本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，特別涉及植物作為宿主在表達(dá)溶血蛋白中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

t-pa(組織型纖溶酶原激活劑)，tnkase(替奈譜酶)，r-pa(瑞替譜酶)是fda批準(zhǔn)治療心血管疾病，急性大體積肺栓塞以及心肌梗死的最佳藥物。其中，t-pa是治療急性中風(fēng)的唯一有效藥物。tnkase是t-pa的多點(diǎn)變異體，主要是治療急性心肌梗塞。r-pa是t-pa的缺失突變體，這些突變導(dǎo)致半衰期延長(zhǎng)，從而使瑞替普酶可用靜脈注射法給藥，適用于急性心肌梗急性心肌梗死、肺栓塞、缺血性腦卒中等。商業(yè)化t-pa以及tnkase主要是利用中國倉鼠卵巢細(xì)胞(cho)生產(chǎn)，r-pa是利用重組大腸桿菌生產(chǎn)。

現(xiàn)階段有利用動(dòng)物細(xì)胞生產(chǎn)t-pa(組織型纖溶酶原激活劑)，tnkase(替奈譜酶)的報(bào)道。但是動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)需要價(jià)格昂貴的培養(yǎng)液，嚴(yán)格的廠房條件，操作復(fù)雜，時(shí)間周期至少兩周，而且動(dòng)物細(xì)胞生產(chǎn)能力低，造成成本極高。有時(shí)候動(dòng)物細(xì)胞所帶的病毒可以侵染人類，造成安全性低。

現(xiàn)階段有利用大腸桿菌生產(chǎn)r-pa(瑞替譜酶)的專利。但是大腸桿菌是低等生物，不能進(jìn)行表達(dá)后的蛋白修飾過程。而且表達(dá)產(chǎn)品大多為包涵體形式，沒有生物活性。蛋白復(fù)性過程操作復(fù)雜，使得最終純化產(chǎn)品生產(chǎn)能力低，造成成本極高。

以細(xì)菌作為生物反應(yīng)器生產(chǎn)重組蛋白具有快速以及高產(chǎn)的特點(diǎn)，但由于細(xì)菌屬于原核生物，不具備真核生物的蛋白質(zhì)合成與加工系統(tǒng)，而一些蛋白質(zhì)的生物活性是依靠蛋白質(zhì)的修飾來達(dá)到的，所以，它的應(yīng)用受到了限制。而且好多在細(xì)菌中表達(dá)的蛋白是以包涵體形式存在，變性復(fù)性過程都極大的增加了成本。利用動(dòng)物細(xì)胞，如cho，表達(dá)人體醫(yī)用蛋白活性比較高，但是動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的成本極高，大規(guī)模生產(chǎn)需要巨大的投資，對(duì)廠房的要求極高，而且動(dòng)物細(xì)胞如果污染病毒，可以侵染人類，造成安全隱患。由于動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)不易，造成其生產(chǎn)的重組蛋白價(jià)格昂貴，在醫(yī)藥上的應(yīng)用也受到限制。因而急需一個(gè)高效、安全的表達(dá)系統(tǒng)來滿足巨大的市場(chǎng)需求。

利用植物系統(tǒng)，比如煙草，生產(chǎn)重組蛋白具有表達(dá)水平高，生產(chǎn)的重蛋白具有活性，生產(chǎn)成本低等優(yōu)勢(shì)，但是煙草含有尼古丁，煙堿，各種有毒酚類物質(zhì)，造成下游純化工藝?yán)щy，不易純化，成本高本。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

有鑒于此，本發(fā)明提供植物作為宿主在表達(dá)溶血蛋白中的應(yīng)用。本發(fā)明采用水稻儲(chǔ)藏醇溶谷蛋白gt13a為胚乳特異性表達(dá)的啟動(dòng)子和信號(hào)肽，采用農(nóng)桿菌作為轉(zhuǎn)基因載體，采用粳稻品種臺(tái)北309種子成熟的胚乳為遺傳轉(zhuǎn)化的受體，采用雙農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法，將t-pa、tnkase或r-pa分別導(dǎo)入水稻種子中，獲得的轉(zhuǎn)基因水稻種子重組蛋白具有溶栓活性。本發(fā)明所得的重組人溶血蛋白具有表達(dá)體系穩(wěn)定、表達(dá)效率高、成本低，規(guī)?；a(chǎn)容易、生物活性高、無病原菌污染等優(yōu)點(diǎn)?？梢源笠?guī)模生產(chǎn)來滿足市場(chǎng)需求。

為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案：

本發(fā)明提供了植物作為宿主在表達(dá)溶血蛋白中的應(yīng)用。

在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，所述溶血蛋白選自t-pa、tnkase或r-pa。

在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，所述植物選自水稻、小麥、大豆、玉米、煙草或高粱。

在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了水稻種子作為宿主在表達(dá)t-pa(組織型纖溶酶原激活劑)中的應(yīng)用。

在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了植物種子尤其是水稻種子作為宿主在表達(dá)tnkase(替奈譜酶)或r-pa(瑞替譜酶)中的應(yīng)用。

種子表達(dá)體系是目前規(guī)?；a(chǎn)較為成熟的表達(dá)體系之一。種子能夠提供一個(gè)相對(duì)穩(wěn)定的內(nèi)環(huán)境，使重組蛋白表達(dá)積累到一個(gè)較高水平；同時(shí)，種子是最佳的“天然容器”，重組蛋白在常溫下儲(chǔ)藏2～3年而不喪失生物活性，并且由于重組蛋白貯藏在一個(gè)很小的空間，產(chǎn)品運(yùn)輸十分便利。

在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，所述植物的器官為種子、葉片或根莖。

較好的種子表達(dá)體系是利用水稻進(jìn)行表達(dá)和生產(chǎn)。水稻是我國乃至亞洲的主要糧食作物，亞洲種植面積占全球的92％；在我國具有5000多年的栽培歷史，我國種植面積為4.4億畝，產(chǎn)量占世界水稻產(chǎn)量的31％，水稻學(xué)名為oryzasatival.sp，俗名為水稻，水稻屬于禾本科、稻屬，兩個(gè)為栽培種即亞洲栽培稻oryza.sativa和非洲栽培oryza.glaberrima，普通栽培稻(oryzasativa)可以種植。在栽培稻種又分為秈稻和粳稻兩個(gè)亞種。臺(tái)北309是我國臺(tái)灣育成的品種。在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中所述水稻的品種為粳稻品種臺(tái)北309。

本發(fā)明還提供了一種表達(dá)載體，包括雙元植物載體以及上述應(yīng)用中的溶血蛋白的核苷酸序列。

在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，所述載體包括包含目的基因的農(nóng)桿菌和包含標(biāo)記基因的農(nóng)桿菌。

在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，所述標(biāo)記基因?yàn)槌泵顾亓姿徂D(zhuǎn)移酶基因。

在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，所述載體為農(nóng)桿菌lba4404。

在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，所述表達(dá)載體的構(gòu)建方法包括如下步驟：

步驟1：分別將t-pa、tnkase或r-pa的密碼子優(yōu)化為水稻密碼子，獲得優(yōu)化后的序列，分別記為優(yōu)化后的t-pa核苷酸序列、優(yōu)化后的tnkase核苷酸序列或優(yōu)化后的r-pa核苷酸序列；

所述優(yōu)化后的t-pa核苷酸序列如seqidno.2所示；

所述優(yōu)化后的tnkase核苷酸序列如seqidno.4所示；

所述優(yōu)化后的r-pa核苷酸序列如seqidno.6所示。

步驟2：在所述優(yōu)化后的t-pa核苷酸序列、優(yōu)化后的tnkase核苷酸序列或優(yōu)化后的r-pa核苷酸序列的5’末端分別加入mlyl限制性酶切位點(diǎn)，在3’末端分別加入xhol限制性酶切位點(diǎn)，克隆到puc57載體中，分別獲得克隆載體puc-tpa、puc-tnkase或puc-rpa；

步驟3：通過mlyl/xhol從分別所述puc-tpa，puc-tnkase或puc-rpa克隆載體中獲得基因片段tpa、tnkase或r-pa，并克隆至雙元植物載體pcam-gt13a中，獲得表達(dá)載體pcam-tpa、pcam-tnkase或pcam-rpa。

具體的，本發(fā)明提供的表達(dá)載體的構(gòu)建方法具體為：

基于drugbank(t-pa，accessionno：db00015；r-pa，accessionno：db00015以及tnkase，accessionno：d6070)全長(zhǎng)氨基酸序列，通過反翻譯軟件，并且將密碼子優(yōu)化為水稻密碼子(見氨基酸序列如seqidno.1、seqidno.3、seqidno.5所示以及優(yōu)化的dna序列如seqidno.2、seqidno.4、seqidno.6所示)。將限制性位點(diǎn)mlyl以及xhol位點(diǎn)分別添加到優(yōu)化序列片段的5'末端以及3'末端，由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，克隆到puc57載體中(圖1)，得到克隆載體puc-tpa，puc-tnkase以及puc-rpa。通過mlyl以及xhol從puc-tpa，puc-tnkase以及puc-rpa中分離出tpa，tnkase，以及r-pa基因片段，并克隆入植物雙元載體pcam-gt13a中，以生成植物表達(dá)載體pcam-tpa，pcam-tnkase以及pcam-rpa(圖2)。隨后將植物表達(dá)載體通過multiporator(eppendorf，hamburg，germany)電穿孔轉(zhuǎn)化到根癌土壤桿菌lba4404中，用于水稻種子成熟胚愈傷組織的基因轉(zhuǎn)化。

本發(fā)明還提供了所述的表達(dá)載體在表達(dá)溶血蛋白中的應(yīng)用。

本發(fā)明還提供了一種植物作為宿主表達(dá)溶血蛋白的方法，以植物作為遺傳轉(zhuǎn)化的受體，采用載體介導(dǎo)的遺傳共轉(zhuǎn)化方法，通過表達(dá)載體將溶血蛋白的基因?qū)胫参镏?，使基因重組后的植物表達(dá)蛋白，獲得重組溶血蛋白。

具體的，本發(fā)明提供的方法是以水稻的種子成熟胚誘導(dǎo)的愈傷組織作為遺傳轉(zhuǎn)化的受體，采用載體介導(dǎo)的遺傳共轉(zhuǎn)化方法，將t-pa、tnkase或r-pa基因?qū)胨局?，使基因重組后的水稻種子表達(dá)重組人溶血蛋白。

在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，所述表達(dá)載體包括雙元植物載體以及上述應(yīng)用中的溶血蛋白的核苷酸序列。在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，所述載體包括包含目的基因的農(nóng)桿菌和包含標(biāo)記基因的農(nóng)桿菌。在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，所述標(biāo)記基因?yàn)槌泵顾亓姿徂D(zhuǎn)移酶基因。在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，所述載體為農(nóng)桿菌lba4404。在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，所述表達(dá)載體的構(gòu)建方法包括如下步驟：

步驟1：分別將t-pa、tnkase或r-pa的密碼子優(yōu)化為水稻密碼子，獲得優(yōu)化后的序列，分別記為優(yōu)化后的t-pa核苷酸序列、優(yōu)化后的tnkase核苷酸序列或優(yōu)化后的r-pa核苷酸序列；所述優(yōu)化后的t-pa核苷酸序列如seqidno.2所示；所述優(yōu)化后的tnkase核苷酸序列如seqidno.4所示；所述優(yōu)化后的r-pa核苷酸序列如seqidno.6所示。步驟2：在所述優(yōu)化后的t-pa核苷酸序列、優(yōu)化后的tnkase核苷酸序列或優(yōu)化后的r-pa核苷酸序列的5’末端分別加入mlyl限制性酶切位點(diǎn)，在3’末端分別加入xhol限制性酶切位點(diǎn)，克隆到puc57載體中，分別獲得克隆載體puc-tpa、puc-tnkase或puc-rpa；步驟3：通過mlyl/xhol從分別所述puc-tpa，puc-tnkase或puc-rpa克隆載體中獲得基因片段tpa、tnkase或r-pa，并克隆至雙元植物載體pcam-gt13a中，獲得表達(dá)載體pcam-tpa、pcam-tnkase或pcam-rpa。作為優(yōu)選，所述溶血蛋白選自t-pa、tnkase或r-pa。作為優(yōu)選，所述植物選自水稻、小麥、大豆、玉米、煙草或高粱。作為優(yōu)選，所述植物的器官為種子、葉片或根莖。作為優(yōu)選，所述水稻的品種為粳稻品種臺(tái)北309。

在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，所述遺傳共轉(zhuǎn)化方法包括如下步驟：

步驟1：獲得所述植物誘導(dǎo)的愈傷組織20～30d；

步驟2：通過所述載體轉(zhuǎn)染所述表達(dá)載體，在含有50μg/ml的潮霉素b的選擇培養(yǎng)基上篩選抗性愈傷組織45d；

步驟3：將所述愈傷組織分化成幼小植株，然后將所述幼小植株轉(zhuǎn)到生根培養(yǎng)基上，誘導(dǎo)15～20d。

在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，所述遺傳共轉(zhuǎn)化方法包括如下步驟：

步驟1：獲得種子成熟胚誘導(dǎo)的愈傷組織20～30d；

步驟2：取農(nóng)桿菌株進(jìn)行轉(zhuǎn)染，在含有50μg/ml的潮霉素b的選擇培養(yǎng)基上篩選抗性愈傷組織45d；

步驟3：將所述愈傷組織分化成幼小植株，然后將所述幼小植株轉(zhuǎn)到生根培養(yǎng)基上，誘導(dǎo)15～20d。

將上述成型的完整的植株，轉(zhuǎn)到溫室生長(zhǎng)發(fā)育成熟的種子，此為含有溶血蛋白的t1種子。

具體的，遺傳共轉(zhuǎn)化方法為：

種子成熟胚誘導(dǎo)的愈傷組織：水稻品種臺(tái)北309種子，脫去谷殼后，經(jīng)20％次氯酸鈉消毒20min，經(jīng)無菌水漂洗3次，每次10min，然后放在愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上經(jīng)20～30d的誘導(dǎo)，產(chǎn)生愈傷組織。將0.5μg的質(zhì)粒pospmp105和0.5μg具有選擇性標(biāo)記質(zhì)粒pospmp5的dna放入愈傷組織中，在室溫(20～25℃)下反應(yīng)30min，用酒精洗三次，然后采用農(nóng)桿菌株進(jìn)行轉(zhuǎn)染，目的基因和選擇性標(biāo)記基因載體隨機(jī)整合到臺(tái)北309愈傷組織的細(xì)胞中。在含有50μg/ml的潮霉素b的選擇培養(yǎng)基上經(jīng)45d的篩選，繼續(xù)生長(zhǎng)的愈傷組織為抗潮霉素b的陽性愈傷組織。將潮霉素b抗性的愈傷組織轉(zhuǎn)移到再生培養(yǎng)基上，在光照下經(jīng)20d左右的誘導(dǎo)，愈傷組織分化成綠色的小植株，然后將幼小植株轉(zhuǎn)到生根培養(yǎng)基上，經(jīng)15～20d的誘導(dǎo)，形成完整的植株，最后轉(zhuǎn)到溫室生長(zhǎng)發(fā)育成熟的種子。此為t1種子。

當(dāng)t1種子收獲后，從水稻成熟胚乳中提取蛋白。轉(zhuǎn)基因水稻樣品用攪拌器攪拌，并用體積比為1:1比例的提取緩沖液(100mmkpi，ph7.8；5mmedta；10mmβ-巰基乙醇)攪拌機(jī)中高速勻漿1～2min。將勻漿物調(diào)節(jié)至ph為8.0，用紗布過濾，過濾物在4℃以10，000g離心15min以除去細(xì)胞碎片。收集上清液，與硫酸銨(50％)混合，并在冰上搖動(dòng)孵育60min。通過離心機(jī)(10，000g)在4℃下再次分離15min。將得到的上清液進(jìn)行第二輪硫酸銨(70％)沉淀，冰上搖動(dòng)懸浮60min，再次在4℃下以10，000g離心15min。然后，棄去上清液，將處理樣品沉淀蛋白質(zhì)溶于5ml緩沖液(20mmkpi，ph7.8；2mmedta；10mmβ-巰基乙醇)中并在-20℃下儲(chǔ)存。取樣品(5μl)熱變性(95℃)加載緩沖液(biorad，hercules，ca，usa)在4～12％bis-trisplussds-變性凝膠(thermofisherscientific，waltham，ma，usa)跑電泳，然后用考馬斯藍(lán)g250(biorad)染色后再次對(duì)凝膠進(jìn)行拍照。

克隆了雙元植物表達(dá)載體pcam-tpa，pcam-tnkase以及pcam-rpa。通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)方法，成功的獲得t-pa，tnkase以及r-pa的轉(zhuǎn)基因植株。重組蛋白經(jīng)過sds-page分離(圖3)。在泳道中觀察到t-pa，tnkase以及r-pa分子量大約為55，55，40kda的條帶。在陽性對(duì)照泳道中有對(duì)應(yīng)條帶，符合對(duì)重組蛋白大小的預(yù)期。

經(jīng)纖維蛋白溶解活性測(cè)定：將瓊脂糖(0.2g)置于40ml的磷酸鹽緩沖鹽水(1xpbs)中，通過在微波中煮沸然后冷卻至約40℃。凝膠固化之前，將32mg人纖維蛋白原(sigma-aldrich，st.louis，mo，usa)，10單位人纖溶酶原(rpeptidellc，bogart，ga，usa)和10單位人類凝血酶(biopharmlaboratoriesllc，bluffdale，ut，usa)加入到凝膠中并輕微旋轉(zhuǎn)混合以防止引入氣泡。然后將混合物倒入培養(yǎng)皿中并使其在室溫下固化。隨后在固化凝膠中制成孔(3mm直徑)。將10μl濃縮樣品(1μg/μl)稀釋在40μl的1xpbs緩沖液中，裝入凝膠孔中，并在室溫下孵育過夜。使用購買的標(biāo)準(zhǔn)的t-pa，tnkase，以及r-pa作為陽性對(duì)照(10μg)，測(cè)量清晰暈圈的實(shí)際直徑(mm)。

t-pa，tnkase，以及r-pa可以將纖溶酶原轉(zhuǎn)化為纖溶酶，導(dǎo)致纖維蛋白溶解以及溶解血栓。在本發(fā)明中，纖維蛋白平板測(cè)定顯示植物來源的重組蛋白具有明顯溶解纖維蛋白的活性(圖4)。在商用以及重組t-pa，tnkase，以及r-pa蛋白的周圍顯示半透明的暈圈區(qū)。商用以及重組的溶解區(qū)域直徑大小一致，明重組蛋白活性與商用蛋白活性基本一致。

本發(fā)明提供了一種以水稻種子為生物反應(yīng)器生產(chǎn)重組t-pa(組織型纖溶酶原激活劑，阿替普酶，reteplase或者alteplase),tnkase(替奈譜酶，tenecteplase)，r-pa(瑞替譜酶，reteplase)的方法，將水稻的種子成熟胚誘導(dǎo)的愈傷組織作為遺傳轉(zhuǎn)化的受體，采用載體介導(dǎo)的遺傳共轉(zhuǎn)化方法，將t-pa,tnkase，r-pa基因?qū)胨局?，使基因重組后的水稻種子表達(dá)重組人溶血蛋白。同大腸桿菌相比較，水稻種子可以自動(dòng)表達(dá)活性的重組蛋白，不穿變性復(fù)性過程。同時(shí)，水稻種子里面也不含有煙草所具有的有尼古丁，煙堿，等各種有毒酚類物質(zhì)。同動(dòng)物細(xì)胞生產(chǎn)系統(tǒng)比較，水稻本身不帶有可以侵染人類的病毒，產(chǎn)品安全性較高，而且水稻可以大規(guī)模種植，對(duì)廠房條件不高，易于實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。

附圖說明

為了更清楚地說明本發(fā)明實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對(duì)實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡(jiǎn)單地介紹。

圖1示puc57質(zhì)粒圖譜；

圖2(a)示t-pa植物雙元表達(dá)載體pcam-tpa構(gòu)建流程；利用限制性內(nèi)切酶(mlyl/xhol)雙酶切，從克隆載體puc-tpa切下t-pa片段，連接入pcam-gt13a的mlyl/xhol位點(diǎn)，生成水稻植物雙元表達(dá)載體pcam-tpa；其中，35s，具有煙草花葉病毒(tmv)5‘utr的camv35s啟動(dòng)子；hptii，潮霉素抗性基因；nos3’，終止子；gt13a為胚乳特異性表達(dá)的啟動(dòng)子；

圖2(b)示tnkase植物雙元表達(dá)載體pcam-tnkase構(gòu)建流程；利用限制性內(nèi)切酶(mlyl/xhol)雙酶切，從克隆載體puc-tnkase切下tnkase片段，連接入pcam-gt13a的mlyl/xhol位點(diǎn)，生成水稻植物雙元表達(dá)載體pcam-tnkase；其中，35s，具有煙草花葉病毒(tmv)5‘utr的camv35s啟動(dòng)子；hptii，潮霉素抗性基因；nos3’，終止子；gt13a為胚乳特異性表達(dá)的啟動(dòng)子；

圖2(c)示r-pa植物雙元表達(dá)載體pcam-tnkase構(gòu)建流程；利用限制性內(nèi)切酶(mlyl/xhol)雙酶切，從克隆載體puc-rpa切下r-pa片段，連接入pcam-gt13a的mlyl/xhol位點(diǎn)，生成水稻植物雙元表達(dá)載體pcam-rpa；其中，35s，具有煙草花葉病毒(tmv)5‘utr的camv35s啟動(dòng)子；hptii，潮霉素抗性基因；nos3’，終止子；gt13a為胚乳特異性表達(dá)的啟動(dòng)子；

圖3示利用聚丙烯酰胺凝膠電泳(sds-page)檢測(cè)純化的重組t-pa，tnkase，r-pa；其中，泳道1：純化重組t-pa(5μg)；泳道2：純化重組tnkase(5μg)；泳道3：純化重組r-pa(5μg)；泳道4:陽性對(duì)照t-pa(5μg)；泳道5：陽性對(duì)照tnkase(5μg)；泳道6：陽性對(duì)照r-pa(5μg)；

圖4示纖維蛋白平板測(cè)定重組t-pa(a)，tnkase(b)以及r-pa(c)的活性；其中，t-pa，tnkase以及r-pa是分別從水稻種子中提取的重組純化蛋白，ck-t-pa，ck-tnkase以及ck-r-pa是商業(yè)用蛋白，用于陽性對(duì)照；1×pbs為一倍濃度的磷酸鹽緩沖液，用于陰性對(duì)照。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明公開了植物作為宿主在表達(dá)溶血蛋白中的應(yīng)用，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當(dāng)改進(jìn)工藝參數(shù)實(shí)現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動(dòng)對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的方法及應(yīng)用已經(jīng)通過較佳實(shí)施例進(jìn)行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本發(fā)明內(nèi)容、精神和范圍內(nèi)對(duì)本文所述的方法和應(yīng)用進(jìn)行改動(dòng)或適當(dāng)變更與組合，來實(shí)現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。

本發(fā)明利用dna重組技術(shù)，通過水稻胚乳特異表達(dá)、蛋白質(zhì)定向儲(chǔ)存和目的基因密碼子優(yōu)化等技術(shù)，在水稻胚乳特異性高效表達(dá)重組人溶栓蛋白t-pa(組織型纖溶酶原激活劑),tnkase(替奈譜酶)，以及r-pa(瑞替譜酶)，提純后的產(chǎn)品活性與商用產(chǎn)品活性基本一致。本發(fā)明所得的重組人溶栓蛋白具有表達(dá)體系穩(wěn)定、表達(dá)效率高、成本低、規(guī)?；a(chǎn)容易、生物活性高和無病原菌污染等優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明所得的重組人溶栓蛋白可廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)領(lǐng)域、醫(yī)藥產(chǎn)品、生物制藥等。

本發(fā)明提供的植物作為宿主在表達(dá)溶血蛋白中的應(yīng)用中所用原料及試劑均可由市場(chǎng)購得。

下面結(jié)合實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明：

實(shí)施例1植物表達(dá)構(gòu)建體

基于drugbank(t-pa，accessionno：db00015；r-pa，accessionno：db00015以及tnkase，accessionno：d6070)全長(zhǎng)氨基酸序列，通過反翻譯軟件，并且將密碼子優(yōu)化為水稻密碼子(見氨基酸序列如seqidno.1、seqidno.3、seqidno.5所示以及優(yōu)化的dna序列如seqidno.2、seqidno.4、seqidno.6所示)。將限制性位點(diǎn)mlyl以及xhol位點(diǎn)分別添加到優(yōu)化序列片段的5'末端以及3'末端，由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，克隆到puc57載體中(圖1)，得到克隆載體puc-tpa，puc-tnkase以及puc-rpa。通過mlyl以及xhol從puc-tpa，puc-tnkase以及puc-rpa中分離出tpa，tnkase，以及r-pa基因片段，并克隆入植物雙元載體pcam-gt13a中，以生成植物表達(dá)載體pcam-tpa，pcam-tnkase以及pcam-rpa(圖2)。隨后將植物表達(dá)載體通過multiporator(eppendorf，hamburg，germany)電穿孔轉(zhuǎn)化到根癌土壤桿菌lba4404中，用于水稻種子成熟胚愈傷組織的基因轉(zhuǎn)化。

實(shí)施例2水稻基因轉(zhuǎn)化

種子成熟胚誘導(dǎo)的愈傷組織：水稻品種臺(tái)北309種子，脫去谷殼后，經(jīng)20％次氯酸鈉消毒20min，經(jīng)無菌水漂洗3次，每次10min，然后放在愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上經(jīng)20～30d的誘導(dǎo)，產(chǎn)生愈傷組織。將0.5μg的質(zhì)粒pospmp105和0.5μg具有選擇性標(biāo)記質(zhì)粒pospmp5的dna放入愈傷組織中，在室溫(20～25℃)下反應(yīng)30min，用酒精洗三次，然后采用農(nóng)桿菌株進(jìn)行轉(zhuǎn)染，目的基因和選擇性標(biāo)記基因載體隨機(jī)整合到臺(tái)北309愈傷組織的細(xì)胞中。在含有50μg/ml的潮霉素b的選擇培養(yǎng)基上經(jīng)45d的篩選，繼續(xù)生長(zhǎng)的愈傷組織為抗潮霉素b的陽性愈傷組織。將潮霉素b抗性的愈傷組織轉(zhuǎn)移到再生培養(yǎng)基上，在光照下經(jīng)20d左右的誘導(dǎo)，愈傷組織分化成綠色的小植株，然后將幼小植株轉(zhuǎn)到生根培養(yǎng)基上，經(jīng)15～20d的誘導(dǎo)，形成完整的植株，最后轉(zhuǎn)到溫室生長(zhǎng)發(fā)育成熟的種子。此為t1種子。

實(shí)施例3利用sds-page凝膠電泳觀察純化重組蛋白的大小

當(dāng)t1種子收獲后，從水稻成熟胚乳中提取蛋白。轉(zhuǎn)基因水稻樣品用攪拌器攪拌，并用體積比為1:1比例的提取緩沖液(100mmkpi，ph7.8；5mmedta；10mmβ-巰基乙醇)攪拌機(jī)中高速勻漿1～2min。將勻漿物調(diào)節(jié)至ph為8.0，用紗布過濾，過濾物在4℃以10，000g離心15min以除去細(xì)胞碎片。收集上清液，與硫酸銨(50％)混合，并在冰上搖動(dòng)孵育60min。通過離心機(jī)(10，000g)在4℃下再次分離15min。將得到的上清液進(jìn)行第二輪硫酸銨(70％)沉淀，冰上搖動(dòng)懸浮60min，再次在4℃下以10，000g離心15min。然后，棄去上清液，將處理樣品沉淀蛋白質(zhì)溶于5ml緩沖液(20mmkpi，ph7.8；2mmedta；10mmβ-巰基乙醇)中并在-20℃下儲(chǔ)存。取樣品(5μl)熱變性(95℃)加載緩沖液(biorad，hercules，ca，usa)在4～12％bis-trisplussds-變性凝膠(thermofisherscientific，waltham，ma，usa)跑電泳，然后用考馬斯藍(lán)g250(biorad)染色后再次對(duì)凝膠進(jìn)行拍照。

克隆了雙元植物表達(dá)載體pcam-tpa，pcam-tnkase以及pcam-rpa。通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)方法，成功的獲得t-pa，tnkase以及r-pa的轉(zhuǎn)基因植株。重組蛋白經(jīng)過sds-page分離(圖3)。在泳道中觀察到t-pa，tnkase以及r-pa分子量大約為55，55，40kda的條帶。在陽性對(duì)照泳道中有對(duì)應(yīng)條帶，符合對(duì)重組蛋白大小的預(yù)期。

實(shí)施例4纖維蛋白溶解活性測(cè)定

將瓊脂糖(0.2g)置于40ml的磷酸鹽緩沖鹽水(1xpbs)中，通過在微波中煮沸然后冷卻至約40℃。凝膠固化之前，將32mg人纖維蛋白原(sigma-aldrich，st.louis，mo，usa)，10單位人纖溶酶原(rpeptidellc，bogart，ga，usa)和10單位人類凝血酶(biopharmlaboratoriesllc，bluffdale，ut，usa)加入到凝膠中并輕微旋轉(zhuǎn)混合以防止引入氣泡。然后將混合物倒入培養(yǎng)皿中并使其在室溫下固化。隨后在固化凝膠中制成孔(3mm直徑)。將10μl濃縮樣品(1μg/μl)稀釋在40μl的1xpbs緩沖液中，裝入凝膠孔中，并在室溫下孵育過夜。使用購買的標(biāo)準(zhǔn)的t-pa，tnkase，以及r-pa作為陽性對(duì)照(10μg)，測(cè)量清晰暈圈的實(shí)際直徑(mm)。

t-pa，tnkase以及r-pa可以將纖溶酶原轉(zhuǎn)化為纖溶酶，導(dǎo)致纖維蛋白溶解以及溶解血栓。在本發(fā)明中，纖維蛋白平板測(cè)定顯示植物來源的重組蛋白具有明顯溶解纖維蛋白的活性(圖4)。在商用以及重組t-pa，tnkase，以及r-pa蛋白的周圍顯示半透明的暈圈區(qū)。商用以及重組的溶解區(qū)域直徑大小一致，明重組蛋白活性與商用蛋白活性基本一致。

實(shí)施例5

對(duì)照組1：利用動(dòng)物生產(chǎn)溶血蛋白(t-pa，tnkase以及r-pa)；

對(duì)照組2：利用煙葉生產(chǎn)溶血蛋白(t-pa，tnkase以及r-pa)；

實(shí)驗(yàn)組：本發(fā)明提供的植物生產(chǎn)溶血蛋白(t-pa，tnkase以及r-pa)；

表1溶血蛋白

^*示與對(duì)照組1相比p≤0.05；^**示與對(duì)照組1相比p≤0.01；

^#示與對(duì)照組2相比p≤0.05；^**示與對(duì)照組2相比p≤0.01；

由表1可知，與對(duì)照組1的動(dòng)物系統(tǒng)相比，本發(fā)明提供的水稻種子瞬時(shí)表達(dá)溶血蛋白(t-pa，tnkase以及r-pa)極顯著(p≤0.01)提高了蛋白含量，簡(jiǎn)化了蛋白純化的難易程度，極顯著(p≤0.01)降低了生產(chǎn)成本。

與對(duì)照組2的煙草種子系統(tǒng)相比，水稻種子瞬時(shí)表達(dá)溶血蛋白(t-pa，tnkase以及r-pa)顯著(p≤0.05)提高了蛋白含量，簡(jiǎn)化了蛋白純化的難易程度，極顯著(p≤0.01)降低了生產(chǎn)成本。

對(duì)照組2與對(duì)照組1相比，煙草種子瞬時(shí)表達(dá)溶血蛋白(t-pa，tnkase以及r-pa)比動(dòng)物系統(tǒng)顯著(p≤0.05)提高了蛋白含量，簡(jiǎn)化了蛋白純化的難易程度，極顯著(p≤0.01)降低了生產(chǎn)成本。

綜合上述試驗(yàn)結(jié)果表明，植物系統(tǒng)尤其是水稻種子是更加經(jīng)濟(jì)、高效的表達(dá)平臺(tái)。能夠快速瞬時(shí)表達(dá)重組蛋白質(zhì)，可以在短時(shí)間內(nèi)大規(guī)模生產(chǎn)溶血蛋白(t-pa，tnkase以及r-pa)。

以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤飾，這些改進(jìn)和潤飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。

sequencelisting

<110>深圳惠升生物科技有限公司

<120>植物作為宿主在表達(dá)溶血蛋白中的應(yīng)用

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