本發(fā)明屬于生物基因工程技術(shù)領(lǐng)域，涉及到黃野螟過氧化氫酶基因全序列及其克隆方法。該基因編碼過氧化氫酶，該酶(cat)是一類廣泛存在于動物、植物和微生物體內(nèi)的抗氧化酶，是生物建立防御系統(tǒng)的關(guān)鍵酶之一，其生物學(xué)功能是催化細(xì)胞內(nèi)過氧化氫的分解，具有重要的生物化學(xué)研究價值。
技術(shù)背景
過氧化氫酶(catalase，cat)與超氧化物歧化酶(superoxidedismutase，sod)和過氧化物酶(peroxidase，pod)共同組成生物體抗氧化酶體系，清除細(xì)胞內(nèi)的自由基。其中過氧化氫酶，又稱為觸酶，是以鐵卟啉為輔基的結(jié)合酶。它可促使h2o2分解為分子氧和水，清除生物體內(nèi)的過氧化氫，從而使細(xì)胞免于遭受h2o2的毒害，是生物防御體系的關(guān)鍵酶之一。cat作用于過氧化氫的機(jī)理實質(zhì)上是h2o2的歧化，必須有兩個h2o2先后與cat相遇且碰撞在活性中心上，才能發(fā)生反應(yīng)。h2o2濃度越高，分解速度越快。對該基因的研究為可以作為靶標(biāo)設(shè)計新型氧化酶抑制劑提供了基礎(chǔ)。
黃野螟(heortiavitessoides)屬鱗翅目(lepidoptera)，螟蛾科(pyralidae)，在我國廣泛分布于廣東、廣西、海南和云南等南方各省以及香港特別行政區(qū)。黃野螟是典型的寡食性害蟲，僅取食沉香屬(aquilaria)和漆樹屬(rhus)等少數(shù)幾種植物近年來，隨著海南、廣東和云南等地人工大規(guī)模種植白木香面積的日益擴(kuò)大，黃野螟的危害也越來越嚴(yán)重。據(jù)廣東化州地區(qū)統(tǒng)計，黃野螟發(fā)生嚴(yán)重時，白木香的被害株率可高達(dá)90％以上。有關(guān)黃野螟過氧化氫酶基因目前無人研究，本發(fā)明填補(bǔ)了這一空白，對深入研究黃野螟體內(nèi)保護(hù)酶系活性與殺蟲劑、昆蟲病毒、微孢子蟲等外界刺激強(qiáng)度相互作用關(guān)系以及昆蟲耐藥性和抗逆性提供基礎(chǔ)。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于提供黃野螟過氧化氫酶基因全序列及其克隆方法。
為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采取了以下技術(shù)方案：
1、黃野螟總rna的提取
將外地采集的黃野螟活成蟲經(jīng)清洗、消毒、麻醉、液氮冷凍后保存在無菌去酶的ep管中，并置于-70℃低溫冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆?。采用e.z.n.a.tmtotalrnakitii總rna提取試劑盒(omega)來提取黃野螟的總rna。
2、引物設(shè)計和3′race擴(kuò)增
在本實驗室構(gòu)建的cdna文庫中，查找并獲得了黃野螟過氧化氫酶基因的5′端序列，本發(fā)明是在此基礎(chǔ)之上進(jìn)行3′race擴(kuò)增，目的在于獲得黃野螟過氧化氫酶基因全序列。
3′race擴(kuò)增的特異性引物為：
hv-cat-3′-outer：aaaaacgggagcaccagt；
hv-cat-3′-inner：cgctgatgccaagaaacg。
3、目的基因克隆及測序
獲得的pcr產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，回收相應(yīng)目的dna片段，同pmd20-t載體進(jìn)行連接，將連接后的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到e.colidh5α感受態(tài)細(xì)胞之中，然后進(jìn)行amp抗性藍(lán)白斑的篩選，挑取合適的陽性菌落進(jìn)行質(zhì)粒提取。最后經(jīng)由菌落pcr鑒定后進(jìn)行測序。
4、序列拼接
將測序正確的序列與實驗室已構(gòu)建的黃野螟cdna文庫中的過氧化氫酶基因序列進(jìn)行不重復(fù)拼接，從而獲得黃野螟過氧化氫酶基因全長序列。
黃野螟過氧化氫酶基因全長序列，此序列如下：
此序列中劃線處標(biāo)示的atg為初始密碼子，劃線處標(biāo)示的taa為終止密碼子。
根據(jù)黃野螟過氧化氫酶酶基因orf(openreadingframe)全序列，得到其氨基酸序列。該序列如下：
本發(fā)明獲得了黃野螟過氧化氫酶基因全序列，通過對黃野螟成蟲的預(yù)處理、總rna的提取、3′race擴(kuò)增、目的基因片段的克隆及其序列的拼接，得到了黃野螟過氧化氫基因全長序列，該序列全長2039bp，orf序列全長1524bp，共編碼507個氨基酸。
具體實施方式
以下實施例將本發(fā)明進(jìn)一步說明。
1、黃野螟總rna提取
黃野螟成蟲采自廣州市華南農(nóng)業(yè)大學(xué)啟林區(qū)土沉香林。經(jīng)清洗、消毒、麻醉、液氮冷凍后保存在無菌去酶的ep管中，并置于-80℃低溫冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩?/p>
采用trizol試劑盒進(jìn)行黃野螟總rna的提取，具體步驟如下：
1)將冷凍于-80℃的黃野螟幼蟲樣品取出，按uniq-10柱式trizol總rna抽提kit提供的方法提取樣品的總rna。
2)在液氮預(yù)冷的研缽中充分研磨樣品至粉末。在液氮揮發(fā)盡時迅速轉(zhuǎn)移樣品粉末置于液氮中冷卻好的1.5ml離心管中。
3)按照每15-25mg樣品加入0.5mltrizol的比例在上述離心管中加入相應(yīng)體積的trizol溶液，用渦旋混合器振蕩處理，使樣品充分裂解在trizol溶液中。
4)將裂解后的樣品于室溫下放置10min，使得核蛋白與核酸完全分離。12000rpm離心10min，取上清液。
5)加入0.1ml氯仿，上下劇烈震蕩30sec，室溫放置3min。12000rpm，4℃離心10min。離心后樣品分三層：上層水相，中間層和下層有機(jī)相。小心吸取上層水相轉(zhuǎn)移至干凈的離心管中，加1/2倍體積的無水乙醇，混勻。切勿吸取任何中間層，否則會出現(xiàn)染色體dna污染。
6)將吸附柱放入收集管中，用移液器將溶液和半透明纖維狀懸浮物全部加至吸附柱中，靜置2min，12000rpm離心3min，倒掉收集管中的廢液。
7)將吸附柱放回收集管中，加入500μlrpesolution，靜置2min，10000rpm離心30sec，倒掉收集管中的廢液。
8)再次將吸附柱放入收集管中，加入500μlrpesolution，靜置2min，10000rpm離心30sec，倒掉收集管中的廢液。
9)將吸附柱放入收集管中，10000rpm離心2min。
10)將吸附柱打開蓋子于室溫放置2min，以徹底晾干吸附材料中殘留的乙醇，因為乙醇的殘留會影響實驗結(jié)果。但不要讓rna過于干燥，否則會影響洗脫效率。
11)將吸附柱放入干凈的1.5ml離心管中，在吸附膜中央懸空滴加40μldepc-treatedddh2o，靜置5min，12000rpm離心2min，將所得到的rna溶液置于-80℃溫冰箱內(nèi)保存。
注意事項：上述rna實驗所涉及的試劑，須進(jìn)行干熱滅菌(180℃，60min)處理，涉及到的一次性塑料容器、無菌水須進(jìn)行高溫高壓滅菌處理。有關(guān)rna實驗使用所涉及到的試劑盒及無菌水都應(yīng)該專用，須避免混用之后所引起的交叉污染。
2、cdna3′末端擴(kuò)增
參照3′fullracecoresetver.2.0kit試劑盒進(jìn)行，具體操作步驟如下：
1)反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)
反應(yīng)體系如下：
pcr反應(yīng)程序條件：42℃下反應(yīng)60min，70℃下反應(yīng)15min。
2)巢式pcr擴(kuò)增
a)outerpcr擴(kuò)增
反應(yīng)體系如下：
pcr反應(yīng)程序條件：94℃下預(yù)變性4min，94℃下變性30s，55℃下退火30s，72℃下延伸1min，設(shè)置20個循環(huán)，然后72℃下延伸10min。
b)innerpcr擴(kuò)增
反應(yīng)體系如下：
pcr反應(yīng)程序條件：94℃下預(yù)變性4min，94℃下變性30s，55℃下退火30s，72℃下延伸1min，設(shè)置30個循環(huán)，然后72℃延伸10min。獲得的pcr產(chǎn)物用2.0％瓊脂糖凝膠電泳實驗檢測其擴(kuò)增的效果。
3、目的基因克隆及測序
1)從瓊脂糖凝膠中回收dna片段，按通用型dna純化回收試劑盒的方法進(jìn)行回收：
a)柱平衡步驟：先將吸附柱cb2輕輕放入收集管中，往吸附柱cb2上方中加入平衡液bl500μl，在室溫條件下，12000rpm(～13.400×g)離心1min，然后棄掉收集管里的廢液，將吸附柱重新放回到收集管中。
b)將瓊脂糖凝膠上的目的dna單一條帶切下(盡可能地切掉多余的部分)，放入到事先已稱好重量的干凈離心管中，并再次稱取其重量。
c)向上述放有膠塊的離心管中加入與膠塊等倍體積的溶液pc(如果膠塊重量為100mg，其等倍體積可看作是100μl，那么需要加入pc溶液的體積是100μl)，55℃金屬浴放置15min左右，在這期間須不間斷地上下緩慢翻轉(zhuǎn)離心管，直到離心管里的膠塊完全溶解。
d)將上述所得溶液緩慢加入到吸附柱cb2中(吸附柱預(yù)先放進(jìn)收集管中)，在室溫條件下，12000r/min離心1min，然后棄掉收集管里的廢液，將吸附柱再次緩慢放回到收集管中。
e)往吸附柱cb2里加入漂洗液pw(已加無水乙醇)600μl，靜置5min后進(jìn)行離心。在室溫條件下，12000r/min離心1min，然后棄掉收集管里的廢液，將吸附柱cb2再次緩慢放回到收集管中。
f)往吸附柱cb2里再次加入漂洗液pw(已加無水乙醇)600μl，在室溫條件下，12000r/min離心1min，然后棄掉收集管里的廢液。
g)將吸附柱cb2再次放回到收集管里，在室溫條件下，12000r/min離心2min，盡可能地去掉漂洗液。然后將吸附柱放置在室溫條件5分鐘左右，直至徹底晾干。
h)將吸附柱cb2再一次放回到收集管里，往其吸附膜的中間處懸空滴入適量的洗脫緩沖溶液eb，置于室溫3min，12000r/min離心2min，所得溶液即為dna溶液。
i)將上述dna產(chǎn)物放于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>
2)t載體連接
往pcr管中依次加入：pmd20-t載體1.0μl，前述目標(biāo)dna產(chǎn)物3.0μl，去離子水1.0μl，solutioni溶液5.0μl，整個反應(yīng)體系體積為10.0μl。在4℃冰箱中放置過夜。
3)轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞
a)取感受態(tài)細(xì)胞于冰水浴中融化，并分管為每管50μl。
b)每管加入4.5μl的連接產(chǎn)物，輕彈混均。置于冰水30min。
c)離心管置于42℃水浴里，熱激90s。
d)快速將離心管轉(zhuǎn)移到冰水浴中，冷卻細(xì)胞5min(此過程不要搖動離心管)。
e)吸取900μl無菌lb培養(yǎng)基(不含抗生素)加入到離心管中，混勻。
f)在37℃條件下，150r/min搖床振蕩培養(yǎng)45min。
g)將離心管里的內(nèi)容物充分混勻，吸取100μl已轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞加到已配制好的平板培養(yǎng)基上，用彎頭玻璃棒(無菌)緩慢地將細(xì)胞均勻涂抹開來，放于室溫直至培養(yǎng)基表面直至液體被完全吸收后，將培養(yǎng)基倒置，在37℃條件下，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12-15h。
4)陽性重組子的鑒定及測序
a)在每個1.5ml的離心管中分別加入含氨芐的培養(yǎng)液600μl，每個平板都挑選出7個白色菌落與一個藍(lán)色菌落分別放入培養(yǎng)液中，37℃下，250r/min振蕩培養(yǎng)4h。取其菌液作為進(jìn)行菌落pcr鑒定的模板。
b)菌落pcr
反應(yīng)體系如下：
反應(yīng)程序條件為：94℃下3min；94℃下30s；55℃下30s，設(shè)置30個循環(huán)；72℃下1min；72℃下10min。反應(yīng)結(jié)束后吸取5μl的反應(yīng)產(chǎn)物，并經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳實驗進(jìn)行檢測。
c)將可能含有正確陽性重組子的克隆菌液送到生工生物公司進(jìn)行測序。
4、將測序正確的序列與實驗室已構(gòu)建的黃野螟cdna文庫中的超氧化物歧化酶基因5′端序列進(jìn)行不重復(fù)拼接，去掉相互重疊的部分，從而獲得了黃野螟超氧化物歧化酶基因全長序列。