本發(fā)明一種馬鈴薯晚疫病菌lamp檢測(cè)引物及其可視化檢測(cè)用法，專用于馬鈴薯晚疫病菌高特異性、靈敏度可視化快速檢測(cè)，同時(shí)可用于田間馬鈴薯晚疫病的早期診斷和病菌的監(jiān)測(cè)和鑒定，屬于農(nóng)作物病害檢測(cè)、鑒定及防治技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

由晚疫病菌（phytophthorainfestans(mont)debary）引起的晚疫病是馬鈴薯生產(chǎn)上一種毀滅性的病害，在世界各馬鈴薯主產(chǎn)區(qū)均有發(fā)生和流行，嚴(yán)重威脅著馬鈴薯的生產(chǎn)，其造成的危害、防治難度及對(duì)社會(huì)影響已超過(guò)水稻稻瘟病和小麥條銹病，被視為國(guó)際第一大作物病害。晚疫病在我國(guó)發(fā)生普遍而嚴(yán)重，每年因感晚疫病造成約80億元人民幣的經(jīng)濟(jì)損失，已成為限制我國(guó)馬鈴薯生產(chǎn)和實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化的第一大障礙。由于目前缺乏有效的病害早期診斷技術(shù)，發(fā)病后盲目大量使用藥劑防治引起農(nóng)藥殘留，造成食品安全問(wèn)題，而且防治效果不理想。因此，研發(fā)出馬鈴薯晚疫病的早期快速診斷并進(jìn)行及時(shí)監(jiān)測(cè)，對(duì)保障馬鈴薯產(chǎn)業(yè)健康生產(chǎn)及食品安全至關(guān)重要。

目前病害檢測(cè)方法主要采用傳統(tǒng)的病原分離檢測(cè)方法和分子檢測(cè)等技術(shù)。傳統(tǒng)檢測(cè)方法耗時(shí)、耗力，且檢測(cè)結(jié)果可靠性低，免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)的靈敏度較低，且抗體的制作過(guò)程耗時(shí)、復(fù)雜，檢測(cè)成本高，pcr技術(shù)雖然快速、準(zhǔn)確，但需昂貴的儀器設(shè)備，檢測(cè)成本高，不適宜在基層部門推廣應(yīng)用。而最近科學(xué)家們研發(fā)出的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(loop-mediatedisothermalamplification，lamp)技術(shù)是一種高效率的核酸等溫?cái)U(kuò)增方法，該方法短時(shí)間內(nèi)實(shí)現(xiàn)產(chǎn)物的大量擴(kuò)增，靈敏度比pcr高，且操作步驟簡(jiǎn)便，無(wú)需特殊設(shè)備，檢測(cè)結(jié)果可由肉眼判斷，極適合在基層生產(chǎn)部門推廣應(yīng)用。本發(fā)明基于環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（lamp）技術(shù)，建立馬鈴薯晚疫病菌的可視化檢測(cè)，根據(jù)lamp技術(shù)原理，選取馬鈴薯晚疫病菌的核糖體基因上的內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(internaltranscribedspacer,its)靶序列的6個(gè)區(qū)域，進(jìn)而設(shè)計(jì)出4條特異性引物，通過(guò)對(duì)反應(yīng)體系和反應(yīng)條件的優(yōu)化，以鈣黃綠素（calcein）的熒光顯色指示劑作用，建立可視化lamp檢測(cè)技術(shù)。該體系對(duì)馬鈴薯晚疫病菌檢測(cè)具有高的特異性與靈敏性。并在此基礎(chǔ)上研發(fā)出可視化快速檢測(cè)試劑盒。該技術(shù)是一種操作簡(jiǎn)單、靈敏度和特異性高的快速檢測(cè)手段；無(wú)需特殊儀器設(shè)備，同時(shí)開(kāi)發(fā)的快速檢測(cè)試劑盒適合田間馬鈴薯生產(chǎn)中開(kāi)展實(shí)地檢測(cè)與監(jiān)測(cè)，從而保障馬鈴薯健康生產(chǎn)及食品安全。

目前，對(duì)植物病害的傳統(tǒng)檢測(cè)鑒定方法是首先進(jìn)行病菌分離，通過(guò)對(duì)已經(jīng)分離并純化的病菌進(jìn)行培養(yǎng)，觀察，完成形態(tài)上的鑒定工作。同時(shí)，將病原菌回接到植株中，進(jìn)行致病性的驗(yàn)證。最后，對(duì)照已有的分類資料確定引起病害的病原菌的分類和地位。該法作為最基本的病原菌鑒定方法在一直以來(lái)被廣泛使用，有著很強(qiáng)實(shí)用性，是病原菌的鑒定及病害檢測(cè)的方法之一，但是該方法受人為因素和環(huán)境的影響，對(duì)操作者的實(shí)驗(yàn)技能和實(shí)際經(jīng)驗(yàn)有很高的要求，十分耗時(shí)，無(wú)法達(dá)到快速檢驗(yàn)的要求。

免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)（immunologicaltechnology）具有操作簡(jiǎn)單、特異性強(qiáng)，以及檢測(cè)時(shí)間短的優(yōu)點(diǎn)，適合開(kāi)發(fā)檢測(cè)試劑盒。但其不能對(duì)檢測(cè)對(duì)象進(jìn)行擴(kuò)增，所以靈敏度不及核酸檢測(cè)技術(shù)高。另外，抗體的制作過(guò)程耗時(shí)、復(fù)雜，提高了檢測(cè)的成本。這兩點(diǎn)缺點(diǎn)限制了免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)的推廣使用。

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerasechainreaction，pcr）是一種利用dna聚合酶在體外大量擴(kuò)增靶序列的技術(shù)，該技術(shù)是病原檢測(cè)最常規(guī)的方法之一，廣泛應(yīng)用于病原鑒定、變異檢測(cè)等分子生物學(xué)研究。pcr檢測(cè)技術(shù)靈敏度高、特異性強(qiáng)，已成為病原菌檢測(cè)重要的技術(shù)之一，主要包括常規(guī)pcr、巢式pcr（nest-pcr）和實(shí)時(shí)熒光定量pcr等，主要的缺點(diǎn)是需要依靠pcr等儀器設(shè)備，不利于基層生產(chǎn)上推廣應(yīng)用。

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（loop-mediatedisthermalamplification，lamp）技術(shù)是由日本科學(xué)家開(kāi)發(fā)的一種最新的簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確及廉價(jià)的核酸高效擴(kuò)增方法。lamp技術(shù)是一種新型的核酸恒溫?cái)U(kuò)增方法。該技術(shù)在等溫條件下，可在短時(shí)間內(nèi)使產(chǎn)物得到大量擴(kuò)增，在短短30-60min內(nèi)就能實(shí)現(xiàn)10⁹-10¹⁰倍的擴(kuò)增。同時(shí)具有很高的靈敏度和特異性，且操作簡(jiǎn)便，檢測(cè)結(jié)果可肉眼判斷，反應(yīng)結(jié)束后用肉眼觀察是否產(chǎn)生焦磷酸鎂沉淀，即可判斷靶序列是否存在。亦可在反應(yīng)液中加入熒光指示劑，使反應(yīng)結(jié)果的肉眼觀察更加的方便、直觀和可靠。

lamp技術(shù)操作簡(jiǎn)單、快速高效，而且檢測(cè)特異性非常強(qiáng)，其最大的優(yōu)勢(shì)就是在恒溫條件即可進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，無(wú)需特殊實(shí)驗(yàn)設(shè)備，相較于普通pcr技術(shù)，其有很多優(yōu)點(diǎn)（表1）。

表1.lamp技術(shù)與常規(guī)pcr技術(shù)比較

綜上，目前植物病害的檢測(cè)主要有傳統(tǒng)檢測(cè)和分子生物學(xué)檢測(cè)。其中，傳統(tǒng)檢測(cè)法耗時(shí)、耗力，檢測(cè)結(jié)果可靠性往往比較低；分子生物學(xué)檢測(cè)法主要有常規(guī)pcr、nest-pcr和qpcr等，pcr方法能快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)病原，但需特定儀器設(shè)備，且檢測(cè)成本比較高，不適合基層檢驗(yàn)檢疫部門的推廣應(yīng)用，使田間病情難以得到及時(shí)、準(zhǔn)確的檢測(cè)，嚴(yán)重阻礙了馬鈴薯產(chǎn)業(yè)發(fā)展?；谀壳榜R鈴薯晚疫病在我國(guó)嚴(yán)重發(fā)生，因此，建立一套簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確、有效、經(jīng)濟(jì)的馬鈴薯晚疫病菌的檢測(cè)技術(shù)非常重要。此技術(shù)可應(yīng)用于馬鈴薯晚疫病菌引起病害顯癥之前的早期監(jiān)測(cè)，對(duì)于確定病害防治最佳時(shí)期具有重要的作用，為防治策略的制定提供技術(shù)支持。由于lamp反應(yīng)具有簡(jiǎn)單、快速、高效、經(jīng)濟(jì)等特征，因而具有極為廣泛的應(yīng)用前景。目前l(fā)amp檢測(cè)主要應(yīng)用于人畜病原物、食品安全和環(huán)境衛(wèi)生的檢測(cè)，在植物病原菌檢測(cè)中報(bào)道極少，馬鈴薯晚疫病菌的檢測(cè)國(guó)內(nèi)外均未見(jiàn)報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中馬鈴薯晚疫病菌的傳統(tǒng)檢測(cè)方法所需周期長(zhǎng)、檢測(cè)方法特異性差，pcr檢測(cè)需要依靠擴(kuò)增儀等設(shè)備，且靈敏度低的問(wèn)題，提供一種馬鈴薯晚疫病菌的lamp檢測(cè)引物以及結(jié)果可靠、易于操作、特異性強(qiáng)、靈敏度高的馬鈴薯晚疫病菌的可視化檢測(cè)方法。

實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的包括下列步驟：

1．lamp引物的設(shè)計(jì)

根據(jù)馬鈴薯晚疫病菌小g蛋白ras家族編碼基因（ypt1）序列在病菌種間高度變異和種內(nèi)穩(wěn)定性，采用primerexplorerv4軟件設(shè)計(jì)了對(duì)馬鈴薯晚疫病菌具有特異擴(kuò)增作用的lamp檢測(cè)引物，包括2條外引物(f3和b3)和2條內(nèi)引物(fip和bip)，引物序列分別為：

f3:ccgtacgatcgagctgga；

b3:caccgcggtagtaactgc；

fip:tggaaatcacgcggggacaaa-gcaagaccatcaagctccaa；

bip:caacagtgggacactgccgg-caccgcggtagtaactgc。

2．馬鈴薯晚疫病菌快速檢測(cè)體系的建立

lamp檢測(cè)：25μl反應(yīng)體系中含20mmtris-hcl，10mm(nh4)2so4，10mmkcl，8mmmgso4，甜菜堿0.8mol/l，bstdna聚合酶為8u，dntps1.0mmol/l，f3和b3為0.2mmol/l，fip和bip各1.6mmol/l，鈣黃綠素50μmol/l，氯化錳500μmol/l，tween-200.1%，模板dna50~100ng，不足部分用無(wú)菌雙蒸水補(bǔ)足；lamp反應(yīng)條件為在63-65℃溫育45-60min，85℃滅活5-10min。

所述的檢測(cè)方法為熒光染料目測(cè)觀察法或瓊脂糖凝膠電泳法。所述熒光染料目測(cè)觀察法：在lamp反應(yīng)后，顯色結(jié)果觀察到綠色熒光判斷為陽(yáng)性，橙色判斷為陰性。所述瓊脂糖凝膠電泳法：取2μlpcr擴(kuò)增產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，如果出現(xiàn)lamp特征性的梯形帶判斷為陽(yáng)性，沒(méi)有出現(xiàn)擴(kuò)增條帶判斷為陰性。

該方法可用于帶菌的植株的高靈敏度快速檢測(cè)。建立馬鈴薯晚疫病菌快速、簡(jiǎn)便、特異性強(qiáng)、靈敏度高的監(jiān)測(cè)技術(shù)體系，對(duì)于馬鈴薯晚疫病菌顯癥之前的早期監(jiān)測(cè)，確定病害防治最佳時(shí)期具有十分重要的意義。

本發(fā)明的關(guān)鍵性技術(shù)是馬鈴薯晚疫病菌的高效特異擴(kuò)增的引物序列及其擴(kuò)增方法。為了驗(yàn)證馬鈴薯晚疫病菌檢測(cè)的特異性，本發(fā)明以采集分離的4株馬鈴薯晚疫病菌和21個(gè)其它近緣卵菌及其他真菌為供試材料，對(duì)檢測(cè)的特異性進(jìn)行l(wèi)amp驗(yàn)證。

lamp檢測(cè)：25μl反應(yīng)體系中含20mmtris-hcl，10mm(nh4)2so4，10mmkcl，8mmmgso4，甜菜堿0.8mol/l，bst聚合酶為8u，dntps1.0mmol/l，f3和b3為0.2mmol/l，fip和bip各1.6mmol/l，鈣黃綠素50μmol/l，氯化錳500μmol/l，tween-200.1%，模板dna50~100ng，不足部分用無(wú)菌雙蒸水補(bǔ)足；lamp反應(yīng)條件為在63-65℃溫育45-60min，85℃滅活5-10min。

除了4株馬鈴薯晚疫病菌顯色結(jié)果可觀察到綠色熒光或瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)出現(xiàn)lamp特征性的梯形帶外，檢測(cè)了21個(gè)其它近緣卵菌與其他真菌的顯色結(jié)果為橙色或瓊脂糖凝膠電泳沒(méi)有出現(xiàn)擴(kuò)增條帶。這說(shuō)明該引物可被用于生產(chǎn)實(shí)踐中馬鈴薯晚疫病快速可靠的檢測(cè)和鑒定。

當(dāng)在用于馬鈴薯組織中存在馬鈴薯晚疫病菌的檢測(cè)時(shí)，采用naoh快速裂解法提取馬鈴薯晚疫病菌的dna，具體過(guò)程如下：(1)將馬鈴薯病葉或病莖洗凈、晾干，剪取發(fā)病部位；(2)按1mg病葉加入10μl（0.5mol/lnaoh，0.5%pvp）計(jì)量，將組織充分磨碎成糊，在12,000g離心機(jī)中離心5min；(3)取上清20μl與等體積的0.1mol/l的tris-hcl（ph8.0）混合；(4)稀釋10倍、100倍、1000倍液，分別取1μl原液、10倍、100倍、1000倍液作為pcr模板進(jìn)行擴(kuò)增。

按如下lamp反應(yīng)體系和反應(yīng)條件用所設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行檢測(cè)：

①lamp反應(yīng)體系25μl：25μl反應(yīng)體系中含20mmtris-hcl，10mm(nh4)2so4，10mmkcl，8mmmgso4，甜菜堿0.8mol/l，bstdna聚合酶為8u，dntps1.0mmol/l，f3和b3為0.2mmol/l，fip和bip各1.6mmol/l，鈣黃綠素50μmol/l，氯化錳500μmol/l，tween-200.1%，模板dna50~100ng，不足部分用無(wú)菌雙蒸水補(bǔ)足；lamp反應(yīng)條件為在63-65℃溫育45-60min，85℃滅活5-10min。

②在lamp反應(yīng)后，顯色結(jié)果觀察到綠色熒光，或取2μl擴(kuò)增產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果出現(xiàn)lamp特征性的梯形帶，即可判斷所述的馬鈴薯組織中存在馬鈴薯晚疫病菌；否則所述的馬鈴薯組織中未存在馬鈴薯晚疫病菌。

本發(fā)明有益效果：本發(fā)明方法適用于植株中馬鈴薯晚疫病菌的lamp可視化快速穩(wěn)定的檢測(cè)和鑒定，對(duì)于生產(chǎn)中馬鈴薯晚疫病菌引起的病害防治具有重要的實(shí)用價(jià)值。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下的技術(shù)優(yōu)勢(shì)和積極效果：

1、結(jié)果可靠：本發(fā)明所設(shè)計(jì)出的lamp檢測(cè)引物，已經(jīng)采集分離不同地點(diǎn)的4株馬鈴薯晚疫病菌及發(fā)病植物組織進(jìn)行了測(cè)試驗(yàn)證，因此結(jié)果可靠性具有充分的保證。

2、特異性強(qiáng)：本發(fā)明所采用的lamp引物是針對(duì)馬鈴薯晚疫病菌核糖體內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（rdna-its）序列中6個(gè)不同區(qū)域設(shè)計(jì)出4條特異性引物，6個(gè)區(qū)域中任何區(qū)域與引物不匹配均不能進(jìn)行核酸擴(kuò)增，故特異性強(qiáng)。

3、靈敏度高：lamp對(duì)馬鈴薯晚疫病菌的檢測(cè)靈敏度在dna水平上可達(dá)到1.28×10^-4ng/μl，具有很高的靈敏度。

4、實(shí)用性好：本發(fā)明所設(shè)計(jì)出的lamp引物，可用于馬鈴薯晚疫病菌的高靈敏度快速檢測(cè)，因此本方法的實(shí)用性強(qiáng)，可滿足馬鈴薯晚疫病菌進(jìn)行快速可靠的檢測(cè)和鑒定的需要；

5、操作簡(jiǎn)便快速：應(yīng)用本發(fā)明方法，對(duì)馬鈴薯晚疫病菌進(jìn)行檢測(cè)可在1小時(shí)內(nèi)完成，且lamp核酸擴(kuò)增是在等溫條件下進(jìn)行，只需一個(gè)恒溫設(shè)備即可，不需要復(fù)雜的儀器設(shè)備和昂貴的分子試劑，結(jié)果肉眼直接可見(jiàn)。

附圖說(shuō)明

圖1為本發(fā)明馬鈴薯晚疫病菌的lamp檢測(cè)結(jié)果圖。其中左圖表示瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果，其中：泳道m(xù)為dl2000dnamarker，泳道1為陽(yáng)性對(duì)照（馬鈴薯晚疫病菌dna），泳道2為陰性對(duì)照（d.d.h2o）；右圖表示顯色結(jié)果，其中：第1管為陽(yáng)性對(duì)照，顯示綠色熒光，第2管為陰性對(duì)照（見(jiàn)實(shí)施例1）。

圖2為本發(fā)明馬鈴薯晚疫病菌的lamp特異性檢測(cè)結(jié)果圖。上圖表示可視化顯色結(jié)果，2-5顯示綠色熒光；下圖表示瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果，其中：泳道m(xù)為dl2000dnamarker，泳道1為陰性對(duì)照（d.d.h2o）；泳道2-5馬鈴薯晚疫病菌dna，泳道6-11為其他真菌菌株dna（見(jiàn)實(shí)施例2）。

圖3為本發(fā)明馬鈴薯晚疫病菌的lamp靈敏性檢測(cè)結(jié)果圖。上圖表示lamp擴(kuò)增后的顯色結(jié)果，1-7顯示綠色熒光；下圖表示pcr檢測(cè)擴(kuò)增后的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果，其中：泳道m(xù)為dnamarker；泳道1–7模板dna濃度分別為1:1.28×10²ng/μl；2:1.28×10¹ng/μl；3:1.28ng/μl；4:1.28×10^-1ng/μl；5:1.28×10^-2ng/μl；6:1.28×10^-3ng/μl；7:1.28×10^-4ng/μl；泳道1為陰性對(duì)照（d.d.h2o）。（見(jiàn)實(shí)施例3）。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明的技術(shù)內(nèi)容包括馬鈴薯晚疫病菌的lamp檢測(cè)引物，lamp引物及其序列分別為：

f3:ccgtacgatcgagctgga

b3:caccgcggtagtaactgc

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bip:caacagtgggacactgccgg-caccgcggtagtaactgc

利用lamp引物檢測(cè)馬鈴薯晚疫病菌顯色結(jié)果可觀察到綠色熒光或瓊脂糖凝膠電泳出現(xiàn)lamp特征性的梯形帶。

主要試劑：bstdna聚合酶大片段購(gòu)自英國(guó)neb公司；dnamarker購(gòu)自寶生物工程大連有限公司；其余試劑均購(gòu)自生工生物（上海）技術(shù)有限公司。引物由生工生物（上海）技術(shù)有限公司合成。

實(shí)施例1：lamp引物對(duì)馬鈴薯晚疫病菌的可視化檢測(cè)

1．馬鈴薯晚疫病菌的lamp可視化檢測(cè)

①lamp反應(yīng)體系：25μl反應(yīng)體系中含20mmtris-hcl，10mm(nh4)2so4，10mmkcl，8mmmgso4，甜菜堿0.8mol/l，bstdna聚合酶為8u，dntps1.0mmol/l，f3和b3為0.2mmol/l，fip和bip各1.6mmol/l，鈣黃綠素50μmol/l，氯化錳500μmol/l，tween-200.1%，模板dna50~100ng，不足部分用無(wú)菌雙蒸水補(bǔ)足；lamp反應(yīng)條件為在63-65℃溫育45-60min，85℃滅活5-10min。

②在lamp反應(yīng)后，顯色結(jié)果觀察到綠色熒光判斷為陽(yáng)性，橙色判斷為陰性?；蛉?μl擴(kuò)增產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，如果出現(xiàn)lamp特征性的梯形帶判斷為陽(yáng)性，沒(méi)有出現(xiàn)擴(kuò)增條帶判斷為陰性。

2．檢測(cè)結(jié)果

可視化檢測(cè)：陽(yáng)性對(duì)照（馬鈴薯晚疫病菌dna）顯色結(jié)果可觀察到綠色熒光或瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)出現(xiàn)lamp特征性的梯形帶外，陰性對(duì)照（d.d.h2o）顯色結(jié)果為橙色或瓊脂糖凝膠電泳沒(méi)有出現(xiàn)擴(kuò)增條帶。（結(jié)果見(jiàn)圖1），說(shuō)明此引物具有很強(qiáng)的特異性。

實(shí)施例2：lamp引物對(duì)馬鈴薯晚疫病菌的特異性擴(kuò)增

1．馬鈴薯晚疫病菌的lamp特異檢測(cè)

①lamp反應(yīng)體系：25μl反應(yīng)體系中含20mmtris-hcl，10mm(nh4)2so4，10mmkcl，8mmmgso4，甜菜堿0.8mol/l，bstdna聚合酶為8u，dntps1.0mmol/l，f3和b3為0.2mmol/l，fip和bip各1.6mmol/l，鈣黃綠素50μmol/l，氯化錳500μmol/l，tween-200.1%，模板dna50~100ng，不足部分用無(wú)菌雙蒸水補(bǔ)足；lamp反應(yīng)條件為在63-65℃溫育45-60min，85℃滅活5-10min。

②在lamp反應(yīng)后，顯色結(jié)果觀察到綠色熒光判斷為陽(yáng)性，橙色判斷為陰性?；蛉?μl擴(kuò)增產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，如果出現(xiàn)lamp特征性的梯形帶判斷為陽(yáng)性，沒(méi)有出現(xiàn)擴(kuò)增條帶判斷為陰性。

2．檢測(cè)結(jié)果

檢測(cè)的特異性：除了4株馬鈴薯晚疫病菌顯色結(jié)果可觀察到綠色熒光或瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)出現(xiàn)lamp特征性的梯形帶外，檢測(cè)了其它21個(gè)近緣卵菌與其他真菌菌株的顯色結(jié)果為橙色或瓊脂糖凝膠電泳沒(méi)有出現(xiàn)擴(kuò)增條帶。（部分結(jié)果見(jiàn)圖2），說(shuō)明此引物具有很強(qiáng)的特異性。

實(shí)施例3：lamp引物對(duì)馬鈴薯晚疫病菌的靈敏性檢測(cè)

1．馬鈴薯晚疫病菌的lamp靈敏性檢測(cè)

采用10倍濃度系列稀釋法將提取的馬鈴薯晚疫病菌dna稀釋成濃度分別為1:1.28×10²ng/μl；2:1.28×10¹ng/μl；3:1.28ng/μl；4:1.28×10^-1ng/μl；5:1.28×10^-2ng/μl；6:1.28×10^-3ng/μl；7:1.28×10^-4ng/μl；，共7個(gè)不同濃度梯度。

①lamp反應(yīng)體系：25μl反應(yīng)體系中含20mmtris-hcl，10mm(nh4)2so4，10mmkcl，8mmmgso4，甜菜堿0.8mol/l，bstdna聚合酶為8u，dntps1.0mmol/l，f3和b3為0.2mmol/l，fip和bip各1.6mmol/l，鈣黃綠素50μmol/l，氯化錳500μmol/l，tween-200.1%，模板dna50~100ng，不足部分用無(wú)菌雙蒸水補(bǔ)足；lamp反應(yīng)條件為在63-65℃溫育45-60min，85℃滅活5-10min。

②在lamp反應(yīng)后，顯色結(jié)果觀察到綠色熒光判斷為陽(yáng)性，橙色判斷為陰性。或取2μl擴(kuò)增產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，如果出現(xiàn)lamp特征性的梯形帶判斷為陽(yáng)性，沒(méi)有出現(xiàn)擴(kuò)增條帶判斷為陰性。

2．檢測(cè)結(jié)果：馬鈴薯晚疫病菌lamp靈敏性檢測(cè)，顯色結(jié)果可觀察到綠色熒光或瓊脂糖凝膠電泳出現(xiàn)lamp特征性的梯形帶，檢測(cè)靈敏度可達(dá)1.28×10^-4ng/μl，具有很高的靈敏度（見(jiàn)圖3）。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，凡依本發(fā)明申請(qǐng)專利范圍所做的均等變化與修飾，皆應(yīng)屬本發(fā)明的涵蓋范圍。

sequencelisting

<110>福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所

<120>一種馬鈴薯晚疫病菌lamp檢測(cè)引物及其可視化檢測(cè)方法

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