本發(fā)明屬于微生物治理重金屬污染技術(shù)領(lǐng)域,具體涉及一株生長(zhǎng)迅速、對(duì)土壤鎘生物轉(zhuǎn)化效率高的喜溫酸硫桿狀菌新菌株的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

土壤是生態(tài)環(huán)境的重要組成部分，在各類環(huán)境要素中，例如水污染、大氣污染嚴(yán)重的地區(qū)，隨著水流、降雨、大氣流動(dòng)等自然現(xiàn)象，污染物最終進(jìn)入土壤，逐漸轉(zhuǎn)化為土壤污染，使土壤成為污染物的最終受體。重金屬在土壤中的吸附和聚集等作用，逐漸導(dǎo)致土壤中重金屬含量嚴(yán)重超標(biāo)，土壤內(nèi)源污染嚴(yán)重。當(dāng)前，土壤污染導(dǎo)致的不良影響備受關(guān)注，成為了環(huán)境治理的熱點(diǎn)，采用微生物修復(fù)土壤中cr、cd、pb等重金屬不但具有耗能少，操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)也是一種環(huán)境友好型的可持續(xù)發(fā)展的治理手段。

acidithiobacilluscaldus是一種無(wú)機(jī)化能自養(yǎng)型的桿狀微生物，屬于革蘭氏陰性菌。主要與硫化礦系的生物浸出息息相關(guān)，其對(duì)礦石微生物浸出的機(jī)制為直接作用，喜溫酸硫桿狀菌(acidithiobacilluscaldus)吸附在礦物表面，通過(guò)蛋白分泌物或其他代謝產(chǎn)物直接將硫化礦氧化分解，使硫化礦的晶格破壞，分解成為金屬離子和硫單質(zhì)，喜溫酸硫桿狀菌(acidithiobacilluscaldus)再進(jìn)一步將硫單質(zhì)氧化生成硫酸。

acidithiobacilluscaldus將硫單質(zhì)氧化成硫酸，有助于還原土壤中的重金屬，促進(jìn)重金屬的溶解，同時(shí)產(chǎn)生的硫酸降低土壤的ph，使土壤中陽(yáng)離子交換能力減弱，進(jìn)而使金屬和土壤成分靜電吸引力減弱，降低土壤對(duì)金屬的吸附能力，使其溶解在溶液中，有助于土壤重金屬污染的治理。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種喜溫酸硫桿狀菌新菌株在土壤中鎘的生物轉(zhuǎn)化上的應(yīng)用。該菌株生長(zhǎng)迅速、產(chǎn)酸能力強(qiáng)，并能對(duì)土壤中鐵錳結(jié)合態(tài)鎘變成小分子可溶性鎘進(jìn)行高效的生物轉(zhuǎn)化，為微生物在環(huán)境治理和生物冶金等方面的高效開發(fā)利用提供技術(shù)指導(dǎo)。

一株喜溫酸硫桿狀菌的應(yīng)用，利用該菌株dx-csu將土壤中的鎘去除，該菌株命名為acidithiobacilluscaldus，保藏編號(hào)為cgmccno.14008。具體是利用該菌株將土壤中鐵錳結(jié)合態(tài)鎘轉(zhuǎn)變成小分子可溶性鎘。

作為進(jìn)一步的改進(jìn)，將9k培養(yǎng)基培養(yǎng)的菌濃為1×10⁸～1×10⁹cell/ml的菌液以固液質(zhì)量體積比為1g:10ml添加至鎘污染土壤的錐形瓶中，培養(yǎng)6d以上。

本發(fā)明所提供的喜溫酸硫桿狀菌是喜溫酸硫桿狀菌(acidithiobacilluscaldus)dx-csu，保藏編號(hào)為cgmccno.14008。

所述的acidithiobacilluscaldusdx-csu的篩選方法如下：：

(1)將德興采集的礦樣加入內(nèi)裝100ml無(wú)菌水和玻璃珠的三角瓶中；

(2)將步驟(1)的三角瓶放置恒溫?fù)u床中培養(yǎng)；

(3)從步驟(2)中取懸濁液加入9ml無(wú)菌水中，依次稀釋10^-5，10^-6，10^-7，10^-8，10^-9，10^-10倍；

(4)取步驟(3)懸濁液1ml加入100ml滅菌的改良的9k培養(yǎng)基中，置于45℃恒溫箱中培養(yǎng)0.5d、1d和3d；

(5)將步驟(4)每個(gè)濃度重復(fù)3次；

(6)將(3)至(5)步驟重復(fù)4-5次。

acidithiobacilluscaldusdx-csu菌株16srrna基因序列測(cè)序結(jié)果表明acidithiobacilluscaldusdx-csu菌株的16srrna基因序列見序列表，根據(jù)測(cè)序結(jié)果與genbank中喜溫酸硫桿狀菌16srrna基因序列進(jìn)行同源性比較，結(jié)果表明acidithiobacilluscaldusdx-csu屬于喜溫酸硫桿狀菌。

acidithiobacilluscaldusdx-csu菌株全基因組基因序列測(cè)序結(jié)果表明acidithiobacilluscaldusdx-csu菌株的全基因序列與genbank中喜溫酸硫桿狀菌全基因序列進(jìn)行同源性比較，結(jié)果表明acidithiobacilluscaldusdx-csu是一個(gè)新的菌株。

本發(fā)明的喜溫酸硫桿狀菌(acidithiobacilluscaldusdx-csu)的培養(yǎng)基，其為改良的9k培養(yǎng)基，包含：k2hpo40.5g/l；ca(no3)2·4h2o0.01g/l；kcl,0.1g/l；mgso4·7h2o0.5g/l；(nh4)2so43.0g/l，1000ml蒸餾水；用稀h2so4調(diào)ph值至2.5，加入0.2％的硫粉作為能源物質(zhì)。

本發(fā)明的喜溫酸硫桿狀菌(acidithiobacilluscaldusdx-csu)的培養(yǎng)方法，采用上述的培養(yǎng)基，接種的喜溫酸硫桿狀菌(acidithiobacilluscaldusdx-csu)濃度為1.0×10⁶個(gè)/毫升，初始ph值為2.5，培養(yǎng)溫度為45℃，搖床轉(zhuǎn)速170rpm。

本發(fā)明提供的一株喜溫酸硫桿狀菌(acidithiobacilluscaldusdx-csu)生長(zhǎng)迅速、產(chǎn)酸能力強(qiáng)，對(duì)土壤鎘生物轉(zhuǎn)化效率高，有助于解決環(huán)境中重金屬污染問(wèn)題，以及生物冶金技術(shù)中低品位礦石的金屬生物浸出。

本發(fā)明喜溫酸硫桿狀菌株dx-csu命名為喜溫酸硫桿狀菌acidithiobacilluscaldus，保藏編號(hào)為cgmccno.14008，于2017年4月10日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理文員會(huì)普通微生物中心(cgmcc)。地址為北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)。

附圖說(shuō)明

圖1為四株不同種的喜溫酸硫桿狀菌(acidithiobacilluscaldus)培養(yǎng)基溶液ph隨時(shí)間變化；

圖2為四株不同種的喜溫酸硫桿狀菌(acidithiobacilluscaldus)培養(yǎng)基溶液eh隨時(shí)間變化；

圖3為四株不同種的喜溫酸硫桿狀菌(acidithiobacilluscaldus)培養(yǎng)基中菌濃度隨時(shí)間變化；

圖4為acidithiobacilluscaldusdx-csu作用下土壤溶液中鐵錳結(jié)合態(tài)鎘的變化；

圖5a為基于喜溫酸硫桿狀菌(acidithiobacilluscaldus)不同菌株的全基因組構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹；

b為acidithiobacilluscaldusdx-csu全基因組草圖。

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合實(shí)施例只在進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，而非限制本發(fā)明。

實(shí)施例1、喜溫酸硫桿狀菌(acidithiobacilluscaldusdx-csu)的分離

喜溫酸硫桿狀菌(acidithiobacilluscaldusdx-csu)的分離從德興地礦石采集礦樣10g，加入內(nèi)裝100ml無(wú)菌水和玻璃珠的三角瓶中，于170r/min搖床上振蕩20min，取1ml加入9ml無(wú)菌水中，依次稀釋10^-5，10^-6，10^-7，10^-8，10^-9，10^-10倍，分別取以上懸濁液1ml加入100ml滅菌的9k培養(yǎng)基中，每個(gè)濃度重復(fù)3次，置于45℃恒溫箱中培養(yǎng)0.5d、1d和3d，重復(fù)4-5次上述步驟對(duì)細(xì)菌進(jìn)行分離和純化。

實(shí)施例2、喜溫酸硫桿狀菌(acidithiobacilluscaldusdx-csu)的鑒定

(1)acidithiobacilluscaldusdx-csu菌株16srrna基因序列測(cè)序結(jié)果顯示acidithiobacilluscaldusdx-csu菌株的16srrna基因序列見序列表，根據(jù)測(cè)序結(jié)果與genbank中喜溫酸硫桿狀菌16srrna基因序列進(jìn)行同源性比較，結(jié)果表明acidithiobacilluscaldusdx-csu屬于喜溫酸硫桿狀菌。

(2)acidithiobacilluscaldusdx-csu菌株全基因組基因序列測(cè)序結(jié)果表明acidithiobacilluscaldusdx-csu菌株的全基因的測(cè)序結(jié)果與genbank中喜溫酸硫桿狀菌全基因序列進(jìn)行同源性比較，結(jié)果表明acidithiobacilluscaldusdx-csu是一個(gè)新的菌株。

實(shí)施例3、喜溫酸硫桿狀菌(acidithiobacilluscaldus)的生理性質(zhì)

比較了本實(shí)驗(yàn)室篩選的四株不同種的喜溫酸硫桿狀菌(acidithiobacilluscaldus)培養(yǎng)基溶液ph和eh隨時(shí)間變化；其結(jié)果表明本發(fā)明的喜溫酸硫桿狀菌(acidithiobacilluscaldusdx-csu)ph明顯低于其他三種，同時(shí)結(jié)果表明本發(fā)明的喜溫酸硫桿狀菌(acidithiobacilluscaldusdx-csu)eh明顯高于其他三種，說(shuō)明本發(fā)明菌株產(chǎn)酸能力強(qiáng)。見說(shuō)明書附圖1，2。

比較了四株不同種的喜溫酸硫桿狀菌(acidithiobacilluscaldus)培養(yǎng)基中菌濃度隨時(shí)間變化；其結(jié)果表明本發(fā)明的喜溫酸硫桿狀菌(acidithiobacilluscaldusdx-csu)生長(zhǎng)速度明顯快于其他三種。見說(shuō)明書附圖3。

實(shí)施例4、喜溫酸硫桿狀菌(acidithiobacilluscaldusdx-csu)在cd污染土壤中生物去除效率實(shí)驗(yàn)

(1)采集鎘污染土壤作為供試土壤，混合均勻后，選取部分測(cè)量該土壤中原始鐵錳結(jié)合態(tài)鎘的濃度。

(2)9k培養(yǎng)基121℃滅菌30min，將菌液(菌濃為1×10⁸～1×10⁹cell/ml)以固液質(zhì)量體積比為1g:10ml添加至含供試土壤的錐形瓶中，培養(yǎng)6d，分別于培養(yǎng)的2d，4d，5d，6d測(cè)量土壤中鐵錳結(jié)合態(tài)，結(jié)果表明，acidithiobacilluscaldusdx-csu能有效降低土壤中鐵錳結(jié)合態(tài)鎘含量,生物去除率可達(dá)到49.5％，明顯高于其余三株菌。見說(shuō)明書附圖4。

sequencelisting

<110>中南大學(xué)

湖南省農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究中心

<120>一株喜溫酸硫桿狀菌的應(yīng)用

<130>無(wú)

<160>1

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>1402

<212>dna

<213>acidithiobacilluscaldusdx-csu16srrna序列表

<400>1

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