本發(fā)明屬于血液樣品的保存試劑，具體涉及一種用于保護(hù)游離dna的血液保存劑及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：目前，血漿游離dna在臨床上應(yīng)用越來(lái)越多，例如無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前基因檢測(cè)和腫瘤診斷都是以血漿游離dna為檢測(cè)目標(biāo)。在檢測(cè)過(guò)程中，血漿游離dna的量的多少是一個(gè)重要的檢測(cè)指標(biāo)。人血漿游離dna含量極少，極易被血液中的dna酶降解，并且容易受到白細(xì)胞裂解釋放的基因組dna污染，嚴(yán)重影響檢測(cè)結(jié)果。為了解決這些問(wèn)題，現(xiàn)階段主要采取的措施有：(1)選用帶抗凝劑(edta、肝素、檸檬酸鹽)的采血管采集血液樣本，以防止全血細(xì)胞凝血，減少白細(xì)胞釋放基因組dna；(2)在6小時(shí)內(nèi)分離出血漿，4℃低溫保存運(yùn)輸，并且保存時(shí)間不能過(guò)長(zhǎng)，防止dna酶降解血漿游離dna。通過(guò)以上技術(shù)處理，對(duì)血漿游離dna的精確檢測(cè)可得到一定的改善。但是4℃低溫保存運(yùn)輸情況下，dna酶仍具有一定活性，長(zhǎng)期保存會(huì)使血漿游離dna大量損失，不利于血漿游離dna的精確檢測(cè)。同時(shí)現(xiàn)有條件下，血液的保存和運(yùn)輸都在低溫下進(jìn)行，帶來(lái)了許多不便，使血漿游離dna檢測(cè)經(jīng)濟(jì)成本較高。因此，很有必要提供一種用于保護(hù)游離dna的血液保存劑，旨在解決采用現(xiàn)有的血漿游離dna保存方法，血漿游離dna易受到基因組dna污染，易被dna酶降解，保存時(shí)間短、保存溫度低等問(wèn)題。ws-10001-(hd-0230)-2002公開(kāi)了一種紅細(xì)胞保存液，其中的葡萄糖、腺嘌呤、甘露醇、磷酸鹽有利于紅細(xì)胞的保存，但使具有有核細(xì)胞的全血樣品在室溫穩(wěn)定7至14天時(shí)段的效果仍然不理想。申請(qǐng)?zhí)?01510226039.x的專(zhuān)利公開(kāi)了一種保存外周血中游離dna的保存劑，其保存劑組分中含化學(xué)防腐劑，包括二唑烷基脲、咪唑烷基脲、1,3-二氯-5,5-二甲基乙內(nèi)酰脲、鈉羥甲基甘氨酸、二羥甲基脲、2-溴-2-硝基-1,3-丙二醇、惡唑烷、鈉羥甲基甘氨酸及金剛烷季銨的一種或多種組合。申請(qǐng)?zhí)?01510132774.4的專(zhuān)利公開(kāi)了一種用于保護(hù)游離dna的血液抗凝劑及其應(yīng)用，其血液抗凝劑組分含甲醛釋放劑，包括1,3-二羥甲基-5,5-二甲基海因、羥甲基甘氨酸鈉、尼泊金甲酯鈉、尼泊金乙酯鈉、尼泊金丙酯鈉的一種或幾種。眾所周知，許多化學(xué)防腐劑是有毒的，對(duì)人體有害，且易對(duì)環(huán)境造成污染；甲醛是一種致癌的毒性物質(zhì)，對(duì)人體亦有害。ε-聚賴(lài)氨酸是一種具有抑菌功效的多肽，安全、無(wú)毒。表1列舉幾種化學(xué)物質(zhì)的毒性比較，其中ε-聚賴(lài)氨酸數(shù)據(jù)來(lái)源于nedak等人的《nedak,sakurait,etal.two-generationreproductionstudywithteratologytestofε-poly-l-lysinebydietaryadministrationinrats[j]》.jppharmcolther,1999,27:1139-1159.),其他化學(xué)物質(zhì)的數(shù)據(jù)來(lái)源于物競(jìng)化學(xué)品數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.basechem.org/)。表1幾種化學(xué)物質(zhì)的毒理學(xué)數(shù)據(jù)化學(xué)物質(zhì)大鼠經(jīng)口ld50(mg/kg)ε-聚賴(lài)氨酸＞200001,3-二氯-5,5-二甲基乙內(nèi)酰脲5422-溴-2-硝基-1,3-丙二醇180～400甲醛800茶多酚(＞95％)3940納他霉素4000半數(shù)致死量(lethaldose50％,ld50)：是指能夠引起試驗(yàn)動(dòng)物一半死亡的藥物劑量，對(duì)于化合物急性毒性分級(jí)聯(lián)合國(guó)世界衛(wèi)生組織(who)推薦了一個(gè)五級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，見(jiàn)表2。表2外來(lái)化合物急性毒性分級(jí)化學(xué)物質(zhì)大鼠經(jīng)口ld50(mg/kg)劇毒＜1高毒1-中等毒50-低毒500-微毒5000-由此可見(jiàn)，申請(qǐng)?zhí)?01510226039.x的專(zhuān)利公開(kāi)了一種保存外周血中游離dna的保存劑組分中1,3-二氯-5,5-二甲基乙內(nèi)酰脲和2-溴-2-硝基-1,3-丙二醇是有毒物質(zhì)。申請(qǐng)?zhí)?01510132774.4的專(zhuān)利公開(kāi)了一種用于保護(hù)游離dna的血液抗凝劑組分中的甲醛釋放劑產(chǎn)生的甲醛屬于有毒物質(zhì)，會(huì)對(duì)人體有害。由此可見(jiàn)，現(xiàn)有技術(shù)還存在較大不足。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：鑒于此，有必要針對(duì)上述問(wèn)題提供一種用于保護(hù)游離dna的血液保存劑，對(duì)血漿游離dna保存效果好、安全，更有利于血漿游離dna的精準(zhǔn)檢測(cè)。本發(fā)明目的通過(guò)以下技術(shù)手段來(lái)實(shí)現(xiàn)：一種用于保護(hù)游離dna的血液保存劑，每100毫升該保護(hù)劑包括以下組分：進(jìn)一步的，所述抗凝劑為乙二胺四乙酸二鉀、乙二胺四乙酸三鉀、乙二胺四乙酸二鈉、枸櫞酸納中的一種或幾種?？鼓齽┑奶砑樱梢苑乐鼓?、抑制dna酶。優(yōu)選地，所述抗凝劑為乙二胺四乙酸二鉀。進(jìn)一步的，所述天然防腐劑為ε-聚賴(lài)氨酸、茶多酚(＞95％)、納他霉素中的一種。其中，使用茶多酚(＞95％)或納他霉素時(shí)，與使用ε-聚賴(lài)氨酸對(duì)樣本游離dna的保存效果相當(dāng)。天然防腐劑的添加，有利于血細(xì)胞整體穩(wěn)定，可防止血液變質(zhì)。優(yōu)選地，所述天然防腐劑為ε-聚賴(lài)氨酸。進(jìn)一步的，所述dna酶抑制劑為尿素、硫酸銨、十二烷基硫酸鈉、異硫氰酸胍中的一種或多種。dna酶抑制劑的添加，可防止dna酶介導(dǎo)的血漿游離dna降解。優(yōu)選地，所述dna酶抑制劑為尿素。進(jìn)一步的，所述緩沖液為0.05mol/l三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液、0.2mol/l磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液、1×pbs緩沖液中的一種或幾種，緩沖液的ph值范圍為6.8～8.0。緩沖液的添加，可以穩(wěn)定血液ph，延長(zhǎng)血細(xì)胞的保存期。優(yōu)選地，所述緩沖液為0.05mol/l三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液，ph7.4。進(jìn)一步的，所述葡萄糖是維持血細(xì)胞代謝所需的營(yíng)養(yǎng)成分，延長(zhǎng)紅細(xì)胞保存時(shí)間。進(jìn)一步的，所述抗溶血?jiǎng)楦事洞?、山梨醇、蔗糖?？谷苎獎(jiǎng)┑奶砑涌梢约庸碳?xì)胞膜，緩解紅細(xì)胞溶血。優(yōu)選地，所述抗溶血?jiǎng)楦事洞?。進(jìn)一步的，所述嘌呤為腺嘌呤、鳥(niǎo)嘌呤中的一種或兩種組合。嘌呤的添加，可維持atp的含量、維持紅細(xì)胞形態(tài)。優(yōu)選地，所述嘌呤為腺嘌呤。進(jìn)一步的，本發(fā)明所述保存劑用作采集血液樣本、運(yùn)輸血液樣本或存貯血液樣本時(shí)的樣本游離dna的保存劑。比如，本發(fā)明保存劑可位于一個(gè)專(zhuān)門(mén)的設(shè)備中，并在采血之前加入，該設(shè)備是一個(gè)抽真空的采集容器，可以是但不僅僅是真空采血管。血液樣品被吸入到含本發(fā)明保存劑的真空采血管中，可在常溫下保存7～14天，甚至超過(guò)14天，血細(xì)胞不破裂、形態(tài)穩(wěn)定，血漿游離dna完整無(wú)降解。進(jìn)一步的，所述保存劑用作樣本游離dna的保存劑時(shí)，所述保存劑與血液樣本的體積比為：1:30～1:45。本發(fā)明有益效果：本發(fā)明保存劑組分中添加的是天然防腐劑。天然防腐劑是由生物體分泌或者體內(nèi)存在，經(jīng)過(guò)現(xiàn)代工業(yè)手段獲得的物質(zhì)。此類(lèi)防腐劑為天然物質(zhì)，安全，對(duì)人體無(wú)毒害，更有利于血漿游離dna的精準(zhǔn)檢測(cè)。本發(fā)明的血液保存液采用安全無(wú)毒的天然防腐劑ε-聚賴(lài)氨酸和低毒趨于無(wú)毒的茶多酚(＞95％)和納他霉素，不含甲醛和其他有毒化學(xué)防腐劑。ε-聚賴(lài)氨酸是一種具有抑菌功效的多肽，nedak等人的《nedak,sakurait,etal.two-generationreproductionstudywithteratologytestofε-poly-l-lysinebydietaryadministrationinrats[j].jppharmcolther,1999,27:1139-1159.》對(duì)ε-聚賴(lài)氨酸進(jìn)行毒理學(xué)研究,經(jīng)過(guò)急性與慢性小鼠試驗(yàn)證明,ε-聚賴(lài)氨酸沒(méi)有毒性,甚至ε-聚賴(lài)氨酸高達(dá)20000mg/kg的劑量也不會(huì)產(chǎn)生任何不利效果與基因突變。hirakij等人的《hirakij,ichikawat,ninomiyas,etal.useofadmestudiestoconfirmthesafetyofpolylysineasapreservativeinfood[j].regulatorytoxicologyandpharmacology,2003,37(2):328-340.》用14c標(biāo)記的ε-聚賴(lài)氨酸進(jìn)行adme試驗(yàn)(動(dòng)物的吸收性、分布性、代謝性和排泄性試驗(yàn))也表明ε-聚賴(lài)氨酸的安全性。如表1所示，ε-聚賴(lài)氨酸大鼠經(jīng)口的半數(shù)致死劑量大于20000mg/kg，根據(jù)聯(lián)合國(guó)世界衛(wèi)生組織(who)推薦的對(duì)于化合物急性毒性分級(jí)的五級(jí)標(biāo)準(zhǔn)(表2)可知，本發(fā)明保存劑中的天然防腐劑ε-聚賴(lài)氨酸是微毒甚至無(wú)毒的物質(zhì)，不會(huì)對(duì)人員造成傷害。本發(fā)明所述一種用于保護(hù)游離dna的血液保存劑可有效防止血細(xì)胞破裂釋放基因組dna造成污染、血漿游離dna降解的保護(hù)劑，為血漿游離dna提供穩(wěn)定環(huán)境，有利于對(duì)游離dna更精準(zhǔn)的檢測(cè)分析。血液樣品和本發(fā)明保護(hù)劑混勻后可在常溫下保存7～14天，甚至超過(guò)14天，常溫運(yùn)輸至少4天，延長(zhǎng)了樣本的保存時(shí)間，降低了樣本采集后的儲(chǔ)存條件，從而節(jié)約了游離dna檢測(cè)經(jīng)濟(jì)成本，有利于游離dna檢測(cè)技術(shù)的推廣和普及。附圖說(shuō)明圖1為實(shí)施例1真空采血管1(含125μl保存劑1)中血液樣品室溫靜置保存0天后的游離dna片段分布圖。圖2為實(shí)施例1真空采血管1(含125μl保存劑1)中血液樣品室溫靜置保存4天后的游離dna片段分布圖。圖3為實(shí)施例1真空采血管1(含125μl保存劑1)中血液樣品室溫靜置保存7天后的游離dna片段分布圖。圖4為實(shí)施例1真空采血管1(含125μl保存劑1)中血液樣品室溫靜置保存14天后的游離dna片段分布圖。圖5為實(shí)施例1真空采血管2(含125μl保存劑2)中血液樣品室溫靜置保存0天后的游離dna片段分布圖。圖6為實(shí)施例1真空采血管2(含125μl保存劑2)中血液樣品室溫靜置保存4天后的游離dna片段分布圖。圖7為實(shí)施例1真空采血管2(含125μl保存劑2)中血液樣品室溫靜置保存7天后的游離dna片段分布圖。圖8為實(shí)施例1真空采血管2(含125μl保存劑2)中血液樣品室溫靜置保存14天后的游離dna片段分布圖。圖9為實(shí)施例1edta-2k采血管中血液樣品室溫靜置保存2小時(shí)內(nèi)的游離dna片段分布圖。圖10為實(shí)施例1edta-2k采血管中血液樣品室溫靜置保存4天后的游離dna片段分布圖。圖11為實(shí)施例2真空采血管1(含125μl保存劑1)中血液樣品常溫運(yùn)輸0天后的游離dna片段分布圖。圖12為實(shí)施例2真空采血管1(含125μl保存劑1)中血液樣品常溫運(yùn)輸4天后的游離dna片段分布圖。圖13為實(shí)施例2真空采血管2(含125μl保存劑2)中血液樣品常溫運(yùn)輸0天后的游離dna片段分布圖。圖14為實(shí)施例2真空采血管2(含125μl保存劑2)中血液樣品常溫運(yùn)輸4天后的游離dna片段分布圖。對(duì)圖1-14需要進(jìn)一步說(shuō)明的是，圖中35bp的峰為dnaladder產(chǎn)生的峰，其他的峰則為樣品產(chǎn)生的峰。對(duì)圖1-9需要更進(jìn)一步說(shuō)明的是，各圖主峰大小都在180bp左右，符合血漿游離dna片段大??；無(wú)明顯雜峰，說(shuō)明dna完好無(wú)降解；血漿游離dna較穩(wěn)定。對(duì)圖10需更進(jìn)一步說(shuō)明的是，無(wú)180左右的峰，血漿游離dna可能發(fā)生降解。存在200bp以上多個(gè)很高的峰，說(shuō)明存在大量基因組dna降解后的片段。血漿游離dna不穩(wěn)定且受到了基因組dna的污染。對(duì)圖11-14需要更進(jìn)一步說(shuō)明的是，各圖主峰大小都在180bp左右，符合血漿游離dna片段大?。粺o(wú)明顯雜峰，說(shuō)明dna完好無(wú)降解；血漿游離dna較穩(wěn)定。具體實(shí)施方式為了更好地說(shuō)明本發(fā)明所解決的問(wèn)題、所采用的技術(shù)方案和所達(dá)到的效果，現(xiàn)結(jié)合具體實(shí)施例和相關(guān)資料進(jìn)一步闡述。需要說(shuō)明的是，本
發(fā)明內(nèi)容包含但不限于以下實(shí)施例及其組合實(shí)施方式。實(shí)施例1室溫靜置保存實(shí)驗(yàn)本實(shí)施例提供的血液保存劑1，每100毫升保護(hù)劑1包括以下組分重量(g)：乙二胺四乙酸二鉀8.8gε-聚賴(lài)氨酸1.8g尿素8.0g葡萄糖9.6g甘露醇5.0g腺嘌呤0.3g配制方法：配制100ml血液保存劑1，按上述組分濃度計(jì)算，準(zhǔn)備材料：乙二胺四乙酸二鉀：8.8g、ε-聚賴(lài)氨酸：1.8g、尿素：8.0g、葡萄糖：9.6g、甘露醇：5.0g、腺嘌呤：0.3g。將上述混合物定容至100ml，0.05mol/l，ph7.4三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液，最終獲得血液保存劑1成品。本實(shí)施例所得的血液保存劑1用作采集血液樣本、運(yùn)輸血液樣本或存貯血液樣本時(shí)的樣本游離dna保存劑時(shí)，與血液樣本的體積比為：1:40，如處理5ml血液樣品應(yīng)加入125μl血液保存劑1。本實(shí)施例提供的血液保存劑2作為對(duì)照，每100毫升保護(hù)劑2包括以下組分重量(g)：乙二胺四乙酸二鉀8.8g2-溴-2-硝基-1,3-丙二醇3.2g尿素8.0g葡萄糖9.6g甘露醇5.0g腺嘌呤0.3g配制方法：配制100ml血液保存劑2，按上述組分濃度計(jì)算，準(zhǔn)備材料：乙二胺四乙酸二鉀：8.8g、2-溴-2-硝基-1,3-丙二醇：3.2g、尿素：8.0g、葡萄糖：9.6g、甘露醇：5.0g、腺嘌呤：0.3g。將上述混合物定容至100ml，0.05mol/l，ph7.4三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液，最終獲得血液保存劑2成品。本實(shí)施例所得的血液保存劑2用作采集血液樣本、運(yùn)輸血液樣本或存貯血液樣本時(shí)的樣本游離dna保存劑時(shí)，與血液樣本的體積比為：1:40，如處理5ml血液樣品應(yīng)加入125μl血液保存劑2。血液保存劑1可作為本發(fā)明的一種含天然防腐劑ε-聚賴(lài)氨酸，不含化學(xué)防腐劑、甲醛釋放劑的血液保存劑。血液保存劑2可作為本實(shí)施例的對(duì)照的血液保存劑，含有毒的化學(xué)防腐劑2-溴-2-硝基-1,3-丙二醇。(1)實(shí)驗(yàn)方法：采用真空采血管1(含125μl保存劑1)對(duì)6個(gè)志愿者每人抽取4管5ml血液樣品，上下顛倒混勻10次，使血液與保存劑成均一體系。再將混勻后的血液樣品分別在室溫條件下靜置保存0天(不超過(guò)6小時(shí))、4天、7天、14天，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)取每個(gè)志愿者的1管血液樣品進(jìn)行分離血漿。分離血漿方法：將血液樣品放入離心機(jī)中，4℃，1600g離心10min，小心的吸取上清到新的離心管中，如果取到白細(xì)胞或紅細(xì)胞，則重新進(jìn)行離心后吸取上清。將第一次離心后獲得的上清再次放入離心機(jī)中，4℃，16000g離心10min，小心的只吸取600μl上清到一個(gè)新的離心管中，這樣獲得的溶液就是血漿樣本。血漿游離dna的提?。簩?duì)每個(gè)志愿者分離得到的600μl血漿樣本提取血漿游離dna(提取試劑盒可選用北京貝瑞和康生物技術(shù)股份有限公司的血漿游離dna提取試劑盒(磁珠法)，或者北京金麥格生物技術(shù)有限公司的血清游離dna提取試劑盒等)，將所提取的血漿游離dna溶解在40μltris-hcl緩沖液(ph8.0)中，得血漿游離dna樣本。取3μl上述提取的的血漿游離dna樣本作為模板進(jìn)行q-pcr測(cè)試，利用β-actin基因的ct值來(lái)檢測(cè)血液樣品中游離dna量的變化。所述q-pcr反應(yīng)體系為：所述q-pcr反應(yīng)條件：所述引物序列為：primer-f：ctgggaaggttacaggaaga；primer-r：aattggctcaaacaacgtgaat。將靜置保存天數(shù)相同的6個(gè)志愿者血樣提取的血漿游離dna樣本等體積混勻，取1μl混勻的血漿游離dna樣本用安捷倫2100dna高靈敏度芯片來(lái)檢測(cè)血液樣品中游離dna的片段大小。對(duì)以上6個(gè)志愿者分別再各抽取4管5ml血液樣品置于真空采血管2(含125μl保存劑2)中，樣品處理方式同真空采血管1(含125μl保存劑1)，以真空采血管2(含125μl保存劑2)樣品室溫靜置保存0天(不超過(guò)6小時(shí))、4天、7天、14天的測(cè)試結(jié)果作為對(duì)照。對(duì)以上6個(gè)志愿者分別各再抽取2管5ml血液樣品置于edta-2k采血管(該管里的試劑只含抗凝劑乙二胺四乙酸二鉀，無(wú)其他組分)，樣品處理方式同真空采血管1(含125μl保存劑1)，以edta-2k采血管樣品室溫靜置保存0天(不超過(guò)6小時(shí))、4天的測(cè)試結(jié)果作為空白對(duì)照。(2)實(shí)驗(yàn)結(jié)果：對(duì)室溫靜置保存0天、4天、7天、14天的真空采血管1(含125μl保存劑1)血液樣品的游離dna，使用q-pcr檢測(cè)的ct值，如表3所示。對(duì)室溫靜置保存0天、4天、7天、14天的真空采血管2(含125μl保存劑2)血液樣品的游離dna，使用q-pcr檢測(cè)的ct值，如表4所示。對(duì)室溫靜置保存0天、4天的edta-2k采血管血液樣品的游離dna，使用q-pcr檢測(cè)的ct值，如表5所示。室溫靜置保存0天、4天、7天、14天后，真空采血管1(含125μl保存劑1)和真空采血管2(含125μl保存劑2)血液樣品保存的差異性比較：使用q-pcr檢測(cè)真空采血管1(含125μl保存劑1)和真空采血管2(含125μl保存劑2)血液樣品游離dna的ct值都比較接近，約為30；說(shuō)明血漿游離dna的量穩(wěn)定，沒(méi)有來(lái)自白細(xì)胞釋放大量基因組dna的污染。結(jié)果參見(jiàn)表3和表4。室溫靜置保存0天、4天的edta-2k采血管血液樣品的游離dn和真空采血管1(含125μl保存劑1)樣品保存的差異性比較：使用q-pcr檢測(cè)真空采血管1(含125μl保存劑1)室溫靜置保存0天、4天的血液樣品游離dna的ct值都比較接近，約為30；但是edta-2k采血管室溫靜置保存4天的血液樣品游離dna的ct值(約為26)比保存0天的(約為30)明顯減小(ct值相差4，dna的量相差24倍，即16倍)，說(shuō)明采用edta-2k采血管室溫靜置保存4天的血液樣品存在來(lái)自白細(xì)胞釋放大量基因組dna的污染。各采血管樣品的dna片段大小請(qǐng)參看圖1至圖10(安捷倫2100生物分析儀對(duì)dna大小和濃度的分析)。對(duì)比圖1至圖8可以看出，在14天內(nèi)，真空采血管1(含125μl保存劑1)和真空采血管2(含125μl保存劑2)的血漿游離dna檢測(cè)結(jié)果：主峰大小分布一致，都在180bp左右，符合血漿游離dna片段大小，血漿游離dna完整無(wú)降解；200bp以上無(wú)明顯雜峰，說(shuō)明不存在基因組dna降解后的片段，不存在基因組dna的污染。圖9與圖1至圖8相似，血漿游離dna穩(wěn)定無(wú)污染。圖10無(wú)180左右的峰，而血漿游離dna的峰約為180bp，血漿游離dna可能發(fā)生降解；存在200bp以上多個(gè)很高的峰，說(shuō)明存在大量基因組dna降解后的片段。采用edta-2k采血管室1溫靜置保存4天的血漿游離dna不穩(wěn)定且受到了基因組dna的污染。綜上所述：在14天室溫靜置保存時(shí)間內(nèi)，血漿游離dna在含保存劑1的真空采血管1中保存效果較好，與在含保存劑2的真空采血管2中的保存效果一致。而普通的edta-2k采血管不能用于長(zhǎng)時(shí)間保存血漿游離dna。常溫保存血樣時(shí)采用含天然防腐劑的血液保存劑1與含有毒化學(xué)防腐劑的血液保存劑2對(duì)血漿游離dna的保護(hù)效果一致，但本發(fā)明的血液保存劑1更安全，對(duì)檢測(cè)過(guò)程中的接觸該保存劑的操作人員和環(huán)境更危害更小。表3表4表5實(shí)施例2常溫運(yùn)輸實(shí)驗(yàn)：本實(shí)施例提供的血液保存劑1和血液保存劑2的組分及其比例同實(shí)施例1。(1)實(shí)驗(yàn)方法：采用真空采血管(1含125μl保存劑1)對(duì)6個(gè)志愿者每人抽取2管5ml血液樣品，上下顛倒混勻10次，使血液與保存劑成均一體系。每個(gè)志愿者的血液樣品分別在采樣0天(6小時(shí)內(nèi))和常溫運(yùn)輸4天(96小時(shí))后，各取1管進(jìn)行分離血漿，每管只取600μl血漿作為血漿樣本，分離血漿的方法可同實(shí)施例1。血漿游離dna的提?。簩?duì)每個(gè)志愿者的600μl血漿樣本提取血漿游離dna(提取試劑盒可選用北京貝瑞和康生物技術(shù)股份有限公司的血漿游離dna提取試劑盒(磁珠法)或者北京金麥格生物技術(shù)有限公司的血清游離dna提取試劑盒等)，將所提取的dna溶解在40μltris-hcl緩沖液(ph8.0)中，得血漿游離dna樣本。取3μl血漿游離dna樣本作為模板進(jìn)行q-pcr測(cè)試，利用β-actin基因的ct值來(lái)檢測(cè)血液樣品中游離dna量的變化，q-pcr反應(yīng)體系、反應(yīng)條件和引物序列可同實(shí)施例1。將運(yùn)輸天數(shù)相同的6個(gè)志愿者血樣提取的血漿游離dna樣本等體積混勻，取1μl混勻的血漿游離dna樣本用安捷倫2100dna高靈敏度芯片來(lái)檢測(cè)血液樣品中游離dna的片段大小。對(duì)以上6個(gè)志愿者分別再抽取2管5ml血液樣品置于真空采血管2(含125μl保存劑2)中，樣品處理方式同真空采血管1(含125μl保存劑1)，以真空采血管2(含125μl保存劑2)常溫運(yùn)輸0天(不超過(guò)6小時(shí))的樣品和常溫運(yùn)輸4天(96小時(shí))的樣品測(cè)試結(jié)果作為對(duì)照。(2)實(shí)驗(yàn)結(jié)果：對(duì)0天和常溫運(yùn)輸4天的真空采血管1(含125μl保存劑1)血液樣品的游離dna，使用q-pcr檢測(cè)的ct值，如表6所示。對(duì)0天和常溫運(yùn)輸4天的真空采血管2(含125μl保存劑2)血液樣品的游離dna，使用q-pcr檢測(cè)的ct值，如表7所示。常溫運(yùn)輸4天后，真空采血管1(含125μl保存劑1)和真空采血管2(含125μl保存劑2)血液樣品保存的差異性比較：使用q-pcr檢測(cè)真空采血管1(含125μl保存劑1)和真空采血管2(含125μl保存劑2)血液樣品游離dna的ct值都比較接近，約為30，說(shuō)明血漿游離dna的量穩(wěn)定，沒(méi)有來(lái)自白細(xì)胞釋放大量基因組dna的污染。各采血管樣品的dna片段大小請(qǐng)參看圖11至圖14(安捷倫2100生物分析儀對(duì)dna大小和濃度的分析)。從圖中可以看出，在常溫運(yùn)輸4天后，真空采血管1(含125μl保存劑1)和真空采血管2(含125μl保存劑2)的血漿游離dna檢測(cè)結(jié)果：主峰大小分布一致，都在180bp左右，符合血漿游離dna片段大小，血漿游離dna完整無(wú)降解；200bp以上無(wú)明顯雜峰，說(shuō)明不存在基因組dna降解后的片段，不存在基因組dna的污染。綜上所述：在4天常溫運(yùn)輸時(shí)間內(nèi)，血漿游離dna在含保存劑1的真空采血管中保存效果較好，與在含保存劑2的真空采血管中的保存效果一致。即常溫運(yùn)輸血樣時(shí)采用含天然防腐劑的血液保存劑1與含有毒化學(xué)防腐劑的血液保存劑2對(duì)血漿游離dna的保護(hù)效果一致，但本發(fā)明的血液保存劑1更安全，對(duì)檢測(cè)過(guò)程中的接觸該保存劑的操作人員和環(huán)境更危害更小。表6表7經(jīng)過(guò)時(shí)間證明，本發(fā)明具體實(shí)施方式所涉及的配方、配比，操作方法、試驗(yàn)方法等均適用于茶多酚(＞95％)和納他霉素，且均能基本達(dá)到ε-聚賴(lài)氨酸的有益效果，此處不再贅述。以上所述實(shí)施例僅表達(dá)了本發(fā)明的幾種實(shí)施方式，其描述較為具體和詳細(xì)，但并不能因此而理解為對(duì)本發(fā)明專(zhuān)利范圍的限制。應(yīng)當(dāng)指出的是，對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進(jìn)，這些都屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。因此，本發(fā)明專(zhuān)利的保護(hù)范圍應(yīng)以所附權(quán)利要求為準(zhǔn)。當(dāng)前第1頁(yè)12