本發(fā)明涉及一種基因組敲除文庫的構(gòu)建方法。

背景技術(shù)：

基因敲除，是指利用基因工程技術(shù)手段，對染色體中特定基因或位點(diǎn)進(jìn)行修飾，從而達(dá)到使其表達(dá)沉默的一種基因工程技術(shù)。crispr/cas9系統(tǒng)源自于細(xì)菌中免疫相關(guān)機(jī)制，自2013年以來，眾多文章闡述其作用于真核細(xì)胞中的基因編輯作用。crispr/cas9系統(tǒng)包括兩部分：具有核酸酶性質(zhì)的cas9蛋白以及包含靶位點(diǎn)序列片段與guiderna二級(jí)結(jié)構(gòu)的guiderna。其原理為：guiderna中靶位點(diǎn)序列片段特異性地與基因組靶位點(diǎn)結(jié)合并引導(dǎo)cas9蛋白對基因組靶位點(diǎn)進(jìn)行切割，使其產(chǎn)生雙鏈dna斷裂，有概率發(fā)生堿基丟失或添加，在非同源末端連接發(fā)生后導(dǎo)致該位點(diǎn)遺傳信息改變。利用此系統(tǒng)能夠高效地對目的基因進(jìn)行敲除，從而達(dá)到相應(yīng)目的。crispr/cas9系統(tǒng)作為新興的強(qiáng)有力的基因編輯以及遺傳篩選工具，一經(jīng)發(fā)現(xiàn)便被廣泛的研究和應(yīng)用。相比于早于其而出現(xiàn)的基因編輯工具鋅指核酸酶(zfns)以及轉(zhuǎn)錄激活因子樣的效應(yīng)因子(talen)，其最大的優(yōu)勢在于構(gòu)造上更為簡單高效。

利用crispr/cas9系統(tǒng)進(jìn)行基因編輯時(shí)，靶位點(diǎn)的選定需滿足如下條件：guiderna中與靶位點(diǎn)結(jié)合部位需緊鄰原間隔序列(pam)，即pam上游臨近的20bp左右的dna序列為guiderna靶序列片段。guiderna結(jié)構(gòu)序列部分為共通部分，不受靶位點(diǎn)影響，其作用是與cas9蛋白結(jié)合，在dna雙鏈上產(chǎn)生缺口。因此在crispr/cas9系統(tǒng)的應(yīng)用過程中僅需更改guiderna靶序列片段即可實(shí)現(xiàn)對于不同靶位點(diǎn)的編輯。

近年來，針對全基因組范圍內(nèi)設(shè)計(jì)的grna文庫被應(yīng)用于哺乳動(dòng)物的遺傳學(xué)基因功能的篩查中，利用crispr/cas9敲除文庫對實(shí)驗(yàn)材料的某一生物學(xué)過程進(jìn)行篩選，最終獲得該生物學(xué)過程相關(guān)的基因。crispr/cas9敲除文庫即guiderna文庫的優(yōu)劣在于是否能夠最大限度地覆蓋基因組中潛在的相關(guān)基因。人工設(shè)計(jì)guiderna需要對研究物種基因組注釋為參照，但迄今只有小鼠與人類基因組注釋水平較高，其他物種注釋不完全，且人工設(shè)計(jì)guiderna需要篩選候選基因，在此過程中不免遺漏基因或未注釋基因。盡管當(dāng)前技術(shù)可以通過寡合苷酸基因合成的方式合成任意需要的grna，但盡可能高效的覆蓋全基因組基因仍受限于實(shí)驗(yàn)材料基因組的解析程度以及合成過程中人力、財(cái)力、物力的消耗。解決上述問題是目前crispr/cas9敲除文庫構(gòu)建工作的瓶頸因素。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明是要解決現(xiàn)有敲除文庫構(gòu)建方法存在物種基因信息不完善、人工設(shè)計(jì)覆蓋度低且耗時(shí)耗力的問題，提供一種通過酶切基因組構(gòu)建crispr/cas9基因組敲除文庫的方法。

本發(fā)明通過酶切基因組構(gòu)建crispr/cas9基因組敲除文庫的方法，包括以下步驟：

一、構(gòu)建mspl.f-library文庫

1)為了用于后續(xù)靶序列的連接，首先構(gòu)建出c1-f.mspi-mmei載體：通過基因合成的方式合成含有acli、mmei、mlyi三個(gè)限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)的正向引物和反向引物，正向引物名稱為c1-f.mspi-mmei-anneal-f，序列為：5’-catgtgagtccaacgttggactcg-3’，反向引物名稱為c1-f.mspi-mmei-anneal-r，序列為：5’-gatccgagtccaacgttggactca-3’；

將兩條引物單體通過退火形成具有粘性末端的雙鏈dna，該dna片段的兩粘性末端恰好與pcii和bamhi酶切后的切口相同。

對商品化的pegfp-c1質(zhì)粒進(jìn)行pcii和bamhi雙酶切，并與退火后的雙鏈dna進(jìn)行連接，即形成含有兩個(gè)mmei酶切位點(diǎn)、一個(gè)acli酶切位點(diǎn)和兩個(gè)mlyi酶切位點(diǎn)的c1-f.mspi-mmei載體。

2)為了通過酶切基因組的方式產(chǎn)生grna，對所要研究的細(xì)胞提取基因組dna，以待研究的基因組dna為模板，采用mspi進(jìn)行酶切，該酶的特征在于其識(shí)別位點(diǎn)為ccgg，而cgg恰好為grna識(shí)別的一類pam序列，酶切后產(chǎn)生的大小不等的dna片段，片段兩端均含有cg的5’突出粘性末端；

將c1-f.mspi-mmei載體經(jīng)acli酶切，產(chǎn)生cg的5’突出粘性末端，將所獲得的大小不等的dna片段插入其中，獲得mspl.f-library文庫；

二、獲得約20bpgrna靶序列片段

1)設(shè)計(jì)并合成含有5’端生物素標(biāo)記的引物一對，引物名稱為c1-f.mspi-a&bio-f，序列為5’-gggtttcgccacctctgacttg-3’，以及引物名稱為c1-f.mspi-a&bio-r，序列為5’-gcaagtaaaacctctacaaatgtgg-3’，以mspl.f-library為模板，進(jìn)行pcr擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物為長度不等的、并且兩端均含有生物素標(biāo)記的dna片段，該片段包括mmei、mlyi酶切識(shí)別位點(diǎn)以及mspi消化基因組后的產(chǎn)物片段(產(chǎn)物片段大小不一)；

2)對步驟二1)得到的pcr產(chǎn)物進(jìn)行mmei酶切，mmei酶切位點(diǎn)位于其識(shí)別位點(diǎn)下游的18/20bp處，具有2bp的游離端，因此酶切產(chǎn)物中的目的片段包含：mlyi內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)與mmei識(shí)別位點(diǎn)及下游18/20bp，該片段一端為mmei酶切產(chǎn)生的粘性末端，另一端為帶有生物素標(biāo)記的平末端。mmei識(shí)別位點(diǎn)下游18/20bp區(qū)域?qū)⒆鳛間uiderna片段以用于構(gòu)建敲除文庫。此后，通過磁珠吸附系統(tǒng)對含酶切產(chǎn)物進(jìn)行吸附，目的片段將吸附于鏈霉親和素包被的磁珠上；

3)為了僅獲得18/20bp的guiderna片段，去除多余部分，接著利用mlyi對磁珠系統(tǒng)進(jìn)行酶切，mlyi酶切位點(diǎn)位于其識(shí)別位點(diǎn)下游5bp處，根據(jù)c1-f.mspi-mmei載體設(shè)計(jì)，mlyi酶切位點(diǎn)切割后，恰好將18/20bp的guiderna片段與多余部分分離并游離于液相，多余部分依舊吸附于磁珠表面。分離液相后即獲得18/20bp的特異guiderna片段，該片段特征為：大小約18/20bp片段，來源于基因組ccgg位點(diǎn)中cgg上游18/20bp，一端為平末端、另一端為兩堿基突出的粘性末端。該片段作為guiderna中靶向片段，連接guiderna結(jié)構(gòu)序列后便可介導(dǎo)cas9蛋白對靶位點(diǎn)進(jìn)行切割，從而達(dá)到基因敲除的目的。

其中18/20bp表示的是酶切后的雙鏈dna雙鏈長度，一條鏈長18bp，另外一條鏈經(jīng)酶切后產(chǎn)生2bp的游離端，因此另一條鏈長20bp。

三、構(gòu)建pam-f.library文庫

通過基因合成的方式合成u6啟動(dòng)子以及guiderna結(jié)構(gòu)序列并連入pegfp-c1載體中中kpni與ecori位點(diǎn)之間，獲得pam-f載體，將步驟二所獲得的約20bpgrna靶序列片段連入pam-f載體中，對pam-f載體進(jìn)行bbsi內(nèi)酶切酶切，酶切產(chǎn)物進(jìn)行補(bǔ)平并磷酸化，產(chǎn)生的平末端用于接納18/20bpguiderna片段的平末端；補(bǔ)平后進(jìn)行bsrdi內(nèi)切酶酶切，酶切獲得共計(jì)16種不同的兩堿基突出末端用于接納8/20bpguiderna片段的粘性末端。將酶切后的載體與步驟二中得到的18/20bpguiderna片段進(jìn)行連接，構(gòu)建獲得pam-f.library文庫；

四、lenti-grna-library文庫構(gòu)建

對pam-f.library文庫進(jìn)行ecori-kpni雙酶切，獲得u6-guiderna片段，將u6-guiderna片段連入商品化的慢病毒質(zhì)粒lenticrisprv2載體中，最終構(gòu)建獲得lenti-grna-library文庫。該文庫可用于病毒包裝并獲得慢病毒文庫，用于感染細(xì)胞并進(jìn)行相應(yīng)篩選實(shí)驗(yàn)。

進(jìn)一步的，步驟三中u6啟動(dòng)子的5’端具有kpni內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)，3’端具有bsrdi內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)以及切割位點(diǎn)，能夠產(chǎn)生2bp的突出端，u6啟動(dòng)子的序列如下：

ggtaccgagggcctatttcccatgattccttcatatttgcatatacgatacaaggctgttagagagataattagaattaatttgactgtaaacacaaagatattagtacaaaatacgtgacgtagaaagtaataatttcttgggtagtttgcagttttaaaattatgttttaaaatggactatcatatgcttaccgtaacttgaaagtatttcgatttcttggctttatatatcttgtggaaaggacgaaacaccnncattgc。

進(jìn)一步的，步驟三中g(shù)uiderna結(jié)構(gòu)序列的5’端具有bbsi內(nèi)切酶識(shí)別及酶切位點(diǎn)，3’端具有ecori內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)，guiderna結(jié)構(gòu)序列如下：

gaagacaagttttagagctagaaatagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtggcaccgagtcggtgcttttttgaattc。

本發(fā)明方法的流程圖如圖1所示。

本發(fā)明的有益效果：

基于crispr/cas9系統(tǒng)設(shè)計(jì)的grna文庫，對于哺乳動(dòng)物細(xì)胞中進(jìn)行系統(tǒng)遺傳學(xué)分析具有十分重要的作用。一般情況下，通過對已知的待研究的細(xì)胞基因組序列信息進(jìn)行分析，即可確定pam區(qū)臨近的20bp序列，再通過基因合成的方式合成grna文庫，但目前已知序列信息的物種并不是很多，對于未知序列信息的物種則無法進(jìn)行g(shù)rna文庫的合成。

本方法以待研究的基因組dna為底物，僅通過幾步酶切連接的方式即可加工獲得識(shí)別基因組中cgg上游位點(diǎn)的grna集合。本方法與傳統(tǒng)方法(大量設(shè)計(jì)并合成grna以獲得敲除文庫)相比，避免了物種基因信息不完善、人工設(shè)計(jì)覆蓋度低且耗時(shí)耗力等缺點(diǎn)，大大提高敲除文庫的覆蓋率，同時(shí)大大降低了生產(chǎn)成本，為廣泛物種的敲除文庫構(gòu)建提供新方法。此外，此方法不受特定細(xì)胞系的限制，載體構(gòu)建的操作簡單，十分便捷。

本發(fā)明通過能夠識(shí)別pam區(qū)的限制性內(nèi)切酶對待研究的細(xì)胞基因組進(jìn)行酶切，并通過后續(xù)幾種限制性內(nèi)切酶的簡單酶切連接，從而獲得grna文庫，這種方式不依賴于已知物種基因組序列信息，避免了物種基因信息不完善、人工設(shè)計(jì)覆蓋度低且耗時(shí)耗力等缺點(diǎn)，大大提高敲除文庫的覆蓋率；

本發(fā)明通過酶切連接的方式獲得grna文庫，相比于基因合成的方式更為簡單，大大降低了生產(chǎn)成本；本方法最終構(gòu)建獲得質(zhì)粒載體，感染細(xì)胞后，用于功能基因的篩選，質(zhì)粒dna相比grna，存在更加穩(wěn)定，當(dāng)出現(xiàn)表型后，能夠更加容易找到被基因改造的靶基因。

附圖說明

圖1為本發(fā)明通過酶切的方式構(gòu)建crispr/cas9基因敲除文庫的實(shí)施流程圖。

圖2為實(shí)施例1中熒光鏡下以及光學(xué)顯微鏡下觀察到的表達(dá)綠色熒光蛋白的pk-15細(xì)胞的一個(gè)克隆。

圖3為實(shí)施例1中熒光鏡下以及光學(xué)顯微鏡下觀察到的穩(wěn)定表達(dá)綠色熒光蛋白的一個(gè)pkpg-pi細(xì)胞系。

圖4為實(shí)施例1中對pkpg-pi細(xì)胞系經(jīng)流式細(xì)胞分析的表達(dá)綠色熒光蛋白的細(xì)胞比例。

圖5為作為對照的未經(jīng)轉(zhuǎn)染綠色熒光蛋白。

圖6為實(shí)施例1中質(zhì)粒pegfp-c1經(jīng)mspi酶切電泳結(jié)果。

圖7為實(shí)施例1中針對pegfp-c1構(gòu)建其對應(yīng)的mspl.f-library文庫，經(jīng)生物素標(biāo)記的引物pcr擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果。

圖8為實(shí)施例1中生物素標(biāo)記的pcr產(chǎn)物經(jīng)mmei酶切后電泳結(jié)果。

圖9為實(shí)施例1中pam-f.library文庫測序結(jié)果統(tǒng)計(jì)。

圖10為實(shí)施例1中轉(zhuǎn)染綠色熒光蛋白的細(xì)胞在轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)組慢病毒質(zhì)粒后流式細(xì)胞分析egfp陰性細(xì)胞比例。

圖11為實(shí)施例1中轉(zhuǎn)染綠色熒光蛋白的細(xì)胞轉(zhuǎn)染了對照組質(zhì)粒后流式細(xì)胞分析egfp陰性細(xì)胞比例。

圖12為實(shí)施例1中細(xì)胞未經(jīng)轉(zhuǎn)染綠色熒光蛋白的流式細(xì)胞分析egfp陰性細(xì)胞比例。

圖13為實(shí)施例1中轉(zhuǎn)染綠色熒光蛋白的細(xì)胞未轉(zhuǎn)染其他質(zhì)粒的流式細(xì)胞分析egfp陰性細(xì)胞比例。

具體實(shí)施方式

下面對本發(fā)明的實(shí)施例做詳細(xì)說明，以下實(shí)施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進(jìn)行實(shí)施，給出了詳細(xì)的實(shí)施方案和具體的操作過程，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于下述的實(shí)施例。

實(shí)施例1：

本實(shí)施例通過酶切基因組構(gòu)建crispr/cas9基因組敲除文庫的方法，包括以下步驟：

一、穩(wěn)定表達(dá)綠色熒光蛋白的細(xì)胞篩選

將商品化的pegfp-c1質(zhì)粒通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方式轉(zhuǎn)染pk-15細(xì)胞系，并利用g418進(jìn)行篩選，挑取穩(wěn)定表達(dá)綠色熒光蛋白的克隆繼續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)，最終獲得穩(wěn)定表達(dá)綠色熒光蛋白的pk-15細(xì)胞系，命名為pkpg-pi。

熒光鏡下以及光學(xué)顯微鏡下觀察到的表達(dá)綠色熒光蛋白的pk-15細(xì)胞的一個(gè)克隆如圖2所示，圖2中的上面為熒光鏡下照片，下面為光學(xué)顯微鏡下照片。熒光鏡下以及光學(xué)顯微鏡下觀察到的穩(wěn)定表達(dá)綠色熒光蛋白的一個(gè)pkpg-pi細(xì)胞系如圖3所示，圖3中的上面為熒光鏡下照片，下面為光學(xué)顯微鏡下照片。對pkpg-pi細(xì)胞系經(jīng)流式細(xì)胞分析的表達(dá)綠色熒光蛋白的細(xì)胞比例如圖4所示，圖5為作為對照的未經(jīng)轉(zhuǎn)染綠色熒光蛋白。可以看出對照組也就是未經(jīng)轉(zhuǎn)染綠色熒光蛋白，經(jīng)流式分選不出綠色蛋白表達(dá)的細(xì)胞，而實(shí)驗(yàn)組也就是經(jīng)轉(zhuǎn)染綠色熒光蛋白，經(jīng)流式分選，97.4％細(xì)胞都表達(dá)綠色熒光蛋白而被篩選出來。

二、針對pegfp-c1構(gòu)建其敲除文庫

(1)以pegfp-c1質(zhì)粒為底物，利用mspi內(nèi)切酶對其進(jìn)行酶切，酶切產(chǎn)物的特點(diǎn)為：24種長度不等的具有cg粘性末端的dna片段，將該酶切產(chǎn)物連入c1-f.mspi-mmei載體中acli位點(diǎn)中，獲得pegfp-c1質(zhì)粒的mspl.f-library文庫，其中插入的dna片段兩端均相鄰有mmei與mlyi內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)；質(zhì)粒pegfp-c1經(jīng)mspi酶切電泳結(jié)果如圖6所示。

(2)利用具有生物素標(biāo)記的引物，對pegfp-c1質(zhì)粒的mspl.f-library文庫進(jìn)行pcr擴(kuò)增，得到的擴(kuò)增產(chǎn)物中包括有mspi酶切產(chǎn)生的片段以及mmei與mlyi識(shí)別位點(diǎn)，且擴(kuò)增產(chǎn)物兩端均有生物素標(biāo)記。對擴(kuò)增產(chǎn)物利用mmei進(jìn)行酶切，酶切產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳分離后回收并純化大小約為140bp與75bp兩片段，同時(shí)利用鏈霉親和素包被的磁珠對其進(jìn)行吸附；針對pegfp-c1構(gòu)建其對應(yīng)的mspl.f-library文庫，經(jīng)生物素標(biāo)記的引物pcr擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果如圖7所示。生物素標(biāo)記的pcr產(chǎn)物經(jīng)mmei酶切后電泳結(jié)果如圖8所示，其中140bp與75bp兩片段為目的片段，即包含mlyi內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)與mmei識(shí)別位點(diǎn)及下游18/20bp。

其中鏈霉親和素包被的磁珠為市售產(chǎn)品，商品名稱dynabeads^tmmyone^tmstreptavidinc1,生產(chǎn)公司invitrigen，貨號(hào)65001。

(3)以吸附產(chǎn)物作為底物，利用mlyi內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，酶切后的體系中，18/20bp的guiderna片段游離于液相，而其他剩余dna片段仍吸附于磁珠上，分離磁珠與液相，回收液相上清液；

(4)利用pam-f載體中補(bǔ)平后的bbsi與bsrdi位點(diǎn)，將上清液連入其中，獲得pegfp-c1質(zhì)粒的pam-f.library文庫；

(5)將pam-f.library文庫中的u6-guiderna結(jié)構(gòu)連入商品化的慢病毒質(zhì)粒lenticrisprv2的eori-kpni間，即獲得pegfp-c1質(zhì)粒的敲除文庫——lenti-grna-library文庫，該文庫可用于慢病毒包裝，最終獲得針對pegfp-c1質(zhì)粒的敲除文庫病毒。

pam-f.library文庫測序統(tǒng)計(jì)結(jié)果如圖9所示，圖9中a表示egfp外來源guiderna，b表示egfp來源guiderna。成功的載體中18/20bpguiderna片段來源統(tǒng)計(jì)，15個(gè)成功載體中5個(gè)guiderna來源于egfp，其余對應(yīng)在pegfp-c1中egfp以外的區(qū)域。

三、慢病毒的包裝

將hek293t細(xì)胞接種于10cm直徑的細(xì)胞皿中，使用聚氮丙啶(pei)將10μg的lenti-grna-library文庫和兩包裝質(zhì)粒7.5ug的pspax2和5ug的pmd2.g轉(zhuǎn)入細(xì)胞，72小時(shí)后收獲病毒液并濃縮；

四、病毒的感染及篩選

將pkpg-pi細(xì)胞接種于35mm細(xì)胞皿中，用上述病毒液按moi＝0.05進(jìn)行感染，作為實(shí)驗(yàn)組，命名為libgroup；以對照guiderna相應(yīng)病毒感染作為對照組，命名為ctrlgroup；非感染組作為空白對照組，命名為nullgroup。感染后的第二天加入2ug/ml的嘌呤霉素進(jìn)行篩選5天；

五、綠色熒光蛋白敲除效率檢測

在感染后的第13天進(jìn)行細(xì)胞的收集，對綠色熒光蛋白敲除效率進(jìn)行檢測。通過流式細(xì)胞儀分析各組細(xì)胞，獲得各組中egfp陽性細(xì)胞比例，與對照組和空白對照組的egfp陽性率相比(8.3％，6.6％)，實(shí)驗(yàn)組egfp陽性率增加(20.5％)，即通過本方法獲得的針對pegfp-c1質(zhì)粒的敲除文庫具有敲除egfp的功能。

流式細(xì)胞分析egfp陰性細(xì)胞比例如圖10-圖13所示。圖10表示轉(zhuǎn)染綠色熒光蛋白的細(xì)胞在轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)組慢病毒質(zhì)粒后有20.5％無綠色熒光信號(hào)，圖11表示轉(zhuǎn)染綠色熒光蛋白的細(xì)胞轉(zhuǎn)染了對照組質(zhì)粒(不會(huì)進(jìn)行基因敲出)，8.1％的細(xì)胞無綠色熒光信號(hào)，圖12表示細(xì)胞未經(jīng)轉(zhuǎn)染綠色熒光蛋白，100％未綠，圖13表示轉(zhuǎn)染綠色熒光蛋白的細(xì)胞未轉(zhuǎn)染其他質(zhì)粒，也是一個(gè)對照組6.6％的細(xì)胞無綠色熒光信號(hào)。

這一結(jié)果表明通過本方法獲得的針對pegfp-c1質(zhì)粒的敲除文庫具有敲除egfp的功能。

序列表

<110>東北農(nóng)業(yè)大學(xué)

<120>一種通過酶切基因組構(gòu)建crispr/cas9基因組敲除文庫的方法

<160>6

<210>1

<211>24

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>引物c1-f.mspi-mmei-anneal-f

<400>1

catgtgagtccaacgttggactcg24

<210>2

<211>24

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>引物c1-f.mspi-mmei-anneal-r

<400>2

gatccgagtccaacgttggactca24

<210>3

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>引物c1-f.mspi-a&bio-f

<400>3

gggtttcgccacctctgacttg22

<210>4

<211>25

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>引物c1-f.mspi-a&bio-r

<400>4

gcaagtaaaacctctacaaatgtgg25

<210>5

<211>263

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>u6啟動(dòng)子序列

<400>5

ggtaccgagggcctatttcccatgattccttcatatttgcatatacgatacaaggctgtt60

agagagataattagaattaatttgactgtaaacacaaagatattagtacaaaatacgtga120

cgtagaaagtaataatttcttgggtagtttgcagttttaaaattatgttttaaaatggac180

tatcatatgcttaccgtaacttgaaagtatttcgatttcttggctttatatatcttgtgg240

aaaggacgaaacaccnncattgc263

<210>6

<211>96

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>guiderna結(jié)構(gòu)序列

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