本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種細(xì)胞培養(yǎng)基，尤其是涉及一種神經(jīng)細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

神經(jīng)細(xì)胞是近代神經(jīng)學(xué)科中研究重點(diǎn)之一，在體外特定環(huán)境中，通過(guò)培養(yǎng)可以連續(xù)地直接觀察神經(jīng)細(xì)胞或神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)、生長(zhǎng)、分化、遷移、突觸形成、理化改變以及對(duì)環(huán)境的反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)中常用有血清培養(yǎng)基體外培養(yǎng)原代大鼠的海馬神經(jīng)元細(xì)胞和皮層神經(jīng)細(xì)胞進(jìn)行相關(guān)的研究工作。由于神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)相對(duì)困難，存活率低，非神經(jīng)細(xì)胞比例過(guò)高，不同細(xì)胞培養(yǎng)批次間可重復(fù)性差，由此影響了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性。

導(dǎo)致上述神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)問(wèn)題的主要原因有動(dòng)物血清中的一些成分抑制神經(jīng)細(xì)胞的分化和生長(zhǎng)、每批次培養(yǎng)液中的成分不一致、實(shí)驗(yàn)人員培養(yǎng)細(xì)胞的熟練程度等。為了解決這些問(wèn)題，開(kāi)發(fā)高質(zhì)量的各種成分確定的無(wú)血清培養(yǎng)基勢(shì)在必行。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的就是為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷而提供一種神經(jīng)細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基及其應(yīng)用，本發(fā)明提供的神經(jīng)細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基尤其適用于培養(yǎng)原代大鼠神經(jīng)元細(xì)胞，即作為培養(yǎng)原代大鼠神經(jīng)元細(xì)胞的無(wú)血清培養(yǎng)基。

為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用了以下技術(shù)方案：優(yōu)化無(wú)血清培養(yǎng)基中的各種成分，并將優(yōu)化后的無(wú)血清培養(yǎng)基用于培養(yǎng)大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞和大鼠皮層神經(jīng)細(xì)胞。

本發(fā)明的技術(shù)方案具體包括以下內(nèi)容：

技術(shù)方案一，提供一種神經(jīng)細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基，包括以下成分：

基礎(chǔ)培養(yǎng)基d-mem；

生長(zhǎng)因子：堿性成纖維生長(zhǎng)因子(bfgf)，終濃度：0.1-10μg/ml；表皮生長(zhǎng)因子(egf)，終濃度：0.1-10μg/ml；血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vegf)，終濃度：0.1-10μg/ml；腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(bdnf)，終濃度：0.01-1μg/ml；

蛋白質(zhì)：牛血清白蛋白，終濃度：0.001-0.1％；轉(zhuǎn)鐵蛋白，終濃度10-500μg/ml；

激素：胰島素，終濃度：1-100μg/ml；類(lèi)胰島素生長(zhǎng)因子1(igf-1)，終濃度：0.1-10μg/ml；皮質(zhì)酮，終濃度：1-100μg/ml；黃體酮，終濃度：0.1-10μg/ml；

其它物質(zhì)：大豆胰蛋白酶抑制劑，終濃度：0.1-20μg/ml；丁二胺，終濃度：1-100μg/ml；亞硒酸鈉，終濃度：1-1000μg/ml。

所述的基礎(chǔ)培養(yǎng)基d-mem為來(lái)自于thermo-fisher公司的產(chǎn)品，產(chǎn)品目錄號(hào)：11995065。

所述的神經(jīng)細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基的ph值調(diào)節(jié)至7.4。

技術(shù)方案二，提供上述神經(jīng)細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基的配制方法，每100ml神經(jīng)細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基配制方法如下，其他體積的培養(yǎng)基按比例放大或縮小進(jìn)行配制：

取90ml的dmem培養(yǎng)液，加到一個(gè)干凈的200ml燒杯中；

按照優(yōu)化的最適濃度依次加入上述血清替代物中的各成分；

用0.1n的氫氧化鈉調(diào)節(jié)ph值到7.4；

補(bǔ)加dmem至100ml；

用0.22μm的除菌過(guò)濾器將溶液過(guò)濾到無(wú)菌的200ml藍(lán)蓋瓶中，于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

技術(shù)方案三，提供上述神經(jīng)細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基的應(yīng)用，所述的神經(jīng)細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基配合神經(jīng)細(xì)胞有血清培養(yǎng)基共同使用，進(jìn)行神經(jīng)細(xì)胞的培養(yǎng)。

每100ml神經(jīng)細(xì)胞有血清培養(yǎng)基通過(guò)以下方式配制得到，其他體積的培養(yǎng)基按比例放大或縮小進(jìn)行配制：

無(wú)菌取84mldmem培養(yǎng)基；

無(wú)菌加入10ml胎牛血清，加入5ml馬血清，1ml濃度為10mg/ml的谷氨酰胺；

保存于4℃環(huán)境下備用。

所述的神經(jīng)細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基配合神經(jīng)細(xì)胞有血清培養(yǎng)基共同使用，進(jìn)行大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞貼壁培養(yǎng)，具體步驟如下：

取15-20天的sd大鼠，用常規(guī)方法無(wú)菌取出雙側(cè)海馬，剪碎，置于0.125％(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的胰蛋白酶/edta消化液中，于37℃，5％(體積分?jǐn)?shù))co2，消化20-30分鐘；

將上述消化組織無(wú)菌轉(zhuǎn)至15ml無(wú)菌離心管中，加入3ml神經(jīng)細(xì)胞有血清培養(yǎng)基，然后輕輕吹打，以分散組織成單個(gè)細(xì)胞，得到細(xì)胞懸液；

用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)上述細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度至4～6×10⁵細(xì)胞/ml；

接種細(xì)胞至6孔培養(yǎng)板中，1.5ml/孔，于37℃，5％co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)；

第二天，分別在不同的孔中更換神經(jīng)細(xì)胞有血清培養(yǎng)基或神經(jīng)細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)7天，其間分別換液2次；

第7天后，在神經(jīng)細(xì)胞有血清培養(yǎng)基的孔中加入細(xì)胞分裂抑制劑，繼續(xù)培養(yǎng)，每周換液2次，細(xì)胞分裂抑制劑為含有20ug/ml的脫氧尿苷與40ug/ml的尿苷；

在神經(jīng)細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基的孔中不加入細(xì)胞分裂抑制劑，繼續(xù)培養(yǎng)，每周換液2次。

所述大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞生長(zhǎng)為典型的海馬神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)，3周后神經(jīng)細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基的細(xì)胞致密度大于95％，細(xì)胞生長(zhǎng)質(zhì)量明顯好于有血清培養(yǎng)基培養(yǎng)的細(xì)胞。

所述的神經(jīng)細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基配合神經(jīng)細(xì)胞有血清培養(yǎng)基共同使用，進(jìn)行大鼠皮層神經(jīng)細(xì)胞貼壁培養(yǎng)，具體步驟如下：

取新生的sd大鼠，用常規(guī)方法無(wú)菌取出腦皮層，剝?nèi)ツX膜，剪碎，置于0.125％的胰蛋白酶/edta消化液中，于37℃，5％co2，消化20-30分鐘；

將上述消化組織無(wú)菌轉(zhuǎn)至15ml無(wú)菌離心管中，加入3ml神經(jīng)細(xì)胞有血清培養(yǎng)基，然后輕輕吹打，以分散組織成單個(gè)細(xì)胞，得到細(xì)胞懸液，然后用200目的無(wú)菌篩網(wǎng)過(guò)濾細(xì)胞懸液至另一個(gè)離心管中；

用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)上述細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度至2～4×10⁵細(xì)胞/ml；

接種細(xì)胞至6孔培養(yǎng)板中，1.5ml/孔，于37℃，5％co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)；

第二天，分別在不同的孔中更換神經(jīng)細(xì)胞有血清培養(yǎng)基或神經(jīng)細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)4天，其間分別換液2次；

第4天后，在神經(jīng)細(xì)胞有血清培養(yǎng)基的孔中加入細(xì)胞分裂抑制劑，繼續(xù)培養(yǎng)，每周換液2次，細(xì)胞分裂抑制劑為含有20ug/ml的脫氧尿苷與40ug/ml的尿苷；

在神經(jīng)細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基的孔中不加入細(xì)胞分裂抑制劑，繼續(xù)培養(yǎng)，每周換液2次。

所述大鼠皮層神經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)為典型的皮層神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)，2周后神經(jīng)細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)的細(xì)胞致密度大于95％，細(xì)胞生長(zhǎng)質(zhì)量明顯好于有血清培養(yǎng)基培養(yǎng)的細(xì)胞。

盡管有血清培養(yǎng)基能適用于大多數(shù)細(xì)胞的生長(zhǎng)，但是由于血清中復(fù)雜的成分，導(dǎo)致其中的某些雜質(zhì)可能抑制原代細(xì)胞，特別是神經(jīng)細(xì)胞的生長(zhǎng)。因此本發(fā)明根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道的一些信息，在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中補(bǔ)充了一般細(xì)胞生長(zhǎng)的必要成分如堿性成纖維生長(zhǎng)因子、表皮生長(zhǎng)因子、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、牛血清白蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白、胰島素、類(lèi)胰島素生長(zhǎng)因子1、皮質(zhì)酮、大豆胰蛋白酶抑制劑外，本發(fā)明根據(jù)自己積累的經(jīng)驗(yàn)，還在該培養(yǎng)基配方中添加了一定比例的腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子、黃體酮、丁二胺、亞硒酸鈉，這些成分充分保證了大鼠神經(jīng)細(xì)胞的良好生長(zhǎng)。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明為大鼠神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)提供了更為高效和可靠的無(wú)血清培養(yǎng)基。

附圖說(shuō)明

圖1：實(shí)施例2中大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞在無(wú)血清和有血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)1周的生長(zhǎng)狀況。

圖2：實(shí)施例3中大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞在無(wú)血清和有血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)5天的生長(zhǎng)狀況。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。

實(shí)施例1

一種培養(yǎng)原代大鼠神經(jīng)元細(xì)胞的無(wú)血清培養(yǎng)基及其應(yīng)用，包括以下步驟：

一、無(wú)血清培養(yǎng)基研制

1、基礎(chǔ)培養(yǎng)基d-mem：來(lái)自于thermo-fisher公司的產(chǎn)品，產(chǎn)品目錄號(hào)：11995065；

2、血清替代物：

2.1生長(zhǎng)因子：堿性成纖維生長(zhǎng)因子(bfgf)，終濃度：0.1-10μg/ml；表皮生長(zhǎng)因子(egf),終濃度：0.1-10μg/ml；血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vegf)，終濃度：0.1-10μg/ml；腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(bdnf)，終濃度：0.01-1μg/ml。

2.2蛋白質(zhì)：牛血清白蛋白，終濃度：0.001-0.1％；轉(zhuǎn)鐵蛋白，終濃度10-500μg/ml。

2.3激素：胰島素，終濃度：1-100μg/ml；類(lèi)胰島素生長(zhǎng)因子1(igf-1)，終濃度：0.1-10μg/ml；皮質(zhì)酮，終濃度：1-100μg/ml；黃體酮，終濃度：0.1-10μg/ml。

2.4其它：大豆胰蛋白酶抑制劑，終濃度：0.1-20μg/ml；丁二胺，終濃度：1-100μg/ml；亞硒酸鈉，終濃度：1-1000μg/ml。

3、無(wú)血清培養(yǎng)基的配制(100ml，新鮮配制)

3.1、取90ml的dmem培養(yǎng)液，加到一個(gè)干凈的200ml燒杯中；

3.2、按照優(yōu)化的最適濃度依次加入上述血清替代物中的各成分；

3.3、用0.1n的氫氧化鈉調(diào)節(jié)ph值到7.4；

3.4、補(bǔ)加dmem至100ml；

3.5、用0.22μm的除菌過(guò)濾器將溶液過(guò)濾到無(wú)菌的200ml藍(lán)蓋瓶中，于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

4、無(wú)血清培養(yǎng)基各種成分最適濃度的優(yōu)化

4.1根據(jù)上述血清替代物中的各成分的濃度范圍和配制方法，配制105種無(wú)血清培養(yǎng)基；

4.2用實(shí)施例2中“大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞貼壁培養(yǎng)”的方法測(cè)試各種無(wú)血清培養(yǎng)基的培養(yǎng)效果；

4.3培養(yǎng)效果的指標(biāo)為：海馬神經(jīng)元細(xì)胞的細(xì)胞形態(tài)，細(xì)胞存活率，神經(jīng)元細(xì)胞占總細(xì)胞的比例；

4.4經(jīng)測(cè)試，第65號(hào)無(wú)血清培養(yǎng)基(sfm-65)所培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元細(xì)胞具有典型的海馬神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)，細(xì)胞存活率為97％，神經(jīng)元細(xì)胞占總細(xì)胞的比例為89％。

105種無(wú)血清培養(yǎng)基的組成為以下添加劑的不同成分和比例的組合：

1)基礎(chǔ)培養(yǎng)基d-mem；

2)生長(zhǎng)因子：堿性成纖維生長(zhǎng)因子，終濃度：0.1-10μg/ml；表皮生長(zhǎng)因子，終濃度：0.1-10μg/ml；血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子，終濃度：0.1-10μg/ml；腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，終濃度：0.01-1μg/ml；

3)蛋白質(zhì)：牛血清白蛋白，終濃度：0.001-0.1％；轉(zhuǎn)鐵蛋白，終濃度10-500μg/ml；

4)激素：胰島素，終濃度：1-100μg/ml；類(lèi)胰島素生長(zhǎng)因子1，終濃度：0.1-10μg/ml；皮質(zhì)酮，終濃度：1-100μg/ml；黃體酮，終濃度：0.1-10μg/ml；

5)其它物質(zhì)：大豆胰蛋白酶抑制劑，終濃度：0.1-20μg/ml；丁二胺，終濃度：1-100μg/ml；亞硒酸鈉，終濃度：1-1000μg/ml。

實(shí)施例2、大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞貼壁培養(yǎng)

1、取15-20天的sd大鼠，用常規(guī)方法無(wú)菌取出雙側(cè)海馬，剪碎，置于0.125％的胰蛋白酶/edta消化液中，于37℃，5％co2,消化20-30分鐘；

2、將上述消化組織無(wú)菌轉(zhuǎn)至15ml無(wú)菌離心管中，加入3ml有血清培養(yǎng)基，然后輕輕吹打，以分散組織成單個(gè)細(xì)胞；

3、用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)上述細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度至～5x10⁵細(xì)胞/ml；

4、接種細(xì)胞至6孔培養(yǎng)板中，1.5ml/孔，于37℃，5％co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)；

5、第二天，分別在不同的孔中更換有血清培養(yǎng)基或無(wú)血清培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)7天，其間分別換液2次；

6、第7天后，在有血清培養(yǎng)基的孔中加入細(xì)胞分裂抑制劑(20ug/ml的脫氧尿苷，40ug/ml的尿苷)，繼續(xù)培養(yǎng)，每周換液2次；

7、在無(wú)血清培養(yǎng)基的空中不加入細(xì)胞分裂抑制劑，繼續(xù)培養(yǎng)，每周換液2次。

本實(shí)施例中大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞在無(wú)血清和有血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)1周的生長(zhǎng)狀況如圖1所示?？梢钥闯?，大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞生長(zhǎng)為典型的海馬神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)，3周后神經(jīng)細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基的細(xì)胞致密度大于95％，細(xì)胞生長(zhǎng)質(zhì)量明顯好于有血清培養(yǎng)基培養(yǎng)的細(xì)胞。

實(shí)施例3、大鼠皮層神經(jīng)細(xì)胞貼壁培養(yǎng)

1、取新生的sd大鼠，用常規(guī)方法無(wú)菌取出腦皮層，剝?nèi)ツX膜，剪碎，置于0.125％的胰蛋白酶/edta消化液中，于37℃，5％co2，消化20-30分鐘；

2、將上述消化組織無(wú)菌轉(zhuǎn)至15ml無(wú)菌離心管中，加入5ml有血清培養(yǎng)基，然后輕輕吹打，以分散組織成單個(gè)細(xì)胞，然后用200目的無(wú)菌篩網(wǎng)過(guò)濾細(xì)胞懸液至另一個(gè)離心管中；

3、用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)上述細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度至～3x10⁵細(xì)胞/ml；

4、接種細(xì)胞至6孔培養(yǎng)板中，1.5ml/孔，于37℃，5％co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)；

5、第二天，分別在不同的孔中更換有血清培養(yǎng)基或無(wú)血清培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)4天，其間分別換液2次；

6、第4天后，在有血清培養(yǎng)基的孔中加入細(xì)胞分裂抑制劑(20ug/ml的脫氧尿苷，40ug/ml的尿苷)，繼續(xù)培養(yǎng)，每周換液2次；

7、在無(wú)血清培養(yǎng)基的空中不加入細(xì)胞分裂抑制劑，繼續(xù)培養(yǎng)，每周換液2次。

本實(shí)施例中，大鼠皮層神經(jīng)元細(xì)胞在無(wú)血清和有血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)5天的生長(zhǎng)狀況退2所示，大鼠皮層神經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)為典型的皮層神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)，2周后神經(jīng)細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)的細(xì)胞致密度大于95％，細(xì)胞生長(zhǎng)質(zhì)量明顯好于有血清培養(yǎng)基培養(yǎng)的細(xì)胞。

上述的對(duì)實(shí)施例的描述是為便于該技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能理解和使用發(fā)明。熟悉本領(lǐng)域技術(shù)的人員顯然可以容易地對(duì)這些實(shí)施例做出各種修改，并把在此說(shuō)明的一般原理應(yīng)用到其他實(shí)施例中而不必經(jīng)過(guò)創(chuàng)造性的勞動(dòng)。因此，本發(fā)明不限于上述實(shí)施例，本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明的揭示，不脫離本發(fā)明范疇所做出的改進(jìn)和修改都應(yīng)該在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。