℃，200rpm培養(yǎng)1小時使其復(fù)蘇；3000rpm離心30秒，移去0.9ml上清后，取下層0.1ml涂布相應(yīng)的抗性平板，37℃培養(yǎng)10小時。

2)重組菌的篩選和鑒定

采用常規(guī)菌落pcr法和抽提陽性克隆的質(zhì)粒后酶切鑒定法，具體可參見《takara限制性內(nèi)切酶采購目錄和技術(shù)指南》。測序由上海生物工程技術(shù)服務(wù)公司完成。lpp-ompa融合蛋白表達(dá)質(zhì)粒測序圖譜請見圖2。

2.表達(dá)lpp-ompa-golb融合蛋白的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入宿主菌

1)將用于表達(dá)lpp-ompa-golb融合蛋白的質(zhì)粒通過化學(xué)轉(zhuǎn)化方法導(dǎo)入大腸桿菌細(xì)胞dh5α中，通過在含有氨芐青霉素(50μgml^-1)的lb固體培養(yǎng)基上于37℃中培養(yǎng)16小時，從中篩選出陽性克隆并加以保存。

感受態(tài)細(xì)胞的熱激轉(zhuǎn)化和稀釋涂布步驟如下：將連接反應(yīng)的產(chǎn)物于感受態(tài)細(xì)胞(dh5α)中，手指輕彈混勻；冰浴30分鐘后42℃熱激95秒，快速轉(zhuǎn)移至冰上；冰浴2分鐘后每管加入事先37℃預(yù)熱好的lb培養(yǎng)基900μl，37℃，200rpm培養(yǎng)1小時使其復(fù)蘇；3000rpm離心30秒，移去0.9ml上清后，取下層0.1ml涂布相應(yīng)的抗性平板，37℃培養(yǎng)10小時。

2)重組菌的篩選和鑒定

采用常規(guī)菌落pcr法和抽提陽性克隆的質(zhì)粒后酶切鑒定法，具體可參見《takara限制性內(nèi)切酶采購目錄和技術(shù)指南》。測序由上海生物工程技術(shù)服務(wù)公司完成。

3.誘導(dǎo)培養(yǎng)

將用于表達(dá)lpp-ompa、lpp-ompa-golb融合蛋白的大腸桿菌菌種接入適量含有氨芐青霉素(50μgml^-1)的lb液體培養(yǎng)基中于37℃中培養(yǎng)過夜；將過夜培養(yǎng)菌液1:100稀釋入適量含有氨芐青霉素(50μgml^-1)lb液體培養(yǎng)基中于37℃中培養(yǎng)至培養(yǎng)液od600＝0.6，向培養(yǎng)液中加入終濃度分別為1μm；5μm；20μm進(jìn)行誘導(dǎo)，培養(yǎng)液在37℃中繼續(xù)培養(yǎng)過夜。

4.蛋白表達(dá)驗證

離心收集37℃中培養(yǎng)過夜的細(xì)菌(5000rpm，5min)，棄上清液。沉淀使用1mlpbs(含10ul100mm的pmsf)重懸。使用超聲波破碎儀破碎收集下來的細(xì)菌(10min，超聲5s，間歇5s)，后于4℃、12000rpm離心10min，沉淀使用tdsetbuffer(1％tritonx-100，0.2％sodiumdeoxycholate，0.1％sds，10mmtetrasodiumedta，10mmtris/hcl)處理兩次。12000rpm離心10min，棄去上清，沉淀使用500μlpbs重懸。

1)sds-page驗證

①配制12％sds-page膠，具體配方見下表1。

表1

②取20μl破碎上清液及沉淀重懸液，加入5μl5×樣品緩沖液，95℃恒溫處理10min。后12000rpm離心10min。

③在電泳槽中加入1×電泳緩沖液，上樣，先75v恒壓運(yùn)行30min，后160v恒壓50min。

④完成后加入考馬斯亮藍(lán)染色液染色20min。

⑤考馬斯亮藍(lán)脫色液脫色2次，每次20min。

⑥使用凝膠成像儀在白光下成像、拍照。

2)westernblot驗證

①12％sds-page分離蛋白。

②剪下與膠大小相近的pvdf膜，在甲醇中浸泡20s，再用水浸泡2min。

③在電泳槽中加入1l電轉(zhuǎn)液，采用濕式轉(zhuǎn)膜法法轉(zhuǎn)膜，膠與膜的放置順序為：海綿/濾紙/膠/膜/濾紙/海綿，低溫下250ma恒流電轉(zhuǎn)2h。

④轉(zhuǎn)膜完成后，取出膜，在一定方向剪角以區(qū)分正反面。使用tbst清洗膜3次，每次5min。

⑤清洗完成后，加入50ml5％脫脂奶粉封閉2h。

⑥封閉完成后，使用tbst清洗膜4次，每次5min。以1：1000稀釋的抗flag標(biāo)簽抗體作一抗，4℃孵育過夜。

⑦tbst清洗膜4次，每次5min。使用1：1000稀釋的山羊抗小鼠igg-hrp抗體作二抗，常溫孵育2h，

⑧tbst清洗膜4次，每次5min。在膜上加400μlcecl低背景化學(xué)發(fā)光檢測劑，使用凝膠成像儀成像、拍照。

結(jié)果如圖8所示，從左至右分別為：

1:單純金離子環(huán)境下，golb蛋白被大量誘導(dǎo)，由于golb蛋白末端帶有之前所述的flag標(biāo)簽，因此可以被熒光抗體識別，最終在膠片上顯影產(chǎn)生條帶。

2:金離子與其他金屬離子混合存在的前提下，gols蛋白仍然能被金離子特異性誘導(dǎo)而失去阻遏能力，導(dǎo)致golb的表達(dá)。

3:僅存在其他金屬離子時，gols蛋白仍然結(jié)合在dna上起到阻遏作用，因此golb蛋白不表達(dá)。

實(shí)施例8lpp-ompa、lpp-ompa-golb金離子吸附能力的檢測

兩種工程菌lpp-ompa、lpp-ompa-golb進(jìn)行吸附實(shí)驗。實(shí)驗前兩種菌均劃線培養(yǎng)于lb固體培養(yǎng)基中(氨芐青霉素抗性)。

金離子濃度對吸附能力的影響

①從兩個個培養(yǎng)皿中分別挑取單菌落接種于5mllb(含5ul氨芐青霉素)培養(yǎng)基中，37℃、220rpm培養(yǎng)過夜。

②將細(xì)菌培養(yǎng)液以1：100重新接種于100mllb(含100ul氨芐青霉素)培養(yǎng)基中，37℃、220rpm培養(yǎng)至od600＝0.6，加入au³⁺至終濃度分別為1μmol，5μmol，20μmol。37℃、220rpm繼續(xù)培養(yǎng)10h。每個實(shí)驗組設(shè)置3個重復(fù)。

③收集細(xì)菌，棄上清液。ddh2o清洗3次。-80℃凍存6h后用凍干機(jī)凍干細(xì)菌沉淀。

④稱重后用1ml濃硝酸消解至完全，用雙蒸水定容至10ml，最后使用電感耦合等離子發(fā)射光譜(icp-aes)檢測。

具體檢測結(jié)果請見圖10。圖中結(jié)果顯示，lpp-ompa-golb工程菌表現(xiàn)出對金離子強(qiáng)有力的吸附能力。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

sequencelisting

<110>深圳勁宇生物科技有限公司

<120>金離子檢測及吸附系統(tǒng)及其宿主菌、金離子回收方法

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<213>擴(kuò)增編碼大腸桿菌外膜蛋白o(hù)mpa的基因的引物

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<213>大腸桿菌外膜蛋白o(hù)mpa的dna序列

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<213>擴(kuò)增編碼金離子結(jié)合蛋白golb的基因的引物

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<213>擴(kuò)增編碼金離子結(jié)合蛋白golb的基因的引物

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<213>擴(kuò)增啟動子pgols-gols-pgolb的引物

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ccgtgggaaccgcagcggcattcggctactcgctggtggcgacctttacgcccgacctgt780

tgcctgaagggacggtaaacgtctattacgaggccgccgcagtgattgtcgcgcttattc840

tgctggggcgctttctggaggcaagggcgaaggggcggacttccgaagcgattaaacgtc900

tggtggggctacaggcgcgggtcgcgcatgtgttacgcgagggccgcatcgtggatatcc960

ctgtcgacgaggttgtgctgggcgactgtgtggaggttcggccaggcgagcggatcccgg1020

ttgacggcgaagtgaccgaaggccgcagcttcgttgacgagtcgatgattaccggcgaac1080

cgataccggttgagaaatccgcaggaagcgcggtggtgggcggtaccgtaaaccaaaaag1140

gcgcgctcacgctgcgggcgaccgccgtcggcggacagaccatgctggcgcaaatcattc1200

gtctggtggaacaggcgcagggttcaaaactgccgattcaggccgtcgtggataaagtga1260

cgctgtggtttgtcccgatggtgatgcttattgctgcgctgacctttgtggtatggctgg1320

cgtttgggccgtcgccagcgctgactttcgctctgatcaatggcgttgcggttctgatta1380

tcgcctgtccttgcgcgatgggcctggcgacgccgacctctattatggtgggaaccggtc1440

gtggggcggaaatgggcgtgctgttccgtaagggggaggcgttacagctactcaaagacg1500

ctaaggtggtggccgtagacaaaaccgggacgcttaccgaaggccgcccggtactgaccg1560

atctcgacgtggccagcggctttgaacgccgtgaggtgctggcgaaagtcgcggcggtag1620

aatcgcgttcagagcatccgattgcccgtgcgattgtcgtgtcggcagaagaggaaggga1680

tcgcgctaccaggcatgagcggcttcgaatcggtgaccgggatgggcgtatacgctaccg1740

ttgacggtacgcgtgttgacgtgggggctgatcgctatatgcgcgaaattggcgtggata1800

ttagcggcttcgccaccaccgccgaacggttagggcaggaagggaaatcgccgctctatg1860

cggctattgacggtcaactggcggcgattatcgccgtggccgatccgatcaaacccagta1920

cgcccgccgcaattaacgctttacatcagctcggcattaaggtcgccatgatcactggcg1980

ataatgcccgcacggcacaggctatcgccagacagttaggaattgatgatgtggttgccg2040

aggtattgccagaagggaaagtcgaggcgatacggcgcctgaaagcggcgtatgggcagg2100

tggcgtttgtcggcgatggcatcaacgatgcgccagcgctggcggagtccgacgtggggc2160

tggcgattggcaccggcaccgatgtggcggtggaatccgccgacgtcgtactaatgtccg2220

gcaacctgcaaggcgtgccgaatgctatcgcgctgtctaaagcgaccatccgcaatatcc2280

accagaatctgttctgggcctttgcttacaatacggcgctgattcctgtcgcggcaggcg2340

cgctatttccggtctggggcatattattgtcaccggtattcgccgcaggggcgatggcga2400

tgtcgagcgtgttcgtgctgggcaacgctttgcggctgcgccgtttccgggcgccgatgg2460

caaccccatccgacacatccacgacatgaggaggagcgtcatgaacatcggtaaagcagc2520

taaagcatcgaaagtctcggccaaaatgattcgctactatgaacagattggtctgattcc2580

cgcggcaagtcggacggattccggctatcgggcctatacccaggctgatgttaatcaatt2640

gcattttatacgccgcgcgcgcgacctcggtttttcagttgctgaaatcatgaacatcgg2700

taaagcagctaaagcatcgaaagtctcggccaaaatgattcgctactatgaacagattgg2760

tctgattcccgcggcaagtcggacggattccggctatcgggcctatacccaggctgatgt2820

taatcaattgcattttatacgccgcgcgcgcgacctcggtttttcagttgctgaaatcag2880

cgacttactgaatctttggaataaccagtcgcggcaaagcgctgacgtcaaacgcctggc2940

gcagacgcacattgatgaactggacagacgtatccagaacatgcagcacatggcgcaaac3000

cctcaaagcgctgattcactgctgcgccggcgacgcgctgccagattgccccattctgca3060

tacgcttggacaacctgacgatagcgagccggaggcgcgtaccggagcggtattgcgacg3120

tcctcgtcgccacggactggcaaagcgtctgtaagtcctgagattacgcttgaccttcca3180

acactggcaaggtccagactggcaacagttcccacacaaaaggagttcact3231

<210>11

<211>50

<212>dna

<213>擴(kuò)增編碼紅色熒光蛋白rfp的基因的引物

<400>11

ctttcttcgaattcgcggccgcttctagagatggcttcctccgaagacgt50

<210>12

<211>41

<212>dna

<213>擴(kuò)增編碼紅色熒光蛋白rfp的基因的引物

<400>12

gtttcttcctgcagcggccgtactagtaattaagcaccggt41

<210>13

<211>681

<212>dna

<213>紅色熒光蛋白rfp的dna序列

<400>13

atggcttcctccgaagacgttatcaaagagttcatgcgtttcaaagttcgtatggaaggt60

tccgttaacggtcacgagttcgaaatcgaaggtgaaggtgaaggtcgtccgtacgaaggt120

acccagaccgctaaactgaaagttaccaaaggtggtccgctgccgttcgcttgggacatc180

ctgtccccgcagttccagtacggttccaaagcttacgttaaacacccggctgacatcccg240

gactacctgaaactgtccttcccggaaggtttcaaatgggaacgtgttatgaacttcgaa300

gacggtggtgttgttaccgttacccaggactcctccctgcaagacggtgagttcatctac360

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atcaaaatgcgtctgaaactgaaagacggtggtcactacgacgctgaagttaaaaccacc540

tacatggctaaaaaaccggttcagctgccgggtgcttacaaaaccgacatcaaactggac600

atcacctcccacaacgaagactacaccatcgttgaacagtacgaacgtgctgaaggtcgt660

cactccaccggtgcttaataa681

<210>14

<211>43

<212>dna

<213>擴(kuò)增終止子序列terminator的引物

<400>14

ctttcttcgaattcgcggccgcttctagagcggcggcatggac43

<210>15

<211>37

<212>dna

<213>擴(kuò)增終止子terminator的引物

<400>15

gtttcttcctgcagcggccgtactagtaaaaggccca37

<210>16

<211>171

<212>dna

<213>終止子terminator的序列

<400>16

accggcggcatggacgagctgtacaagtaataatactagagccaggcatcaaataaaacg60

aaaggctcagtcgaaagactgggcctttcgttttatctgttgtttgtcggtgaacgctct120

ctactagagtcacactggctcaccttcgggtgggcctttctgcgtttatat171

<210>17

<211>50

<212>dna

<213>擴(kuò)增啟動子pgolb的引物

<400>17

gtttcttcgaattcgcggccgcttctagaggacgcgctgccagattgccc50

<210>18

<211>49

<212>dna

<213>擴(kuò)增啟動子pgolb的引物

<400>18

gtttcttcctgcagcggccgctactagtaagtgaactccttttctgtgg49

<210>19

<211>192

<212>dna

<213>啟動子pgolb的序列

<400>19

atgcagttccatattgatgacatgacctgcggcggctgcgccagtacggtaaaaaagacg60

attctgactctcgatgctaatgcgacggtgagaactgacccggcgacgcgtctggttgac120

gttgaaacgtcgctatccgcggagcagattgccgccgccctgcaaaaggccggtttcccg180

ccgcgcgagagg192

<210>20

<211>25

<212>dna

<213>擴(kuò)增編碼脂蛋白lpp的基因的引物

<400>20

atgaaagctactaaactggtactgg25

<210>21

<211>25

<212>dna

<213>擴(kuò)增編碼脂蛋白lpp的基因的引物

<400>21

ttacttgcggtatttagtagccatg25

<210>22

<211>236

<212>dna

<213>脂蛋白lpp的dna序列

<400>22

atgaaagctactaaactggtactgggcgcggtaatcctgggttctactctgctggcaggt60

tgctccagcaacgctaaaatcgatcagctgtcttctgacgttcagactctgaacgctaaa120

gttgaccagctgagcaacgacgtgaacgcaatgcgttccgacgttcggctgctaaagatg180

acgcagctcgtgctaaccagcgtctggacaacatggctactaaataccgcaagtaa236