本發(fā)明屬于合成生物學領(lǐng)域，涉及一種生產(chǎn)倍半萜化合物—longiborneol的萜類合酶及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

萜類化合物是含有異戊二烯單元的化合物的總稱。它在自然界廣泛存在，迄今為止，人們已從動物、植物以及微生物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)大約76000種萜類化合物。該化合物具有許多生理活性，所以被廣泛應(yīng)用于香水生產(chǎn)行業(yè)、保健品行業(yè)、農(nóng)業(yè)生產(chǎn)領(lǐng)域以及醫(yī)療行業(yè)。

萜類化合物的生產(chǎn)方法有天然提取、化學合成法和發(fā)酵法。但由于天然提取法生產(chǎn)成本居高不下，化學合成法可能的毒害作用和國際上對天然產(chǎn)物的日益推崇，人們開始大量研究利用微生物發(fā)酵法生產(chǎn)萜類化合物。

生物體利用2-甲基-赤蘚糖醇磷酸(mep途徑)或者甲羥戊酸途徑(mva途徑)的異戊烯焦磷酸異構(gòu)酶idi合成ipp以及dmapp，隨后ipp以及dmapp在異戊烯轉(zhuǎn)移酶催化下合成gpp、fpp，ggpp以及gfpp等不同鏈長的異戊二烯單元。隨后萜類合酶(terpenesynthase，ts)可以這些不同鏈長的異戊二烯單元為底物，合成單萜(c10)、倍半萜(c15)、二萜(c120)、二倍半萜(c25)、三萜(c30)、四萜(c40)以及多萜。

這其中，單萜和倍半萜為香水及香料化合物的主要來源，對有關(guān)這些化合物生物合成基因的挖掘及在萜類化合物微生物合成高產(chǎn)平臺中進行代謝工程改造，將使得我們能夠高效經(jīng)濟地實現(xiàn)這些高附加值產(chǎn)物的合成。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

為了克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點與不足，本發(fā)明提供一種新型的萜類合酶fgj01056及含有該萜類合酶基因的生產(chǎn)longiborneol的菌株，以實現(xiàn)倍半萜化合物longiborneol的微生物合成，提高產(chǎn)量、降低成本，為香料的制備提供更多的來源，減少毒害作用。

本發(fā)明的第一方面，提供一種萜類合酶fgj01056，其具有seqidno：1所示的氨基酸序列。

進一步地，本發(fā)明提供一種核酸分子，其編碼上述萜類合酶fgj01056，核苷酸序列如seqidno：2所示。

本發(fā)明的第二方面，提供萜類合酶fgj01056的用途，用于生產(chǎn)longiborneol。

本發(fā)明的第三方面，提供一種生產(chǎn)longiborneol的菌株，該菌株含有甲羥戊酸途徑(mva途徑)和longiborneol合成的相關(guān)基因；所述的甲羥戊酸途徑的相關(guān)基因包括(1)將乙酰輔酶a縮合為乙酰乙酰輔酶a的基因atob、(2)將乙酰輔酶a和乙酰乙酰輔酶a縮合為hmg-coa的基因erg13、(3)將hmg-coa還原為甲羥戊酸的基因thmg1、(4)將甲羥戊酸磷酸化為甲羥戊酸-5-磷酸的基因erg12、(5)將甲羥戊酸-5-磷酸磷酸化為甲羥戊酸-5-焦磷酸的基因erg8、(6)將甲羥戊酸-5-焦磷酸脫羧生成異戊烯焦磷酸的基因mvd1和(7)將異戊烯焦磷酸異構(gòu)為二甲基烯丙基焦磷酸的基因idi；所述的longiborneol合成的相關(guān)基因包括ispa和萜類合酶fgj01056基因，所述的fgj01056基因，其序列如seqidno：2所示。合成的目標萜類化合物longiborneol具有下列式(i)的結(jié)構(gòu)：

所述的甲羥戊酸途徑的相關(guān)基因優(yōu)選為來源于大腸桿菌xl1-blue的atob基因(am946981.2)、idi(cp010152.1)和來源于釀酒酵母invsc1的erg13基因(cp005477.2)、thmg1(cp005464.2)、erg12(cp008027.1)、erg8(cp005426.1)、mvd1(cp005554.2)。

所述的萜類合酶fgj01056基因來源于真菌禾谷鐮刀菌j1-012(fusariumgraminearumj1-012)的fgj01056，其核苷酸序列如seqidno：2所示，其氨基酸序列為seqidno：1。

優(yōu)選的，所述的生產(chǎn)longiborneol的菌株為含有質(zhì)粒pmh1、質(zhì)粒pfz81和質(zhì)粒pgb235的大腸桿菌；所述的質(zhì)粒pmh1以pbbr1mcs為骨架載體、啟動子為lac啟動子，復制子替換為p15a復制子，包含atob、erg13和thmg1基因，pmh1的序列(不含骨架載體序列)如seqidno.3所示；所述的質(zhì)粒pfz81以pbbr1mcs-2為骨架載體、啟動子為lac啟動子、復制子為質(zhì)粒自帶的pbbr1mcs復制子，包含erg12、erg8、mvd1和idi基因，pfz81的序列(不含骨架載體序列)如seqidno.4所示；所述的質(zhì)粒pgb233以pet21為骨架載體、啟動子為t7啟動子、復制子為質(zhì)粒自帶的高拷貝的pbr322復制子，包含fgj01056、ispa、idi基因，pgb233的序列(不含骨架載體序列)如seqidno.5所示。

優(yōu)選的，所述的生產(chǎn)longiborneol的菌株原核表達時過表達來源于大腸桿菌xl1-blue的atob基因或idi基因，合成大量催化底物法尼基焦磷酸fpp。

本發(fā)明的第四方面是提供上述生產(chǎn)longiborneol的菌株在生產(chǎn)longiborneol中的應(yīng)用。

本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術(shù)具有如下優(yōu)點和效果：本發(fā)明首次利用萜類合酶fgj01056基因結(jié)合外源的甲羥戊酸途徑獲得了穩(wěn)定生產(chǎn)longiborneol的大腸桿菌。本發(fā)明的萜類合酶具有專一性和高效性，可以提高longiborneol的產(chǎn)量，極大地克服了原料投入量大而longiborneol產(chǎn)率低的弊端，降低了研究成本，并且保證綠色環(huán)保；此外，由于longiborneol合酶抑制劑可以阻斷culmorin在真菌毒素中重要的協(xié)同增效毒力作用，通過對longiborneol的進一步研究我們可以進一步發(fā)掘出如何準確快速阻斷culmorin的毒力作用。

附圖說明

圖1為gc-ms檢測fgj01056以fpp為底物的體外反應(yīng)和fgj01056發(fā)酵(pgb233)，e.colil1體外反應(yīng)色譜圖；

圖2為質(zhì)粒pmh1結(jié)構(gòu)示意圖；

圖3為質(zhì)粒pfz81結(jié)構(gòu)示意圖；

圖4為質(zhì)粒pgb148結(jié)構(gòu)示意圖；

圖5為質(zhì)粒pgb232結(jié)構(gòu)示意圖；

圖6為質(zhì)粒pgb233結(jié)構(gòu)示意圖；

圖7為菌株發(fā)酵產(chǎn)物的ms圖；

圖8為化合物(i)的譜圖，

其中a為化合物(i)的結(jié)構(gòu)示意圖；b為碳譜圖(¹³cnmr，cdcl3，101mhz)；c為氫譜圖(¹hnmr，cdcl3，400mhz)。

具體實施方式

通過以下詳細說明結(jié)合附圖可以進一步理解本發(fā)明的特點和優(yōu)點。所提供的實施例僅是對本發(fā)明方法的說明，而不以任何方式限制本發(fā)明揭示的其余內(nèi)容。

實施例中未注明具體技術(shù)或條件的，按照本領(lǐng)域內(nèi)的文獻所描述的技術(shù)或條件或者按照產(chǎn)品說明書進行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市購獲得的常規(guī)產(chǎn)品。

【實施例1】體外驗證萜類合酶的功能

1、質(zhì)粒pgb148的構(gòu)建

以反轉(zhuǎn)錄的fusariumgraminearumj1-012的cdna為模板，用引物p27/p29(見表1)擴增獲得fgj01056的編碼區(qū)并連接到質(zhì)粒pet28a上獲得質(zhì)粒pgb148(圖4)，用于純化蛋白。

2、蛋白的純化

將含有目的基因(seqidno：2所示的核苷酸序列)的表達載體pgb148轉(zhuǎn)化表達宿主e.colibl21(de3)，轉(zhuǎn)化后挑取單克隆至含相應(yīng)抗生素的lb培養(yǎng)基中，37℃，220rpm過夜培養(yǎng)。按1％接種量轉(zhuǎn)接至1l含相應(yīng)抗生素的新鮮的lb培養(yǎng)基中，37℃，220rpm培養(yǎng)至od600約為0.6-0.8，降溫至16℃，加入終濃度為0.1mm的iptg，16℃，220rpm培養(yǎng)16-18h。8000rpm離心5min收集細胞，之后用30-40ml蛋白純化緩沖液a(buffera：50mmtris-hcl，300mmnacl，4mmβ-巰基乙醇，ph7.6)徹底重懸細胞，超聲破碎(脈沖5s，停頓8s，超聲破碎5min)。4℃，12,000g離心30min以上，收集上清，4℃，20,000rpm離心1h，收集上清，用0.45μm濾膜進行過濾，加入6％bufferb(bufferb：500mm咪唑加入到buffera中)使咪唑約為30mm，混勻備用。

使用bio-rad的biologicduoflowchromatographysystem純化組氨酸標簽蛋白。蛋白分離柱加載至fplc上加以控制，fplc的流速始終為1.5ml/min，而樣品自動上樣的流速為2ml/min。所得到的上清樣品用5mlhitraphpni-nta柱子經(jīng)biorad做第一步純化，該鎳離子螯合柱先經(jīng)過30ml(6個柱體積)緩沖液a(buffera：50mmtris-hcl，300mmnacl，4mmβ-巰基乙醇，ph7.6)的平衡，然后通過自動進樣器將準備好的30ml上清液加載到柱子上，再用20ml的緩沖液a(4個柱體積)對柱子進行清洗，這時啟動緩沖液b(50mmtris-hcl，150mmnacl，250mmimidazoleph7.6)的線性梯度，在100ml(20個柱體積)的流量內(nèi)，緩沖液b由0％增長為100％，再用20ml(4個柱體積)100％的緩沖液b清洗柱子。根據(jù)紫外吸收收集并通過sds-page檢測帶有組氨酸標簽的目的蛋白。挑選比較純的組分收集起來，通過millipore公司的離心濃縮管amiconcentricon-10(分子量在10,000以下的會被濾出)來離心濃縮至2.5ml，然后通過pharmacia公司的pd-10柱子脫鹽并交換到緩沖液c(含有10％甘油的50mm磷酸緩沖液，ph7.6)中，分裝后液氮速凍并保存于-80℃冰箱。

3、體外催化反應(yīng)

我們設(shè)立了以下體外酶促反應(yīng)體系：向200μl終濃度為50mm含有10％甘油的pbbuffer(ph7.6)緩沖液中添加10μm純化的蛋白，100μm的底物gpp、fpp或ggpp，以及2mm的mg²⁺，30℃過夜反應(yīng)。隨后用等體積的正己烷萃取2次，合并有機相并用gc-ms檢測生成的產(chǎn)物。

萜類化合物檢測所用的gc-ms為thermotracegcultra氣相色譜配備tsqquantumxlsms，氣相色譜柱為tracetr-5ms(30m×0.25mm×0.25um)。每次分析進樣1μl，以高純的氦氣為載氣，設(shè)置流速為1ml/min。gc條件為80℃維持1min，隨后以10℃/min的速率升溫到220℃，再在220℃維持15min。進樣器和傳輸線溫度分別設(shè)定為230℃和240℃。

結(jié)果顯示，fgj01056表達的萜類合酶能夠以fpp為底物，合成倍半萜產(chǎn)物(圖1)。

【實施例2】構(gòu)建表達載體

用qiagen公司的bloodandcellculturednaminikit純化獲得大腸桿菌xl1-blue基因組dna和釀酒酵母invsc1基因組dna。

質(zhì)粒pmh1含有甲羥戊酸途徑前三個基因：來源于大腸桿菌xl1-blue的atob基因(乙酰乙酰輔酶a硫酯酶，am946981.2)，來源于釀酒酵母invsc1的erg13(hmg-coasynthase，cp005477.2)和thmg1(hmg-coa還原酶，刪除了hmg1的跨膜區(qū)域，cp005464.2)。

質(zhì)粒pfz81含有甲羥戊酸途徑后四個基因：來源于釀酒酵母invsc1的erg12(甲羥戊酸激酶，cp008027.1)，erg8(甲羥戊酸-5-磷酸激酶，cp005426.1)和mvd1(甲羥戊酸-5-焦磷酸激酶，cp005554.2)，來源于大腸桿菌xl1-blue的idi(異戊烯焦磷酸異構(gòu)酶，cp010152.1)基因。

質(zhì)粒pgb233含有合成倍半萜化合物的三個基因，分別是來源于真菌禾谷鐮刀菌j1-012(fusariumgraminearumj1-012)的fgj01056(seqidno：2)，其氨基酸序列為seqidno：1；來源于大腸桿菌xl1-blue的idi；來源于大腸桿菌xl1-blue的ispa，能夠以甲羥戊酸產(chǎn)物異戊二烯焦磷酸(ipp)和二甲烯丙基焦磷酸(dmapp)為底物合成法尼基焦磷酸，用于倍半萜的合成。

所有基因均通過pcr擴增獲得，所用引物見表1。

表1引物序列表

具體構(gòu)建方法如下：

①質(zhì)粒pmh1的構(gòu)建

首先將pbbr1mcs質(zhì)粒的復制子替換為來源于pmsd15質(zhì)粒的p15a復制子。以質(zhì)粒pbbr1mcs為模板用引物p1/p2進行擴增，同時p15a復制子用引物p3/p4擴增(引物序列見表1)，經(jīng)pcr產(chǎn)物純化后用nanodrop測定dna濃度，然后將20ngpcr擴增的p15a片段和等摩爾的pbbr1mcs片段混合，經(jīng)過一輪pcr擴增，擴增條件為：98℃，2min預變性，然后30個pcr循環(huán)98℃,20s；60℃，20s；72℃，6min，最后72℃充分延伸10min。隨后轉(zhuǎn)化大腸桿菌xl1-blue獲得質(zhì)粒pbbr1mcs/p15a。

用引物p5/p6以pbbr1mcs/p15a為模板擴增pmh1質(zhì)粒骨架，同時用p7/p8、p9/p10、p11/p12為引物擴增相應(yīng)基因。經(jīng)pcr產(chǎn)物純化之后，取50ngpbbr1mcs/p15a擴增產(chǎn)物和等摩爾的各基因擴增產(chǎn)物混合，并用去離子水調(diào)整體積到5μl，隨后加入至15μl的gibson緩沖液中混勻，50℃反應(yīng)1h后轉(zhuǎn)化大腸桿菌xl1-blue，挑取克隆，并將陽性克隆測序獲得質(zhì)粒pmh1(圖2)。

②質(zhì)粒pfz81的構(gòu)建

用引物p13/p14以pbbr1mcs-2為模板擴增pfz81質(zhì)粒骨架，同時用p15/p16、p17/p18、p19/p20、p21/p22為引物擴增相應(yīng)基因。經(jīng)pcr產(chǎn)物純化之后，取50ngpbbr1mcs-2擴增產(chǎn)物和等摩爾的各基因擴增產(chǎn)物混合，并用去離子水調(diào)整體積到5μl，隨后加入至15μl的gibson緩沖液中混勻，50℃反應(yīng)1h后轉(zhuǎn)化大腸桿菌xl1-blue，挑取克隆，并將陽性克隆測序獲得質(zhì)粒pfz81(圖3)。

③質(zhì)粒pgb232的構(gòu)建

以反轉(zhuǎn)錄的fusariumgraminearumj1-012的cdna為模板，用引物p27/p28擴增獲得fgj01056的編碼區(qū)并連接到質(zhì)粒pet21a上獲得質(zhì)粒pgb232(圖5)。

④質(zhì)粒pgb233的構(gòu)建

用引物p23/p24以及p25/p26分別從e.colibl21(de3)基因組上擴增ispa以及idi基因，隨后將ispa克隆至pet21a獲得質(zhì)粒pgb305；將idi克隆至pet21a(+)獲得質(zhì)粒pgb306。分別用xbai/xhoi，spei/xhoi酶切質(zhì)粒pgb305和pgb306，隨后借助同尾酶將pgb306上酶切下來的idi片段連接至質(zhì)粒pgb305從而獲得質(zhì)粒pgb308。隨后用xbai/xhoi從pgb308上酶切下來ispa-idi片段并借助同尾酶分別將其連接至質(zhì)粒pgb232，獲得質(zhì)粒pgb233(圖6)。

【實施例3】大腸桿菌體內(nèi)合成fgj01056來源的倍半萜化合物

為了生產(chǎn)倍半萜化合物，將甲羥戊酸途徑的兩個質(zhì)粒pmh1和pfz81同時轉(zhuǎn)入大腸桿菌bl21(de3)中獲得bl21(de3)/pmh1/pfz81，命名為ps，隨后將pgb233轉(zhuǎn)化進入菌株ps中，獲得菌株l1，隨后分別挑取單克隆至10ml的lb培養(yǎng)基中(同時含有100μg/ml氨芐青霉素，50μg/ml卡那霉素和34μg/ml氯霉素)，37℃，220rpm過夜培養(yǎng)，隨后按1％接種量接種到新鮮的同一培養(yǎng)基中37℃，220rpm繼續(xù)培養(yǎng)至od600約為0.6～0.8時，降溫至16℃并加入終濃度為0.1mm的iptg進行誘導表達，誘導表達18h后升溫至28℃發(fā)酵72h，隨后對其進行發(fā)酵及產(chǎn)物萃取，收集菌體及發(fā)酵液用等體積的正己烷萃取2次，減壓蒸餾后甲醇復溶(加入甲醇前先加入少量dmso助溶)，用于產(chǎn)物純化。

結(jié)果顯示，含有fgj01056的突變株e.colil1能夠以fpp為底物合成保留時間為11.95min的具有苔蘚氣味的化合物longiborneol(圖1、7)。

【實施例4】化合物鑒定

¹hnmr和¹³cnmr結(jié)果顯示(圖8)gc-ms保留時間為11.95min的化合物為白色至淺黃色結(jié)晶的longiborneol。¹hnmr(400mhz,cdcl3)δ3.74(td,j＝4.9,1.9hz,1h),1.89–1.81(m,1h),1.83(d,j＝4.3hz,1h),1.75–1.66(m,1h),1.47–1.38(m,2h),1.37–1.24(m,4h),1.23–1.16(m,1h),1.16–1.10(m,1h),0.95(d,j＝4.9hz,1h),0.92(d,j＝1.4hz,6h),0.85(s,3h),0.82(s,3h)。¹³cnmr(101mhz,cdcl3)δ79.70,64.52,51.26,50.17,44.00,40.99,35.10,33.37,30.29,29.26,28.85,26.33,22.65,22.46,12.99。倍半萜醇longiborneol的理論分子量為223.2056，高分辨質(zhì)譜檢測結(jié)果顯示其實際分子量為223.2047。

sequencelisting

<110>武漢大學

<120>一種生產(chǎn)longiborneol的萜類合酶及其應(yīng)用

<160>34

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>339

<212>prt

<213>禾谷鐮刀菌j1-012

<400>1

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151015

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65707580

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859095

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165170175

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325330335

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<213>禾谷鐮刀菌j1-012j1-012

<400>2

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ctcagggcttttgccgaccaactcaaactcacctataagctgtaccacccccttgttgcg480

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ggtattaaagaaaagggtgatcatccatcaaagggaggcaactacttcgcctggtacatc600

cgggaacgggatggcgtcggtgaagcctattcctggttcactttccccaaacgacaattc660

cccgacctggacattcctatcgaagctattgaagatatgacacgattcattgcctatctc720

aatgatgttttatcgttttacaaagagtccctggctggcgagacacacaactacatcaac780

catacggctgcgtatgagggtgttgattcggatgctgcgcttcataaaactgctcaagac840

accatagactgtgcccgccgcattgagagtgttctcgcaggaaagggcgagtatgagaaa900

gcgtggcgacttcatgcatccggatacctccaaatgcacgtccagagaggtcgttacagg960

cttatagaggtgggcgttggtgatgcgccagatgtgcatgaagtcatcaagaagatt1017

<210>3

<211>4515

<212>dna

<213>人工序列

<400>3

gcgcgtaatacgactcactatagggcgaattggagctccaccgcggtggcggccgctcta60

gaactagtggatccttaggatttaatgcaggtgacggacccatctttcaaacgatttata120

tcagtggcgtccaaattgttaggttttgttggttcagcaggtttcctgttgtgggtcata180

tgactttgaaccaaatggccggctgctagggcagcacataaggataattcacctgccaag240

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ccgatggtacctacttcgatggatggcatggatacggaaattctcaaatcaccgtccact420

tctttcatcaatgttatacagttggaactttcaacattttgtgcaggatcttgtcctaat480

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