本發(fā)明涉及遺傳病基因檢測領(lǐng)域，更具體地，涉及一種用于擴(kuò)增smn1基因的pcr引物對和用于檢測smn1基因點(diǎn)突變的試劑盒。

背景技術(shù)：

脊髓性肌萎縮(sma)是一種遺傳性神經(jīng)肌肉遺傳病，臨床表現(xiàn)為進(jìn)行性、對稱性肢體近端和軀干肌肉無力、萎縮、呼吸衰竭，是發(fā)病率第二高的致死性常染色體隱性遺傳病。目前尚無有效的治療方法。sma在活產(chǎn)嬰兒中發(fā)病率約為1/6000～1/10000，人群中的攜帶率為1/35～1/80，最新的報(bào)道稱中國人群的攜帶率為1/42。sma最主要的致病基因是運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元存活基因(smn)，該基因突變導(dǎo)致脊髓前角細(xì)胞(脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元)退化、變性，使得患者肌肉日漸萎縮。smn基因定位于5q13區(qū)，具有兩個(gè)高度同源的基因拷貝：smn1和smn2。smn1基因表達(dá)完整而穩(wěn)定的smn功能蛋白，是sma的決定性基因，smn1基因缺陷造成sma表型；smn2基因與smn1基因序列高度相似，僅存在5個(gè)堿基的差異，分別位于第7、8外顯子和第6、7內(nèi)含子中，其中第7外顯子上的c/t的差異，導(dǎo)致smn2在初級轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物pre-mrna剪切加工時(shí)發(fā)生外顯子跳躍，產(chǎn)生的mrna較smn1缺失第7外顯子；研究表明，只有10％-15％的smn2基因能表達(dá)為全長的smn蛋白，因此也被成為sma的補(bǔ)償基因。已有統(tǒng)計(jì)表明，約95％的sma患者為smn1基因純合缺失型(第7和/或第8外顯子純合缺失)，約5％為smn1基因雜合缺失型(第7和/或第8外顯子雜合缺失)與點(diǎn)突變形成復(fù)合雜合突變所致。

根據(jù)sma的致病基因特點(diǎn)，現(xiàn)有的基因診斷技術(shù)主要是分析smn1基因第7外顯子是否有缺失及缺失數(shù)目，不適合用于檢測smn1基因點(diǎn)突變(包括錯(cuò)義、無義、移碼、剪切位點(diǎn)突變)。對于點(diǎn)突變的檢測，由于smn1存在高度同源的smn2基因且基因體長達(dá)32kb，常規(guī)的pcr-sanger測序方法難以避免smn2基因的干擾，給點(diǎn)突變的檢測帶來了極大的困難。目前通常采用的方法有兩種：(1)通過提取總rna，然后利用smn1特異性引物反轉(zhuǎn)錄cdna，再進(jìn)行pcr-sanger測序；(2)應(yīng)用這兩個(gè)基因在第8外顯子和第6內(nèi)含子差異性位點(diǎn)，設(shè)計(jì)特異性引物，分析第7、8外顯子的序列突變情況。這兩種方法前期處理的工作量大，程序復(fù)雜耗費(fèi)大量人力，成本高昂，效率低下；并且不能分析剪切位點(diǎn)突變，第二種方法只能檢測第7、8外顯子突變。

因此，本領(lǐng)域仍然需尋求一種新的檢測smn1基因點(diǎn)突變的方法，提高診斷準(zhǔn)確率，簡化操作流程，提高時(shí)效性。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種用于擴(kuò)增smn1基因的pcr引物對和用于檢測smn1基因點(diǎn)突變的試劑盒。利用本發(fā)明的smn1特異性引物，首先特異性擴(kuò)增smn1超長片段，然后以長片段pcr產(chǎn)物為模板進(jìn)行巢式pcr、對smn1基因的全部外顯子擴(kuò)增，以實(shí)現(xiàn)對smn1基因點(diǎn)突變的檢測。

根據(jù)本發(fā)明，長片段pcr(longrange-pcr，lr-pcr)是指擴(kuò)增長度大于5kb的pcr，與常規(guī)的短片段pcr相比，最大的區(qū)別在于，其受dna模板的二級結(jié)構(gòu)、引物的特異性和退火溫度、以及不理想的循環(huán)條件等因素影響較大，以至于超長片段pcr的擴(kuò)增難度較大。

為了保證擴(kuò)增的特異性，只擴(kuò)增smn1真基因，設(shè)計(jì)引物時(shí)，首先比對smn1基因和smn2基因及上下游序列，尋找差異性位點(diǎn)；在該位點(diǎn)設(shè)計(jì)特異性擴(kuò)增的上下游引物；為了進(jìn)一步提高擴(kuò)增的特異性，降低錯(cuò)配發(fā)生的概率，在差異性位點(diǎn)采用鎖核酸(lna)修飾核苷酸。

根據(jù)本發(fā)明的第一方面，本發(fā)明提供一種用于擴(kuò)增smn1基因的pcr引物對，該pcr引物對包括具有seqidno：1所示堿基序列的引物和具有seqidno：2所示堿基序列的引物：

5'-gtgtttaaggatctgccgcct-3'(seqidno：1)

5'-cgtggctgaggcacgagaacc-3'(seqidno：2)

其中，seqidno：1中位于3’端第2-4位的堿基、seqidno：2中位于5’端第6位和3’端第1位的堿基均為鎖核酸修飾。

本領(lǐng)域技術(shù)人員公知，鎖核酸(lockednucleicacid，lna)是一種寡核甘酸衍生物，和普通寡核甘酸分子區(qū)別在于其結(jié)構(gòu)中含有一個(gè)或多個(gè)2’-o，4’-c-亞甲基-β-d-呋喃核糖核甘酸單體，核糖的2’-o位和4’-c位通過亞甲基橋連接起來，成環(huán)形。

根據(jù)本發(fā)明的第二方面，本發(fā)明提供一種用于檢測smn1基因點(diǎn)突變的試劑盒，該試劑盒包括：上述pcr引物對，以及pcr反應(yīng)用試劑。

根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選地，該試劑盒還包括：擴(kuò)增smn1基因全部外顯子的引物組。

所述擴(kuò)增smn1基因全部外顯子的引物組優(yōu)選包括具有seqidno：3～seqidno：18所示堿基序列的引物。

根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選地，所述pcr反應(yīng)用試劑包括以下組分中的至少一種：mgcl2、dmso、高保真、高效率的dna聚合酶、dntps和pcr反應(yīng)緩沖液。。

所述高保真、高效率的dna聚合酶為擴(kuò)增效率高、高保真性、延伸性能好、適用于gc含量高的dna聚合酶。

其中，各組分可以以存儲液的形式提供。優(yōu)選地，所述的mgcl2存儲液濃度為100mmol/l。所述的dntps存儲液濃度為10mmol/l。

應(yīng)用本發(fā)明的試劑盒，采用鎖核酸引物和超長片段pcr擴(kuò)增可以檢測smn1基因點(diǎn)突變，檢測結(jié)果的精確和可靠，可重復(fù)性好，并且可操作性強(qiáng)。

本發(fā)明的其它特征和優(yōu)點(diǎn)將在隨后具體實(shí)施方式部分予以詳細(xì)說明。

附圖說明

通過結(jié)合附圖對本發(fā)明示例性實(shí)施方式進(jìn)行更詳細(xì)的描述，本發(fā)明的上述以及其它目的、特征和優(yōu)勢將變得更加明顯，其中，在本發(fā)明示例性實(shí)施方式中，相同的參考標(biāo)號通常代表相同部件。

圖1示出了smn1特異性引物的設(shè)計(jì)原理。以人類基因組(hg38)chr5:70924473_70953280序列為參考序列，覆蓋smn1基因全部外顯子及毗鄰區(qū)域。

圖2示出了4個(gè)樣本的超長片段pcr產(chǎn)物的電泳結(jié)果。目的條帶大小為28808bp，電泳結(jié)果與預(yù)期一致。

圖3示出了以長片段pcr為模板，針對各外顯子pcr-瓊脂糖凝膠電泳圖。pcr產(chǎn)物電泳結(jié)果與預(yù)期一致。

圖4示出了第7外顯子及其側(cè)翼的測序經(jīng)長片段pcr結(jié)合巢式pcr-sanger測序，測序結(jié)果證實(shí)長片段pcr擴(kuò)增的特異性，只擴(kuò)增了真基因-smn1基因，未擴(kuò)增smn2基因。

圖5示出了巢式pcr-sanger測序的結(jié)果。樣本1為smn1基因第7外顯子缺失和c.683t>a(p.leu228ter)雜合突變；樣本2為smn1基因第7外顯子缺失和c.280g>t(p.val94phe)雜合突變。

具體實(shí)施方式

下面將參照附圖更詳細(xì)地描述本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式。雖然附圖中顯示了本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，然而應(yīng)該理解，可以以各種形式實(shí)現(xiàn)本發(fā)明而不應(yīng)被這里闡述的實(shí)施方式所限制。

實(shí)施例1

樣本：同時(shí)攜帶smn1基因第7-8外顯子雜合缺失與雜合點(diǎn)突變的sma患者樣本2例；正常人樣本2例。

1、提取待檢測的樣本全基因組dna；

使用omega“基因組dna抽提試劑盒”提取外周血dna，同時(shí)去除rna。提取的dna總體積約為100μl，濃度在20-200ng/μl；a260/280在1.8-2.0之間。

2、超長片段pcr擴(kuò)增覆蓋smn1基因全部外顯子的片段

pcr擴(kuò)增試劑選用kodfxneo(東洋紡，toyobolifescience)dna聚合酶，以基因組dna為模板最大可擴(kuò)增40kb的片段，具有高擴(kuò)增效率、高保真性的特點(diǎn)。(各反應(yīng)組分如表1所示)。

表1.pcr反應(yīng)體系

擴(kuò)增程序：

pcr產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，確定擴(kuò)增片段大小與預(yù)期目的片段大小一致(如圖2所示)。

3、以長片段pcr產(chǎn)物為模板，經(jīng)巢式pcr擴(kuò)增每一個(gè)外顯子

以長片段pcr產(chǎn)物稀釋500倍作為dna模板，用每一對引物對各外顯子擴(kuò)增。

pcr實(shí)驗(yàn)選擇天根生化科技highaffinityhotstarttaq試劑盒(et108)。在pcr反應(yīng)體系中，加入緩沖液、dntps、dna聚合酶、引物、模板dna、h2o。為減少人為誤差，簡化操作流程，首先將pcr擴(kuò)增試劑配置成mix(包括habuffer、dntps、h2o、hotstarttaq)，然后分別與不同突變的特異性引物對混勻，分裝至每個(gè)反應(yīng)孔；最后加入不同樣本dna(各反應(yīng)組分如表2所示)。

表2pcr反應(yīng)體系

pcr擴(kuò)增程序?yàn)椋鹤冃裕?5℃分鐘；pcr循環(huán)擴(kuò)增：95℃變性15秒，62℃，退火20sec，72℃延伸30sec，共25個(gè)循環(huán)；接著72℃繼續(xù)延伸5min。為了針對每一對引物摸索、優(yōu)選合適的pcr條件。pcr結(jié)束后，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析pcr產(chǎn)物為預(yù)期大小的、明亮的單一條帶(如圖3所示)。

4、pcr產(chǎn)物一代測序

pcr產(chǎn)物純化后采用abi公司bigdye3.1測序試劑盒，在abi公司3130xl基因測序儀上對產(chǎn)物直接進(jìn)行雙向測序，用chromas軟件將測序結(jié)果與genebank中的正常參考序列進(jìn)行比對分析，確定基因突變位點(diǎn)。

結(jié)果分析

首先，針對smn1基因和smn2基因存在差異的5個(gè)位點(diǎn)分析，以確保長片段pcr擴(kuò)增產(chǎn)物為真基因-smn1基因。這5個(gè)差異性位點(diǎn)，有4個(gè)位點(diǎn)位于對第7外顯子及其側(cè)翼序列，因此通過比對分析第7外顯子及其側(cè)翼的測序結(jié)果，如圖4所示，4個(gè)差異性位點(diǎn)均為smn1基因特有的，證實(shí)了長片段pcr擴(kuò)增的特異性。

然后，將巢式pcr-sanger測序結(jié)果與smn1基因參考序列(nm_000344)比對，分析各個(gè)外顯子的序列變異情況。如圖5所示，樣本1為smn1基因第7外顯子缺失和c.683t>a(p.leu228ter)雜合突變；樣本2為smn1基因第7外顯子缺失和c.280g>t(p.val94phe)雜合突變。采用本發(fā)明的試劑盒，利用超長片段pcr結(jié)合巢式pcr-sanger測序得到的結(jié)果與rna逆轉(zhuǎn)錄-cdna測序的結(jié)果是一致的，說明利用本發(fā)明的試劑盒進(jìn)行點(diǎn)突變檢測可行、可靠，并且可操作性強(qiáng)。

以上已經(jīng)描述了本發(fā)明的各實(shí)施例，上述說明是示例性的，并非窮盡性的，并且也不限于所披露的各實(shí)施例。在不偏離所說明的各實(shí)施例的范圍和精神的情況下，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說許多修改和變更都是顯而易見的。

sequencelisting

<110>鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院

<120>一種用于擴(kuò)增smn1基因的pcr引物對和用于檢測smn1基因點(diǎn)突變的試劑盒

<130>1700053

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