專利名稱：新的血紅蛋白聚合劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及血紅蛋白聚合劑、它們的應(yīng)用以及用聚合血紅蛋白制造血液替代品。
由于外科和野戰(zhàn)外科學(xué)的發(fā)展，輸血醫(yī)學(xué)已成為綜合性學(xué)科，但血液的質(zhì)和量已不能滿足需要。輸血主要存在的問題是1．血液的安全性由于目前的檢測技術(shù)仍不能完全檢出血液中的病毒，因此不能避免丙肝病毒(HCV)、乙肝病毒(HBV)、庚肝病毒(HGV)、人類免疫缺陷病毒(HIV)、嗜T淋巴細(xì)胞病毒(HTLV)、單純皰疹病毒(CMV,EB)、細(xì)小病毒B19等所致的血源性疾病的感染和傳播；2．血型不合的風(fēng)險(xiǎn)；3．血源緊張；4．目前血液消毒、保存和運(yùn)輸不能滿足野戰(zhàn)輸血的需要。戰(zhàn)時(shí)輸血要求急、數(shù)量大，往往難以找到合適的血液配型，以至于失血性休克成為戰(zhàn)場死亡的主要原因。在現(xiàn)代戰(zhàn)爭中，傷后4小時(shí)失血致死的人數(shù)占傷員死亡總數(shù)的50％。因此，安全有效的血液替代品研究已成為當(dāng)今世界的熱門課題之一。血液替代品研究的目標(biāo)是獲得具有攜氧、釋氧、維持血容量及電解質(zhì)平衡能力，無病原微生物污染、無致熱原、無免疫原性、貯存期長、來源充足的血容量擴(kuò)充劑，作以下幾方面的應(yīng)用1．出血性休克的復(fù)蘇；2．特定的圍手術(shù)期血液稀釋；3．在紅細(xì)胞血型不合時(shí)替代輸血；4．冠脈成形術(shù)中的灌注液；5．離體器官的保存；5．增強(qiáng)腫瘤放療的療效。
血液替代品研究迄今已有近百年的歷史，目前世界各國的政府、軍方及大型醫(yī)藥公司競相增加此項(xiàng)目的投資，取得了大量有價(jià)值的研究成果。其研究方向主要有兩個(gè)氟碳化合物和血紅蛋白(Hb)制品。氟碳化合物通過對(duì)氧的高溶解度而發(fā)揮作用，能有效地?cái)y氧釋氧、維持血容量和電解質(zhì)平衡。氟碳化合物的保存條件特殊、在使用前必須乳化、在空氣中溶氧量不足和要求吸入高濃度的氧等，是其在應(yīng)用中的不便利之處。單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)吞噬大量的乳化顆粒引起功能阻斷等毒副作用是目前難以克服的困難，阻礙了其進(jìn)一步應(yīng)用。目前國外正開發(fā)新一代的氟碳化合物。
由于Hb具有獨(dú)特的氧結(jié)合特性和正常的生理代謝途徑，因此Hb類血液替代品比氟碳化合物更符合人體生理需要。而且Hb來源廣泛，可以從過期的庫血和牛血中提取。但是，天然的無紅細(xì)胞基質(zhì)的人Hb(SFHb)溶液不能直接作為血液替代品使用，這是因?yàn)?．失去紅細(xì)胞內(nèi)2,3-DPG調(diào)節(jié)，Hb氧親和力升高，不能向組織有效供氧。2．Hb在血漿中膠體滲透壓高，并迅速從其在紅細(xì)胞內(nèi)的α2β2四聚體形式解聚為αβ二聚體，從腎濾過而產(chǎn)生強(qiáng)烈腎毒性，在循環(huán)中的半壽期僅為2-4小時(shí)。3．失去胞內(nèi)還原酶系統(tǒng)調(diào)節(jié)，Hb易氧化成高鐵血紅蛋白(MetHb)，失去攜氧能力并產(chǎn)生自由基。所有以Hb為基礎(chǔ)的血液替代品的研究都集中于降低Hb的氧親和力、穩(wěn)定α2β2四聚體結(jié)構(gòu)和延長其循環(huán)半壽期，通常采用化學(xué)修飾、交聯(lián)、聚合和脂質(zhì)體包封等方法來達(dá)到此目的。
雖然人們通常采用人Hb作為血液替代品的原料，但人Hb有來源有限及病原體污染等缺點(diǎn)。1983年，F(xiàn)eola等發(fā)現(xiàn)牛Hb在輸入其它種屬的動(dòng)物體內(nèi)后不會(huì)導(dǎo)致抗體的迅速產(chǎn)生，隨后一些研究者探討了用牛Hb作為人血液替代品的原料的可能性。
牛Hb的基本結(jié)構(gòu)也是α2β2四聚體，但由于其NA1(1)β缺失，NA2(2)β為Met〖人的NA1(1)β為Val,NA2(2)β為His〗，不能與2,3-DPG形成鹽橋，故不受2,3-DPG調(diào)節(jié)。β亞基的親水性N端趨向分子內(nèi)親水區(qū)，帶動(dòng)A螺旋向分子內(nèi)移動(dòng)，從而使牛Hb趨向于緊張態(tài)(T態(tài))。另一方面，在從松弛態(tài)(R態(tài))向T態(tài)的構(gòu)象轉(zhuǎn)變中，由于R態(tài)結(jié)合O2導(dǎo)致牛Hb中央裂隙變寬，有利于Cl-內(nèi)流，中和了裂隙中的正電荷，使裂隙變窄，促進(jìn)O2的釋放從而轉(zhuǎn)變?yōu)門態(tài)。牛Hb在生理?xiàng)l件的Cl-濃度下，具有比人Hb(P50=26mmHg)更低的氧親和力(P50=31.6mmHg)，因而更容易向組織供氧。另一方面，由于牛Hb的氧親和力受Cl-調(diào)節(jié)，故在對(duì)牛Hb進(jìn)行化學(xué)修飾后即可保持較正常的氧親和力，而不用象人Hb一樣需再加入共價(jià)調(diào)節(jié)劑，所以，用牛Hb作為血液替代品的原料可簡化制備工藝。
將Hb聚合是血液替代品研究的重要途徑之一。長期以來，人們一直在尋找合適的聚合劑，以便能穩(wěn)定α2β2(64KD)四聚體并產(chǎn)生α2β2的寡聚體(∠500KD)。穩(wěn)定四聚體結(jié)構(gòu)可阻止Hb裂解為αβ二聚體從而防止腎損傷。α2β2的血漿半壽期只有2-4h，形成寡聚體則可將半壽期延長至25-46h并可降低膠體滲透壓和粘度。通常使用的聚合劑是戊二醛，已有數(shù)種聚合的Hb產(chǎn)品進(jìn)入了臨床試驗(yàn)，其中包括Biopure公司制備的polyHb。但在對(duì)戊二醛聚合的Hb進(jìn)行大量研究后發(fā)現(xiàn)1．聚合反應(yīng)不易控制；2．性質(zhì)不穩(wěn)定，保存兩個(gè)月后，凝膠過濾的洗脫曲線即發(fā)生變化；3．進(jìn)入體內(nèi)后會(huì)發(fā)生逆反應(yīng)，由此生成的醛基有很大的毒性等。因此，需要研究新的聚合劑。
1983年，Acharya報(bào)道用乙醇醛成功聚合了RNase，隨后又有報(bào)道用乙醇醛可聚合羥甲基Hb和天然人Hb。乙醇醛聚合的人Hb比戊二醛聚合的穩(wěn)定，在動(dòng)物體內(nèi)不會(huì)發(fā)生逆反應(yīng)。但未見有關(guān)乙醇醛聚合的人Hb的進(jìn)一步研究報(bào)道。
研究還發(fā)現(xiàn)，對(duì)現(xiàn)有的戊二醛和乙醇醛等聚合劑而言，它們的聚合反應(yīng)程度是很難控制的，在反應(yīng)時(shí)間延長和/或聚合劑量增加的時(shí)候，聚合程度會(huì)持續(xù)增加，從而形成聚合程度很大的聚合Hb，最終使Hb的聚合反應(yīng)體系凝膠化。
多年以來，血液替代品研究者們?cè)谌绾尾拍芮‘?dāng)?shù)亍⒏玫貙?duì)Hb進(jìn)行修飾這條路上艱難跋涉。若聚合反應(yīng)進(jìn)行得不充分，就意味著原材料的浪費(fèi)和成本過高；若聚合程度過高，則不僅引起Hb結(jié)構(gòu)和功能改變，還可由于這些改變?cè)隗w內(nèi)引起復(fù)雜的病理生理過程。要將聚合控制在一定程度是非常困難的，因?yàn)榫酆媳厝灰秒p功能或多功能交聯(lián)劑，這些交聯(lián)劑的活性基團(tuán)隨機(jī)地與Hb表面的氨基發(fā)生親核加成反應(yīng)，使聚合持續(xù)進(jìn)行。在目前已知的交聯(lián)劑中，最成功的是BAXTER公司的雙阿斯匹林，由于它是聚陰離子，可特異地與Hb亞基界面之間的正電荷區(qū)域結(jié)合，因此成功實(shí)現(xiàn)了定位交聯(lián)，但此反應(yīng)只發(fā)生在分子內(nèi)。這種只有分子內(nèi)交聯(lián)的Hb分子雖然不再從腎濾出，但其血漿半壽期只為4h左右，不足以持續(xù)地向機(jī)體供氧。增加Hb的分子量可有效延長其循環(huán)半壽期，但聚合反應(yīng)的難以控制使人們?cè)谶@一方向的研究進(jìn)展緩慢。
對(duì)血液替代品的基本要求是應(yīng)該具有與血液相類似的攜氧供氧能力，這需要polyHb具有適當(dāng)?shù)难跤H和力。聚合反應(yīng)往往導(dǎo)致Hb氧親和力的升高，使其失去在組織中的氧分壓下釋氧的能力，因此對(duì)聚合產(chǎn)物的氧親和力的評(píng)價(jià)是血液替代品研究中首要而又關(guān)鍵的一個(gè)環(huán)節(jié)。
為了探索新的聚合途徑，本發(fā)明從聚合反應(yīng)動(dòng)力學(xué)和熱力學(xué)入手，在降低雙功能交聯(lián)劑單基團(tuán)親電性的同時(shí)，引入空間位阻，從而顯著提高了聚合反應(yīng)的能壘、降低了聚合反應(yīng)的速度，反應(yīng)體系的凝膠化被完全抑制，大分子聚合物的形成被降到很低的水平，產(chǎn)物以低聚態(tài)的Hb為主，基本實(shí)現(xiàn)了Hb聚合反應(yīng)的可控制。同時(shí)，反應(yīng)產(chǎn)物的氧親和力保持在與血液接近的很合適的水平。丙酮醛及其結(jié)構(gòu)類似物這一類新聚合劑的提出，在國際上處于領(lǐng)先水平。
本發(fā)明的化合物作為血紅蛋白聚合劑具有如下結(jié)構(gòu)。 其中R’代表H-或1-10個(gè)碳的支鏈或支鏈烷基。
R代表 或 或 A代表H-或1-10個(gè)碳的支鏈或支鏈烷基，n為1至7的阿拉伯?dāng)?shù)字。
這些化合物包括丙酮醛、2,3-丁二酮、1-羥基-2-丁酮、3-羥基-2-丁酮、2,3-己二酮、2,4-己二酮、2,5-己二酮、3-乙基-2,4-戊二酮、6-甲基-2,4-庚二酮、丙酮醇。
用本發(fā)明的化合物將天然?；蛉搜t蛋白進(jìn)行適當(dāng)化學(xué)修飾后，即可制成有適當(dāng)氧親和力(P50為28-34mmHg)的大分子聚合血紅蛋白，將其溶于溶液中(此溶液所含的電解質(zhì)和pH值與血漿近似)即可制成血液替代品。
本發(fā)明的化合物作為血紅蛋白聚合劑制備聚合血紅蛋白的方法，包括用式(Ⅰ)化合物與人或牛的血紅蛋白反應(yīng)。
本發(fā)明化合物可聚合血紅蛋白以用來制備血液替代品。
本發(fā)明的血液替代品的制備方法，包括將聚合血紅蛋白溶解于電解質(zhì)和pH值與血漿近似的溶液，此溶液含有還原型谷胱甘肽(GSH)或其他巰基(-SH)供體。
通過下面的反應(yīng)可將?；蛉说难t蛋白進(jìn)行化學(xué)修飾?；瘜W(xué)修飾包括在?；蛉搜t蛋白分子內(nèi)的不同亞基間形成分子內(nèi)交聯(lián)，同時(shí)也在不同的血紅蛋白分子間形成分子間聚合。1)反應(yīng)類型之一 R、R″可為H或烷基，R′可為-(CH2)n-，或可缺省。2)反應(yīng)類型之二 R、R’可為H或烷基上述兩類反應(yīng)所用的聚合劑為反應(yīng)類型1為在烷鏈上有兩個(gè)羰基(-CO-)的本發(fā)明化合物。
反應(yīng)類型2為在烷鏈上有一個(gè)羰基(-CO-)，在其鄰位的碳原子上有一個(gè)羥基的化合物本發(fā)明化合物。
本發(fā)明通過以下實(shí)施例來描述本發(fā)明的化合物，應(yīng)用，制備以及血液替代品的制備、組成。
實(shí)施例1用丙酮醛(Pyruvic aldehyde,CH3COCHO)聚合牛血紅蛋白將1L 15％的純凈牛血紅蛋白(牛Hb，溶于生理鹽水，pH6.4)放入3L二口圓底燒瓶中，燒瓶的二口分別與真空泵和N2鋼瓶相聯(lián)，將燒瓶內(nèi)抽真空至-0.075MPa后，通入N2至與大氣等壓，輕搖燒瓶10min。重復(fù)抽氣和通N2后，監(jiān)測Hb溶液中O2Hb的濃度降到2％以下。加入脫氣的30ml 1M NaCO3將Hb溶液的pH值調(diào)至8.5，再加入36ml脫氣的10％丙酮醛(Pyruvic aldehyde)貯存液，升溫至30℃并用磁力攪拌器攪拌90min后，緩慢加入85.7ml的1.56％NaBH4(溶于10mM NaOH)以終止聚合反應(yīng)。反應(yīng)終止后保持脫氧狀態(tài)于60℃水浴10h，然后于4℃將反應(yīng)混合物對(duì)生理鹽水透析，并用500KD和100KD的中空纖維柱去除聚合產(chǎn)物中大于500KD和小于100KD的成分，所得產(chǎn)物為分子量分布在100KD至500KD之間的聚合牛Hb的混合物，最后調(diào)pH至7.4。用ABL520血?dú)夥治鰞x(Radiometer)檢測，此分子量分布在100KD至500KD之間的聚合牛Hb的50％氧飽和度(P50)為29mmHg。
實(shí)施例2用2,3-丁二酮(2,3-Butanecdione,CH3COCOCH3)聚合牛血紅蛋白將1L 15％的純凈牛血紅蛋白(牛Hb，溶于生理鹽水，pH6.4)放入3L二口圓底燒瓶中，燒瓶的二口分別與真空泵和N2鋼瓶相聯(lián)，將燒瓶內(nèi)抽真空至-0.075MPa后，通入N2至與大氣等壓，輕搖燒瓶10min。重復(fù)抽氣和通N2后，監(jiān)測Hb溶液中O2Hb的濃度降到2％以下。加入脫氣的30ml 1M NaCO3將Hb溶液的pH值調(diào)至8.5，再加入43ml脫氣的10％2,3-Butanedione貯存液，升溫至30℃并用磁力攪拌器攪拌90min后，緩慢加入85.7ml的1.56％NaBH4(溶于10mMNaOH)以終止聚合反應(yīng)。反應(yīng)終止后保持脫氧狀態(tài)于60℃水浴10h，然后于4℃將反應(yīng)混合物對(duì)生理鹽水透析，并用500KD和100KD的中空纖維柱去除聚合產(chǎn)物中大于500KD和小于100KD的成分，所得產(chǎn)物為分子量分布在100KD至500KD之間的聚合牛Hb的混合物，最后調(diào)pH至7.4。用ABL520血?dú)夥治鰞x(Radiometer)檢測，此分子量分布在100KD至500KD之間的聚合牛Hb的50％氧飽和度(P50)為29mmHg。
實(shí)旄例3用1-羥基-2-T酮(1-Hydroxy-2-butanone,C2H5COCH2OH)聚合牛血紅蛋白將1L 15％的純凈牛血紅蛋白(牛Hb，溶于生理鹽水，pH6.4)放入3L二口圓底燒瓶中，燒瓶的二口分別與真空泵和N2鋼瓶相聯(lián)，將燒瓶內(nèi)抽真空至-0.075MPa后，通入N2至與大氣等壓，輕搖燒瓶10min。重復(fù)抽氣和通N2后，監(jiān)測Hb溶液中O2Hb的濃度降到2％以下。加入脫氣的30ml 1M NaCO3將Hb溶液的pH值調(diào)至8.5，再加入44ml脫氣的10％1-Hydroxy-2-butanone貯存液，升溫至30℃并用磁力攪拌器攪拌90min后，緩慢加入85.7ml的1.56％NaBH4(溶于10mM NaOH)以終止聚合反應(yīng)。反應(yīng)終止后保持脫氧狀態(tài)于60℃水浴10h，然后于4℃將反應(yīng)混合物對(duì)生理鹽水透析，并用500KD和100KD的中空纖維柱去除聚合產(chǎn)物中大于500KD和小于100KD的成分，所得產(chǎn)物為分子量分布在100KD至500KD之間的聚合牛Hb的混合物，最后調(diào)pH至7.4。用ABL520血?dú)夥治鰞x(Radiometer)檢測，此分子量分布在100KD至500KD之間的聚合牛Hb的50％氧飽和度(P50)為29mmHg。
實(shí)施例4用3-羥基-2-丁酮[3-Hydroxy-2-butanone,CH3COCH(OH)CH3]聚合牛血紅蛋白將1L 15％的純凈牛血紅蛋白(牛Hb，溶于生理鹽水，pH6.4)放入3L二口圓底燒瓶中，燒瓶的二口分別與真空泵和N2鋼瓶相聯(lián)，將燒瓶內(nèi)抽真空至-0.075MPa后，通入N2至與大氣等壓，輕搖燒瓶10min。重復(fù)抽氣和通N2后，監(jiān)測Hb溶液中O2Hb的濃度降到2％以下。加入脫氣的30ml 1M NaCO3將Hb溶液的pH值調(diào)至8.5，再加入44ml脫氣的10％3-Hydroxy-2-butanone貯存液，升溫至30℃并用磁力攪拌器攪拌90min后，緩慢加入85.7ml的1.56％NaBH4(溶于10mM NaOH)以終止聚合反應(yīng)。反應(yīng)終止后保持脫氧狀態(tài)于60℃水浴10h，然后于4℃將反應(yīng)混合物對(duì)生理鹽水透析，并用500KD和100KD的中空纖維柱去除聚合產(chǎn)物中大于500KD和小于100KD的成分，所得產(chǎn)物為分子量分布在100KD至500KD之間的聚合牛Hb的混合物，最后調(diào)pH至7.4。用ABL520血?dú)夥治鰞x(Radiometer)檢測，此分子量分布在100KD至500KD之間的聚合牛Hb的50％氧飽和度(P50)為29mmHg。
實(shí)施例5用2,3-己二酮(2,3-Hexanedione,CH3CH2CH2COCOCH3)聚合牛血紅蛋白將1L 15％的純凈牛血紅蛋白(牛Hb，溶于生理鹽水，pH6.4)放入3L二口圓底燒瓶中，燒瓶的二口分別與真空泵和N2鋼瓶相聯(lián)，將燒瓶內(nèi)抽真空至-0.075MPa后，通入N2至與大氣等壓，輕搖燒瓶10min。重復(fù)抽氣和通N2后，監(jiān)測Hb溶液中O2Hb的濃度降到2％以下。加入脫氣的30ml 1M NaCO3將Hb溶液的pH值調(diào)至8.5，再加入57ml脫氣的10％2,3-Hexanedione貯存液，升溫至30℃并用磁力攪拌器攪拌90min后，緩慢加入85.7ml的1.56％NaBH4(溶于10mMNaOH)以終止聚合反應(yīng)。反應(yīng)終止后保持脫氧狀態(tài)于60℃水浴10h，然后于4℃將反應(yīng)混合物對(duì)生理鹽水透析，并用500KD和100KD的中空纖維柱去除聚合產(chǎn)物中大于500KD和小于100KD的成分，所得產(chǎn)物為分子量分布在100KD至500KD之間的聚合牛Hb的混合物，最后調(diào)pH至7.4。用ABL520血?dú)夥治鰞x(Radiometer)檢測，此分子量分布在100KD至500KD之間的聚合牛Hb的50％氧飽和度(P50)為29mmHg。
實(shí)旋例6用2,4-己二酮(2,4-Hexanedione,CH3CH2COCH2COCH3)聚合牛血紅蛋白將1L 15％的純凈牛血紅蛋白(牛Hb，溶于生理鹽水，pH6.4)放入3L二口圓底燒瓶中，燒瓶的二口分別與真空泵和N2鋼瓶相聯(lián)，將燒瓶內(nèi)抽真空至-0.075MPa后，通入N2至與大氣等壓，輕搖燒瓶10min。重復(fù)抽氣和通N2后，監(jiān)測Hb溶液中O2Hb的濃度降到2％以下。加入脫氣的30ml 1M NaCO3將Hb溶液的pH值調(diào)至8.5，再加入57ml脫氣的10％2,4-Hexanedione貯存液，升溫至30℃并用磁力攪拌器攪拌90min后，緩慢加入85.7ml的1.56％NaBH4(溶于10mMNaOH)以終止聚合反應(yīng)。反應(yīng)終止后保持脫氧狀態(tài)于60℃水浴10h，然后于4℃將反應(yīng)混合物對(duì)生理鹽水透析，并用500KD和100KD的中空纖維柱去除聚合產(chǎn)物中大于500KD和小于100KD的成分，所得產(chǎn)物為分子量分布在100KD至500KD之間的聚合牛Hb的混合物，最后調(diào)pH至7.4。用ABL520血?dú)夥治鰞x(Radiometer)檢測，此分子量分布在100KD至500KD之間的聚合牛Hb的50％氧飽和度(P50)為29mmHg。
實(shí)施例7用2,5-己二酮(2,5-Hexanedione,CH3COCH2CH2COCH3)聚合牛血紅蛋白將1L 15％的純凈牛血紅蛋白(牛Hb，溶于生理鹽水，pH6.4)放入3L二口圓底燒瓶中，燒瓶的二口分別與真空泵和N2鋼瓶相聯(lián)，將燒瓶內(nèi)抽真空至-0.075MPa后，通入N2至與大氣等壓，輕搖燒瓶10min。重復(fù)抽氣和通N2后，監(jiān)測Hb溶液中O2Hb的濃度降到2％以下。加入脫氣的30ml 1M NaCO3將Hb溶液的pH值調(diào)至8.5，再加入57ml脫氣的10％2,5-Hexanedione貯存液，升溫至30℃并用磁力攪拌器攪拌90min后，緩慢加入85.7ml的1.56％NaBH4(溶于10mMNaOH)以終止聚合反應(yīng)。反應(yīng)終止后保持脫氧狀態(tài)于60℃水浴10h，然后于4℃將反應(yīng)混合物對(duì)生理鹽水透析，并用500KD和100KD的中空纖維柱去除聚合產(chǎn)物中大于500KD和小于100KD的成分，所得產(chǎn)物為分子量分布在100KD至500KD之間的聚合牛Hb的混合物，最后調(diào)pH至7.4。用ABL520血?dú)夥治鰞x(Radiometer)檢測，此分子量分布在100KD至500KD之間的聚合牛Hb的50％氧飽和度(P50)為29mmHg。
實(shí)施例8用3-乙基-2,4-戊二酮[3-ethyl-2,4-pentanedion,CH3COCH(C2H5)COCH3]聚合牛血紅蛋白將1L 15％的純凈牛血紅蛋白(牛Hb，溶于生理鹽水，pH6.4)放入3L二口圓底燒瓶中，燒瓶的二口分別與真空泵和N2鋼瓶相聯(lián)，將燒瓶內(nèi)抽真空至-0.075MPa后，通入N2至與大氣等壓，輕搖燒瓶10min。重復(fù)抽氣和通N2后，監(jiān)測Hb溶液中O2Hb的濃度降到2％以下。加入脫氣的30ml 1M NaCO3將Hb溶液的pH值調(diào)至8.5，再加入64ml脫氣的10％3-ethyl-2,4-pentanedion貯存液，升溫至30℃并用磁力攪拌器攪拌90min后，緩慢加入85.7ml的1.56％NaBH4(溶于10mM NaOH)以終止聚合反應(yīng)。反應(yīng)終止后保持脫氧狀態(tài)于60℃水浴10h，然后于4℃將反應(yīng)混合物對(duì)生理鹽水透析，并用500KD和100KD的中空纖維柱去除聚合產(chǎn)物中大于500KD和小于100KD的成分，所得產(chǎn)物為分子量分布在100KD至500KD之間的聚合牛Hb的混合物，最后調(diào)pH至7.4。用ABL520血?dú)夥治鰞x(Radiometer)檢測，此分子量分布在100KD至500KD之間的聚合牛Hb的50％氧飽和度(P50)為29mmHg。
實(shí)施例9用6-甲基-2,4-庚二酮[6-methyl-2,4-heptanedione,(CH3)2CHCH2COCH2COCH3]聚合牛血紅蛋白將1L 15％的純凈牛血紅蛋白(牛Hb，溶于生理鹽水，pH6.4)放入3L二口圓底燒瓶中，燒瓶的二口分別與真空泵和N2鋼瓶相聯(lián)，將燒瓶內(nèi)抽真空至-0.075MPa后，通入N2至與大氣等壓，輕搖燒瓶10min。重復(fù)抽氣和通N2后，監(jiān)測Hb溶液中O2Hb的濃度降到2％以下。加入脫氣的30ml 1M NaCO3將Hb溶液的pH值調(diào)至8.5，再加入71ml脫氣的10％6-methyl-2,4-heptanedione貯存液，升溫至30℃并用磁力攪拌器攪拌90min后，緩慢加入85.7ml的1.56％NaBH4(溶于10mM NaOH)以終止聚合反應(yīng)。反應(yīng)終止后保持脫氧狀態(tài)于60℃水浴10h，然后于4℃將反應(yīng)混合物對(duì)生理鹽水透析，并用500KD和100KD的中空纖維柱去除聚合產(chǎn)物中大于500KD和小于100KD的成分，所得產(chǎn)物為分子量分布在100KD至500KD之間的聚合牛Hb的混合物，最后調(diào)pH至7.4。用ABL520血?dú)夥治鰞x(Radiometer)檢測，此分子量分布在100KD至500KD之間的聚合牛Hb的50％氧飽和度(P50)為29mmHg。
實(shí)施例10用丙酮醇(Acetol,CH3COCH2OH)聚合牛血紅蛋白將1L 15％的純凈牛血紅蛋白(牛Hb，溶于生理鹽水，pH6.4)放入3L二口圓底燒瓶中，燒瓶的二口分別與真空泵和N2鋼瓶相聯(lián)，將燒瓶內(nèi)抽真空至-0.075MPa后，通入N2至與大氣等壓，輕搖燒瓶10min。重復(fù)抽氣和通N2后，監(jiān)測Hb溶液中O2Hb的濃度降到2％以下。加入脫氣的30ml 1M NaCO3將Hb溶液的pH值調(diào)至8.5，再加入37ml脫氣的10％丙酮醇(Aceto1)貯存液，升溫至30℃并用磁力攪拌器攪拌90min后，緩慢加入85.7ml的1.56％NaBH4(溶于10mMNaOH)以終止聚合反應(yīng)。反應(yīng)終止后保持脫氧狀態(tài)于60℃水浴10h，然后于4℃將反應(yīng)混合物對(duì)生理鹽水透析，并用500KD和100KD的中空纖維柱去除聚合產(chǎn)物中大于500KD和小于100KD的成分，所得產(chǎn)物為分子量分布在100KD至500KD之間的聚合牛Hb的混合物，最后調(diào)pH至7.4。用ABL520血?dú)夥治鰞x(Radiometer)檢測，此分子量分布在100KD至500KD之間的聚合牛Hb的50％氧飽和度(P50)為29mmHg。
實(shí)旌例11用丙酮醛(Pyruvic aldehyde,CH3COCHO)聚合人血紅蛋白將1L 15％的純凈人血紅蛋白(人Hb，溶于生理鹽水，pH6.4)放入3L二口圓底燒瓶中，燒瓶的二口分別與真空泵和N2鋼瓶相聯(lián)，將燒瓶內(nèi)抽真空至-0.075MPa后，通入N2至與大氣等壓，輕搖燒瓶10min。重復(fù)抽氣和通N2后，監(jiān)測Hb溶液中O2Hb的濃度降到2％以下。加入脫氣的30ml 1M NaCO3將Hb溶液的pH值調(diào)至8.5，再加入36ml脫氣的10％丙酮醛(Pymvic aldehyde)貯存液，升溫至30℃并用磁力攪拌器攪拌90min后，緩慢加入85.7ml的1.56％NaBH4(溶于10mM NaOH)以終止聚合反應(yīng)。反應(yīng)終止后保持脫氧狀態(tài)于60℃水浴10h，然后于4℃將反應(yīng)混合物對(duì)生理鹽水透析，并用500KD和100KD的中空纖維柱去除聚合產(chǎn)物中大于500KD和小于100KD的成分，所得產(chǎn)物為分子量分布在100KD至500KD之間的聚合人Hb的混合物，最后調(diào)pH至7.4。向溶液中加入2,3-DPG或2,3-二磷酸吡哆醛等調(diào)節(jié)人Hb氧親和力的共價(jià)調(diào)節(jié)劑后，用ABL520血?dú)夥治鰞x(Radiometer)檢測，此分子量分布在100KD至500KD之間的聚合人Hb的50％氧飽和度(P50)為26mmHg。
實(shí)施例12用2,3-丁二酮(2,3-Butanedione,CH3COCOCH3)聚合人血紅蛋白將1L 15％的純凈人血紅蛋白(人Hb，溶于生理鹽水，pH6.4)放入3L二口圓底燒瓶中，燒瓶的二口分別與真空泵和N2鋼瓶相聯(lián)，將燒瓶內(nèi)抽真空至-0.075MPa后，通入N2至與大氣等壓，輕搖燒瓶10min。重復(fù)抽氣和通N2后，監(jiān)測Hb溶液中O2Hb的濃度降到2％以下。加入脫氣的30ml 1M NaCO3將Hb溶液的pH值調(diào)至8.5，再加入43ml脫氣的10％2,3-Butanedione貯存液，升溫至30℃并用磁力攪拌器攪拌90min后，緩慢加入85.7ml的1.56％NaBH4(溶于10mMNaOH)以終止聚合反應(yīng)。反應(yīng)終止后保持脫氧狀態(tài)于60℃水浴10h，然后于4℃將反應(yīng)混合物對(duì)生理鹽水透析，并用500KD和100KD的中空纖維柱去除聚合產(chǎn)物中大于500KD和小于100KD的成分，所得產(chǎn)物為分子量分布在100KD至500KD之間的聚合人Hb的混合物，最后調(diào)pH至7.4。向溶液中加入2,3-DPG或2,3-二磷酸吡哆醛等調(diào)節(jié)人Hb氧親和力的共價(jià)調(diào)節(jié)劑后，用ABL520血?dú)夥治鰞x(Radiometer)檢測，此分子量分布在100KD至500KD之間的聚合人Hb的50％氧飽和度(P50)為26mmHg。
實(shí)施例13用1-羥基-2-丁酮(1-Hydroxy-2-butanone,C2H5COCH2OH)聚合人血紅蛋白將1L 15％的純凈人血紅蛋白(人Hb，溶于生理鹽水，pH6.4)放入3L二口圓底燒瓶中，燒瓶的二口分別與真空泵和N2鋼瓶相聯(lián)，將燒瓶內(nèi)抽真空至-0.075MPa后，通入N2至與大氣等壓，輕搖燒瓶10min。重復(fù)抽氣和通N2后，監(jiān)測Hb溶液中O2Hb的濃度降到2％以下。加入脫氣的30ml 1M NaCO3將Hb溶液的pH值調(diào)至8.5，再加入44ml脫氣的10％1-Hydroxy-2-butanone貯存液，升溫至30℃并用磁力攪拌器攪拌90min后，緩慢加入85.7ml的1.56％NaBH4(溶于10mM NaOH)以終止聚合反應(yīng)。反應(yīng)終止后保持脫氧狀態(tài)于60℃水浴10h，然后于4℃將反應(yīng)混合物對(duì)生理鹽水透析，并用500KD和100KD的中空纖維柱去除聚合產(chǎn)物中大于500KD和小于100KD的成分，所得產(chǎn)物為分子量分布在100KD至500KD之間的聚合人Hb的混合物，最后調(diào)pH至7.4。向溶液中加入2,3-DPG或2,3-二磷酸吡哆醛等調(diào)節(jié)人Hb氧親和力的共價(jià)調(diào)節(jié)劑后，用ABL520血?dú)夥治鰞x(Radiometer)檢測，此分子量分布在100KD至500KD之間的聚合人Hb的50％氧飽和度(P50)為26mmHg。
實(shí)施例14用3-羥基-2-丁酮[3-Hydroxy-2-butanone,CH3COCH(OH)CH3]聚合人血紅蛋白將1L 15％的純凈人血紅蛋白(人Hb，溶于生理鹽水，pH6.4)放入3L二口圓底燒瓶中，燒瓶的二口分別與真空泵和N2鋼瓶相聯(lián)，將燒瓶內(nèi)抽真空至-0.075MPa后，通入N2至與大氣等壓，輕搖燒瓶10min。重復(fù)抽氣和通N2后，監(jiān)測Hb溶液中O2Hb的濃度降到2％以下。加入脫氣的30ml 1M NaCO3將Hb溶液的pH值調(diào)至8.5，再加入44ml脫氣的10％3-Hydroxy-2-butanone貯存液，升溫至30℃并用磁力攪拌器攪拌90min后，緩慢加入85.7ml的1.56％NaBH4(溶于10mM NaOH)以終止聚合反應(yīng)。反應(yīng)終止后保持脫氧狀態(tài)于60℃水浴10h，然后于4℃將反應(yīng)混合物對(duì)生理鹽水透析，并用500KD和100KD的中空纖維柱去除聚合產(chǎn)物中大于500KD和小于100KD的成分，所得產(chǎn)物為分子量分布在100KD至500KD之間的聚合人Hb的混合物，最后調(diào)pH至7.4。向溶液中加入2,3-DPG或2,3-二磷酸吡哆醛等調(diào)節(jié)人Hb氧親和力的共價(jià)調(diào)節(jié)劑后，用ABL520血?dú)夥治鰞x(Radiometer)檢測，此分子量分布在100KD至500KD之間的聚合人Hb的50％氧飽和度(P50)為26mmHg。
實(shí)施例15用2,3-己二酮(2,3-Hexanedione,CH3CH2CH2COCOCH3)聚合人血紅蛋白將1L 15％的純凈人血紅蛋白(人Hb，溶于生理鹽水，pH6.4)放入3L二口圓底燒瓶中，燒瓶的二口分別與真空泵和N2鋼瓶相聯(lián)，將燒瓶內(nèi)抽真空至-0.075MPa后，通入N2至與大氣等壓，輕搖燒瓶10min。重復(fù)抽氣和通N2后，監(jiān)測Hb溶液中O2Hb的濃度降到2％以下。加入脫氣的30ml 1M NaCO3將Hb溶液的pH值調(diào)至8.5，再加入57ml脫氣的10％2,3-Hexanedione貯存液，升溫至30℃并用磁力攪拌器攪拌90min后，緩慢加入85.7ml的1.56％NaBH4(溶于10mMNaOH)以終止聚合反應(yīng)。反應(yīng)終止后保持脫氧狀態(tài)于60℃水浴10h，然后于4℃將反應(yīng)混合物對(duì)生理鹽水透析，并用500KD和100KD的中空纖維柱去除聚合產(chǎn)物中大于500KD和小于100KD的成分，所得產(chǎn)物為分子量分布在100KD至500KD之間的聚合人Hb的混合物，最后調(diào)pH至7.4。向溶液中加入2,3-DPG或2,3-二磷酸吡哆醛等調(diào)節(jié)人Hb氧親和力的共價(jià)調(diào)節(jié)劑后，用ABL520血?dú)夥治鰞x(Radiometer)檢測，此分子量分布在100KD至500KD之間的聚合人Hb的50％氧飽和度(P50)為26mmHg。
實(shí)施例16用2,4-己二酮(2,4-Hexanedione,CH3CH2COCH2COCH3)聚合人血紅蛋白將1L 15％的純凈人血紅蛋白(人Hb，溶于生理鹽水，pH6.4)放入3L二口圓底燒瓶中，燒瓶的二口分別與真空泵和N2鋼瓶相聯(lián)，將燒瓶內(nèi)抽真空至-0.075MPa后，通入N2至與大氣等壓，輕搖燒瓶10min。重復(fù)抽氣和通N2后，監(jiān)測Hb溶液中O2Hb的濃度降到2％以下。加入脫氣的30ml 1M NaCO3將Hb溶液的pH值調(diào)至8.5，再加入57ml脫氣的10％2,4-Hexanedione貯存液，升溫至30℃并用磁力攪拌器攪拌90min后，緩慢加入85.7ml的1.56％NaBH4(溶于10mMNaOH)以終止聚合反應(yīng)。反應(yīng)終止后保持脫氧狀態(tài)于60℃水浴10h，然后于4℃將反應(yīng)混合物對(duì)生理鹽水透析，并用500KD和100KD的中空纖維柱去除聚合產(chǎn)物中大于500KD和小于100KD的成分，所得產(chǎn)物為分子量分布在100KD至500KD之間的聚合人Hb的混合物，最后調(diào)pH至7.4。向溶液中加入2,3-DPG或2,3-二磷酸吡哆醛等調(diào)節(jié)人Hb氧親和力的共價(jià)調(diào)節(jié)劑后，用ABL520血?dú)夥治鰞x(Radiometer)檢測，此分子量分布在100KD至500KD之間的聚合人Hb的50％氧飽和度(P50)為26mmHg。
實(shí)施例17用2,5-己二酮(2,5-Hexanedi one,CH3COCH2CH2COCH3)聚合人血紅蛋白將1L 15％的純凈人血紅蛋白(人Hb，溶于生理鹽水，pH6.4)放入3L二口圓底燒瓶中，燒瓶的二口分別與真空泵和N2鋼瓶相聯(lián)，將燒瓶內(nèi)抽真空至-0.075MPa后，通入N2至與大氣等壓，輕搖燒瓶10min。重復(fù)抽氣和通N2后，監(jiān)測Hb溶液中O2Hb的濃度降到2％以下。加入脫氣的30ml 1M NaCO3將Hb溶液的pH值調(diào)至8.5，再加入57ml脫氣的10％2,5-Hexanedione貯存液，升溫至30℃并用磁力攪拌器攪拌90min后，緩慢加入85.7ml的1.56％NaBH4(溶于10mMNaOH)以終止聚合反應(yīng)。反應(yīng)終止后保持脫氧狀態(tài)于60℃水浴10h，然后于4℃將反應(yīng)混合物對(duì)生理鹽水透析，并用500KD和100KD的中空纖維柱去除聚合產(chǎn)物中大于500KD和小于100KD的成分，所得產(chǎn)物為分子量分布在100KD至500KD之間的聚合人Hb的混合物，最后調(diào)pH至7.4。向溶液中加入2,3-DPG或2,3-二磷酸吡哆醛等調(diào)節(jié)人Hb氧親和力的共價(jià)調(diào)節(jié)劑后，用ABL520血?dú)夥治鰞x(Radiometer)檢測，此分子量分布在100KD至500KD之間的聚合人Hb的50％氧飽和度(P50)為26mmHg。
實(shí)施例18用3-乙基-2,4-戊二酮[3-ethyl-2,4-pentanedion,CH3COCH(C2H5)COCH3]聚合人血紅蛋白將1L 15％的純凈人血紅蛋白(人Hb，溶于生理鹽水，pH6.4)放入3L二口圓底燒瓶中，燒瓶的二口分別與真空泵和N2鋼瓶相聯(lián)，將燒瓶內(nèi)抽真空至-0.075MPa后，通入N2至與大氣等壓，輕搖燒瓶10min。重復(fù)抽氣和通N2后，監(jiān)測Hb溶液中O2Hb的濃度降到2％以下。加入脫氣的30ml 1M NaCO3將Hb溶液的pH值調(diào)至8.5，再加入64ml脫氣的10％3-ethyl-2,4-pentanedion貯存液，升溫至30℃并用磁力攪拌器攪拌90min后，緩慢加入85.7ml的1.56％NaBH4(溶于10mM NaOH)以終止聚合反應(yīng)。反應(yīng)終止后保持脫氧狀態(tài)于60℃水浴10h，然后于4℃將反應(yīng)混合物對(duì)生理鹽水透析，并用500KD和100KD的中空纖維柱去除聚合產(chǎn)物中大于500KD和小于100KD的成分，所得產(chǎn)物為分子量分布在100KD至500KD之間的聚合人Hb的混合物，最后調(diào)pH至7.4。向溶液中加入2,3-DPG或2,3-二磷酸吡哆醛等調(diào)節(jié)人Hb氧親和力的共價(jià)調(diào)節(jié)劑后，用ABL520血?dú)夥治鰞x(Radiometer)檢測，此分子量分布在100KD至500KD之間的聚合人Hb的50％氧飽和度(P50)為26mmHg。
實(shí)施例19用6-甲基-2,4-庚二酮[6-methyl-2,4-heptanedione,(CH3)2CHCH2COCH2COCH3]聚合人血紅蛋白將1L 15％的純凈人血紅蛋白(人Hb，溶于生理鹽水，pH6.4)放入3L二口圓底燒瓶中，燒瓶的二口分別與真空泵和N2鋼瓶相聯(lián)，將燒瓶內(nèi)抽真空至-0.075MPa后，通入N2至與大氣等壓，輕搖燒瓶10min。重復(fù)抽氣和通N2后，監(jiān)測Hb溶液中O2Hb的濃度降到2％以下。加入脫氣的30ml 1M NaCO3將Hb溶液的pH值調(diào)至8.5，再加入71ml脫氣的10％6-methyl-2,4-heptanedione貯存液，升溫至30℃并用磁力攪拌器攪拌90min后，緩慢加入85.7ml的1.56％NaBH4(溶于10mM NaOH)以終止聚合反應(yīng)。反應(yīng)終止后保持脫氧狀態(tài)于60℃水浴10h，然后于4℃將反應(yīng)混合物對(duì)生理鹽水透析，并用500KD和100KD的中空纖維柱去除聚合產(chǎn)物中大于500KD和小于100KD的成分，所得產(chǎn)物為分子量分布在100KD至500KD之間的聚合人Hb的混合物，最后調(diào)pH至7.4。向溶液中加入2,3-DPG或2,3-二磷酸吡哆醛等調(diào)節(jié)人Hb氧親和力的共價(jià)調(diào)節(jié)劑后，用ABL520血?dú)夥治鰞x(Radiometer)檢測，此分子量分布在100KD至500KD之間的聚合人Hb的50％氧飽和度(P50)為26mmHg。
實(shí)施例20用丙酮醇(Acetol,CH3COCH2OH)聚合人血紅蛋白將1L 15％的純凈人血紅蛋白(人Hb，溶于生理鹽水，pH6.4)放入3L二口圓底燒瓶中，燒瓶的二口分別與真空泵和N2鋼瓶相聯(lián)，將燒瓶內(nèi)抽真空至-0.075MPa后，通入N2至與大氣等壓，輕搖燒瓶10min。重復(fù)抽氣和通N2后，監(jiān)測Hb溶液中O2Hb的濃度降到2％以下。加入脫氣的30ml 1M NaCO3將Hb溶液的pH值調(diào)至8.5，再加入37ml脫氣的10％丙酮醇(Acetol)貯存液，升溫至30℃并用磁力攪拌器攪拌90min后，緩慢加入85.7ml的1.56％NaBH4(溶于10mMNaOH)以終止聚合反應(yīng)。反應(yīng)終止后保持脫氧狀態(tài)于60℃水浴10h，然后于4℃將反應(yīng)混合物對(duì)生理鹽水透析，并用500KD和100KD的中空纖維柱去除聚合產(chǎn)物中大于500KD和小于100KD的成分，所得產(chǎn)物為分子量分布在100KD至500KD之間的聚合人Hb的混合物，最后調(diào)pH至7.4。向溶液中加入2,3-DPG或2,3-二磷酸吡哆醛等調(diào)節(jié)人Hb氧親和力的共價(jià)調(diào)節(jié)劑后，用ABL520血?dú)夥治鰞x(Radiometer)檢測，此分子量分布在100KD至500KD之間的聚合人Hb的50％氧飽和度(P50)為26mmHg。
上述各實(shí)施例中，聚合劑與人或牛血紅蛋白的分子數(shù)之比為21.3∶1，此比例變化時(shí)聚合反應(yīng)仍可進(jìn)行。
保護(hù)上述各聚合劑與人血紅蛋白和牛血紅蛋白的聚合反應(yīng)。
這些聚合反應(yīng)的產(chǎn)物可作以下幾方面的應(yīng)用1．出血性休克的復(fù)蘇；2．特定的圍手術(shù)期血液稀釋；3．在紅細(xì)胞血型不合時(shí)替代輸血；4．冠脈成形術(shù)中的灌注液；5．離體器官的保存；5．增強(qiáng)腫瘤放療的療效。
本發(fā)明的血液替代品的實(shí)例如下(注PolyHb為聚合牛Hb或聚合人Hb)
權(quán)利要求
1．式(Ⅰ)化合物作為血紅蛋白聚合劑的應(yīng)用。 其中R’代表H-或1-10個(gè)碳的支鏈或支鏈烷基。R代表 或 或 A代表H-或1-10個(gè)碳的支鏈或支鏈烷基，n為1至7的阿拉伯?dāng)?shù)字。
2．權(quán)利要求1中的化合物是丙酮醛、2,3-丁二酮、1-羥基-2-丁酮、3-羥基-2-丁酮、2,3-己二酮、2,4-己二酮、2,5-己二酮、3-乙基-2,4-戊二酮、6-甲基-2,4-庚二酮、丙酮醇。
3．用權(quán)利要求1中的化合物作為血紅蛋白聚合劑制備聚合血紅蛋白的方法，其特征是用式(Ⅰ)化合物與人或牛的血紅蛋白反應(yīng)。
4．用權(quán)利要求3中的聚合血紅蛋白制備血液替代品。
5．權(quán)利要求4中用聚合血紅蛋白制備出的血液替代品。
6．權(quán)利要求5中的血液替代品的制備方法，其特征在于將聚合血紅蛋白溶解于電解質(zhì)和pH值與血漿近似的溶液，此溶液含有還原型谷胱甘肽(GSH)或其他巰基(-SH)供體。
全文摘要
本發(fā)明公開了新的血紅蛋白(Hb)聚合劑,他們的制備及應(yīng)用,本發(fā)明的Hb聚合劑顯著提高了聚合反應(yīng)的能壘、降低了聚合反應(yīng)的速度,反應(yīng)體系的凝膠化基本被完全抑制,大分子聚合物的形成被降到很低的水平,產(chǎn)物以低聚態(tài)的聚合Hb為主,基本實(shí)現(xiàn)了Hb聚合反應(yīng)的可控制。
文檔編號(hào)A61K38/42GK1306858SQ0010064
公開日2001年8月8日 申請(qǐng)日期2000年1月25日 優(yōu)先權(quán)日2000年1月25日
發(fā)明者王鶴堯 申請(qǐng)人:王鶴堯