本發(fā)明涉及腦卒中的輔助診斷
技術領域:
,特別涉及一種輔助診斷腦卒中的檢測試劑盒及其檢測方法,尤其指一種能用于檢測與腦卒中相關的二氫葉酸還原酶基因啟動子區(qū)甲基化程度的檢測試劑盒及其檢測方法。
背景技術:
:腦卒中(cerebralstroke)是一種急性腦血管疾病,是由于腦部血管突然破裂或因血管阻塞導致血液不能流入大腦而引起腦組織損傷的一組疾病,包括缺血性和出血性卒中。腦卒中具有發(fā)病率高、死亡率高和致殘率高的特點,臨床表現為嚴重頭痛、昏厥、失去意識等,這也成為了中國成年人殘疾的首要原因。腦卒中患者需要長期服用降壓藥,定期進行常規(guī)檢查,控制顱內壓,可見腦卒中患者給社會和家庭帶來了極大的經濟負擔。腦卒中是一種由遺傳和環(huán)境因素共同作用引起的復雜性疾病,對腦卒中發(fā)病機制的探索進而尋找出適合診斷治療藥物已然成為了現今研究的一個熱點。而在腦卒中的發(fā)病機制尚未清晰闡明的情況下,對腦卒中的預防以及早期檢測更是刻不容緩。二氫葉酸還原酶(dihydrofolatereductase,dhfr)是一種蛋白編碼基因,它能夠催化二氫葉酸轉化為四氫葉酸。該蛋白的缺乏會導致同型半胱氨酸水平升高,進而提高腦卒中的患病風險。二氫葉酸還原酶是由位于第5號染色體的二氫葉酸還原酶基因(dihydrofolatereductasegene,dhfr)(chr5:79950220—79950350)編碼而成的。現在國內外的研究已經確定同型半胱氨酸水平與腦卒中的發(fā)生有著較大的關聯,但是對同型半胱氨酸水平的影響因素與其調控機制的研究較少。目前,國內外還沒有公開任何關于用于檢測與腦卒中相關的二氫葉酸還原酶基因啟動子區(qū)甲基化程度的檢測試劑盒相關研究報道。技術實現要素:本發(fā)明所要解決的技術問題是針對現有技術的現狀,提供檢測方便、針對性強、檢測準確率高的一種輔助診斷腦卒中的檢測試劑盒;通過對樣品dna甲基化水平測定輔助診斷腦卒中,檢測方法簡單、檢測效率高。本發(fā)明解決上述技術問題所采用的技術方案為:一種輔助診斷腦卒中的檢測試劑盒,所述的檢測試劑盒包含一對二氫葉酸還原酶基因啟動子區(qū)甲基化特異性擴增引物,所述的一對二氫葉酸還原酶基因啟動子區(qū)甲基化特異性擴增引物包括甲基化特異性上游引物和甲基化特異性下游引物:所述的甲基化特異性上游引物包括以下核苷酸序列:5’-tatttgagcggtggttag-3’;所述的甲基化特異性下游引物包括以下核苷酸序列:5’-tctactataacgaacgaactc-3’。一種輔助診斷腦卒中的檢測試劑盒的檢測方法:其特征是:包括以下步驟:步驟一、提取樣本的全血基因組dna,并檢測所得dna的濃度;步驟二、采用甲基化試劑盒對樣本dna進行亞硫酸氫鹽轉化;步驟三、熒光定量實時特異性pcr前期準備:在引物含量為10um條件下,分別加入primerte或ddh2o進行稀釋;步驟四、進行熒光定量實時特異性pcr:取步驟二中轉化過的dna樣本20ng加入到zymotaqtmpremix酶,并加入一對二氫葉酸還原酶啟動子區(qū)甲基化特異性擴增引物,進行pcr擴增;步驟五、對結果進行甲基化程度分析。為優(yōu)化上述技術方案,采取的具體措施還包括:上述的步驟一中采用lab-aid820全自動核酸提取儀提取全血基因組dna,再通過nanodrop2000超微量分光光度計檢測dna的濃度。上述的步驟二中采用ezdnamethylation-gold試劑盒對樣本dna進行亞硫酸氫鹽轉化。上述的步驟四中pcr擴增條件為:首先95℃10min的預變性;接著95℃20s,tm20s,72℃30s,共45個循環(huán)的退火反應;然后延伸反應40℃10min。本發(fā)明一種輔助診斷腦卒中的檢測試劑盒及其檢測方法,所述的檢測試劑盒包含一對二氫葉酸還原酶基因啟動子區(qū)甲基化特異性擴增引物,所述的一對二氫葉酸還原酶基因啟動子區(qū)甲基化特異性擴增引物包括甲基化特異性上游引物和甲基化特異性下游引物;通過檢測與腦卒中相關的二氫葉酸還原酶基因啟動子區(qū)甲基化程度輔助診斷腦卒中,簡單、方便,檢測效率高,針對性強,具有準確可靠、靈活快速和經濟節(jié)約的優(yōu)點,有利于腦卒中的早期發(fā)現和及時治療。其具有以下優(yōu)點:1)高效、準確本產品采用熒光定量pcr技術,具有實時監(jiān)測,特異性強,精確定量的優(yōu)勢,確保診斷結果的精確性。2)方便、快捷本產品是基于血漿、唾液、尿液等體液檢查的試劑盒,隨時隨地提取病人體液送檢,并且能在較短時間內取得診斷結果。3)舒適、安全本產品采用非侵入式檢測,告別入侵式的痛苦。同時,在檢測過程中,對人體不存在任何的隱性或者顯性的危險。4)經濟、節(jié)約本產品相較于已有的診斷方式僅需較低的經濟費用,易于為大眾所接受,且避免了倫理侵犯問題。附圖說明圖1是被檢測序列所在區(qū)域以及cpg位點的相關性示意圖;圖2是深圳地區(qū)病例組與對照組間的比較表圖(表1);圖3是寧波地區(qū)病例組與對照組間的比較表圖(表2);圖4是深圳與寧波地區(qū)病例組間的比較表圖(表3);圖5是深圳與寧波地區(qū)對照組間的比較表圖(表4);圖6是深圳與寧波地區(qū)各疾病組與對照組間的相關性比較表圖(表5)。具體實施方式以下結合附圖實施例對本發(fā)明作進一步詳細描述。一種輔助診斷腦卒中的檢測試劑盒,所述的檢測試劑盒包含一對二氫葉酸還原酶基因啟動子區(qū)甲基化特異性擴增引物,所述的一對二氫葉酸還原酶基因啟動子區(qū)甲基化特異性擴增引物包括甲基化特異性上游引物和甲基化特異性下游引物:所述的甲基化特異性上游引物包括以下核苷酸序列:5’-tatttgagcggtggttag-3’;所述的甲基化特異性下游引物包括以下核苷酸序列:5’-tctactataacgaacgaactc-3’。一種輔助診斷腦卒中的檢測試劑盒的檢測方法:其特征是:包括以下步驟:步驟一、采用lab-aid820全自動核酸提取儀提取全血基因組dna,再通過nanodrop2000超微量分光光度計檢測dna的濃度;全血基因組dna來自于被檢測者的血漿、唾液、尿液等體液。步驟二、采用甲基化試劑盒對樣本dna進行亞硫酸氫鹽轉化;全基因組dna中的胞嘧啶(c)與亞硫酸氫鹽反應會使單鏈中未甲基化的胞嘧啶轉變?yōu)樾叵汆奏?t),而單鏈中已發(fā)生甲基化的胞嘧啶則不轉變?yōu)樾叵汆奏?。根據這一原理,通過使用zymoresearch公司的ezdnamethylation-gold試劑盒,經上樣、洗滌、洗脫等步驟得到轉化后的dna。步驟三、熒光定量實時特異性pcr(qmsp)前期準備:在引物含量為10um條件下,分別加入primerte或ddh2o進行稀釋。qmsp所需物質包括水、酶、引物、模板,其中、基因啟動子區(qū)甲基化特異性擴增引物(含有上游引物和下游引物)已包括在本發(fā)明檢測試劑盒之中,而引物在加樣之前則需進行稀釋。步驟四、進行熒光定量實時特異性pcr:1)取步驟二中轉化過的dna樣本20ng加入到zymotaqtmpremix酶,并加入一對二氫葉酸還原酶啟動子區(qū)甲基化特異性擴增引物。最終體系中包含有水、酶、引物、模板。根據模板及引物的數量,合理設計加樣順序及內容。體系中各種成分的含量如下:試劑體積2xsybrgreeni5.00ulprimerf(10um)0.25ulprimerr(10um)0.25ulddh2o3.50ultemplate(diluted)1.00ul2)熒光定量pcr儀測定,1、先進行10分鐘的預變性。2、完成45個pcr循環(huán),分別為變性、退火與延伸3、獲得溶解曲線。4、機器降溫后讀取結果。其設定程序見下表:步驟五、對結果進行甲基化程度分析。這里,運用相關軟件(lightcycler?480_software)計算得出數據,整理統(tǒng)計。二氫葉酸還原酶(dihydrofolatereductase,dhfr)是一種蛋白編碼基因,它能夠催化二氫葉酸轉化為四氫葉酸。二氫葉酸還原酶基因啟動子區(qū)域的高甲基化水平會導致該基因的低表達甚至表達沉默,導致具有輔酶活性的四氫葉酸下降引起同型半胱氨酸水平升高,進而成為腦卒中的一個極大的患病風險。因此,二氫葉酸還原酶基因啟動子區(qū)甲基化水平與腦卒中的患病率呈正相關。本發(fā)明研制出一種以特異性檢測腦卒中相關基因甲基化水平為基礎,方便快捷地在分子水平上實現對腦卒中的檢測的試劑盒,此種方法檢測效率高,針對性強。下面通過實驗證明二氫葉酸還原酶基因啟動子區(qū)甲基化水平與腦卒中的患病率呈正相關。1、研究對象的收集從深圳和寧波地區(qū)的醫(yī)院收集腦卒中患者樣本,患者確診采用“fast”判斷法并結合最新式的儀器診斷技術后確定深圳地區(qū)腦卒中病人172例作為病例組(66.23±9.07歲)和年齡匹配且無腦卒中家族史的325名正常者作為對照組(66.00(60.00,72.00)歲);收集寧波地區(qū)腦卒中病人56例作為病例組(62.98±11.70歲)和年齡匹配且無腦卒中家族史的137名正常者作為對照組(63.57±10.24歲)對所有研究對象在知情同意的前提下,抽血檢測尿酸水平、甘油三酯等一般生化指標,同時抽取靜脈血3ml入edta抗凝管中,-80℃低溫儲存,以備用于標本統(tǒng)一提取基因組dna。2、基因組dna的提取應用lab-aid820全自動核酸提取儀(中國廈門,致善生物科技)提取上述步驟得到的樣本的全血基因組dna,再通過nanodrop2000超微量分光光度計(美國,thermofisherscientific)檢測所得dna的濃度,以供dhfr基因啟動子區(qū)dna甲基化水平的檢測。3、dna甲基化水平測定本實驗采用熒光定量實時pcr(qmsp)對dhfr基因啟動子區(qū)的cpg位點(如圖1)進行dna甲基化水平分析。此技術的基本原理:利用熒光技術對基因序列進行標記,并使得基因序列在進行擴增時能夠被靈敏檢測。經由聚合酶鏈反應(pcr)之后,使得基因序列進行倍數擴增,每一個血樣對應不同的擴增曲線。曲線與既設閾值相交的橫坐標點即為對應ct值(每個反應管內的熒光信號到達設定閾值時經歷的循環(huán)數)。甲基化參考值的百分比(pmr)用2?δδct量化方法,即δδct=dna樣本(ct靶基因-ctactb)—完全dna甲基化樣本(ct靶基因-ctactb),得出具體的甲基化率。用于實驗的pcr擴增引物如下:甲基化特異性上游引物包括以下核苷酸序列:5’-tatttgagcggtggttag-3’;甲基化特異性下游引物包括以下核苷酸序列:5’-tctactataacgaacgaactc-3’。4、驗證所得數據的準確性利用測序技術對qmsp所得甲基化率的準確性進行驗證。5、數據分析本次實驗采集大量的臨床數據并得出一系列實驗數據,采用spss16.0對數據進行整理分析。從統(tǒng)計學角度考量,p值小于0.05具有統(tǒng)計學意義。由表1可見:基因啟動子區(qū)域高甲基化是導致腦卒中患者發(fā)病的一個較大危險因素(pc=1.12e-08),而高血壓等潛在的因素也會大大提高腦卒中患者的患病風險,他們之間的甲基化水平差異有著較好的統(tǒng)計學意義(pa=3.38e-12)。據表3可知寧波地區(qū)和深圳地區(qū)的腦卒中患者的甲基化率存在顯著差異,且在年齡和生化指標tg表現出明顯的差異。由表3和表4顯示寧波地區(qū)和深圳地區(qū)的正常人的諸多生化指標(如ua、tg、tc等)皆有著明顯的不同(p<0.05),據表5可知,僅深圳地區(qū)age,ua與腦卒中的相關性有統(tǒng)計學意義,可見地域因素也是腦卒中患者發(fā)病的一個不容忽視的原因。本發(fā)明挑選出dhfr基因的啟動子區(qū)域作為研究對象,由圖1中“a”部分可知被檢測序列所在區(qū)域具體位置為chr5:79950220—79950350,據此進行后續(xù)甲基化分析;由圖1中“b”部分的dna序列分析結果表明,模板dna的亞硫酸氫鹽轉化成功;圖1中“c”部分顯示毛細管電泳證實擴增片段長度為131bp。注:圖表中n表示樣本個數,p值是兩個數組之間進行對照的結果,若其小于0.05,則表示這兩個數組間具有較大的統(tǒng)計學差異,表述為陽性結果,用字符加粗來強調。pa是腦卒中患者與高血壓患者進行對比的結果;pb是腦卒中患者與正常人進行對比的結果;pc是高血壓患者與正常人進行對比的結果。不符合正態(tài)分布的數據,用中位數(四分位數)來表示,其計算所得p值后加#;符合正態(tài)分布的數據,用平均數±方差來表示,其計算所得p值后加*,具有其合理性。本發(fā)明的最佳實施例已被闡明,由本領域普通技術人員做出的各種變化或改型都不會脫離本發(fā)明的范圍。sequencelisting<110>寧波市疾病預防控制中心<120>一種輔助診斷腦卒中的檢測試劑盒及其檢測方法<130><160>2<170>patentinversion3.3<210>1<211>18<212>dna<213>人工序列<400>1tatttgagcggtggttag18<210>2<211>21<212>dna<213>人工序列<400>2tctactataacgaacgaactc21當前第1頁12