本發(fā)明屬于阿卡斑病毒檢測(cè)領(lǐng)域，尤其涉及用于檢測(cè)新型竹鼠源阿卡斑病毒的rt-pcr引物及其試劑盒。

背景技術(shù)：

阿卡斑病又名赤羽病，主要引起牛、羊等流產(chǎn)、早產(chǎn)、死胎、新生胎兒關(guān)節(jié)彎曲及積水性無(wú)腦癥等。阿卡病給畜牧業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(oie)將其列為法定報(bào)告動(dòng)物疫病，我國(guó)《進(jìn)境動(dòng)物一、二類傳染病、寄生蟲病名錄》將其列為二類動(dòng)物疫病。

新型竹鼠源阿卡斑病是國(guó)內(nèi)外首次報(bào)道的在自然環(huán)境下引起大規(guī)模的成年竹鼠死亡的病例。迄今，國(guó)內(nèi)外沒有任何關(guān)于該病毒的基因參考序列。2013年11-12月廣西柳州三江、2014年4-5月廣西桂林及2016年6-8月廣西柳城3個(gè)不同地區(qū)縣市先后分別在人工養(yǎng)殖的竹鼠群中暴發(fā)一種怪病。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，有11個(gè)竹鼠養(yǎng)殖場(chǎng)(三江3個(gè)場(chǎng)，桂林5個(gè)場(chǎng)，柳城3個(gè)場(chǎng))共計(jì)3萬(wàn)多只竹鼠受影響。該病臨床特征是在單側(cè)或雙側(cè)后腿麻痹、拖行，顫抖、轉(zhuǎn)圈、幼年竹鼠出現(xiàn)神經(jīng)癥狀，抽搐、四肢僵直，口鼻、耳朵、眼眶、前后肢等少毛或無(wú)毛的部位皮膚出現(xiàn)紅疹，部分足掌龜裂。發(fā)病竹鼠，食欲下降或不食，出現(xiàn)癥狀后1-3天內(nèi)發(fā)生死亡。因其都表現(xiàn)出后腿拖行現(xiàn)象，且為烈性發(fā)病，在廣西俗稱為“拖垃圾病”。剖檢可見大腦充血、出血，肺有出血點(diǎn)、出血斑，肝質(zhì)脆、色淺，脾腫大、部分梗死，腎有出血點(diǎn)。幼年和成年竹鼠均發(fā)病，發(fā)病率20-30％，但死亡率幾乎100％。流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，竹鼠養(yǎng)殖場(chǎng)之間存在相互引種外，大多數(shù)發(fā)病場(chǎng)之間無(wú)明顯其他聯(lián)系。細(xì)菌分離結(jié)果顯示除大腸桿菌外，未見其他有意義的致病菌。rt-pcr或pcr檢測(cè)痘病毒、皰疹病毒、腺病毒、淋巴細(xì)胞脈絡(luò)叢腦膜炎病毒、狂犬病病毒、仙臺(tái)病毒常見大鼠病毒均為陰性。經(jīng)申請(qǐng)人課題組診斷排除了其他細(xì)菌和病毒病，通過病毒宏基因組學(xué)、rt-pcr擴(kuò)增和細(xì)胞分離培養(yǎng)證實(shí)該病為阿卡斑病毒感染。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)該毒株對(duì)竹鼠屬于強(qiáng)毒力。

隨著我國(guó)特種動(dòng)物養(yǎng)殖業(yè)的迅速發(fā)展，竹鼠養(yǎng)殖業(yè)得以不斷壯大，而目前國(guó)內(nèi)外在新型竹鼠源阿卡斑病毒性疾病領(lǐng)域的研究和報(bào)道還處于空白狀態(tài)，沒有任何參考文獻(xiàn)和序列報(bào)道，臨床上針對(duì)新型竹鼠源阿卡斑病毒病的防治也處于空白狀態(tài)。因此，急需一種快速檢測(cè)新型竹鼠源阿卡斑病毒病的方法，來(lái)對(duì)發(fā)病竹鼠進(jìn)行及時(shí)診治。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種特異、敏感、快速、簡(jiǎn)便的用于檢測(cè)新型竹鼠源阿卡斑病毒的rt-pcr引物及其試劑盒。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

用于檢測(cè)新型竹鼠源阿卡斑病毒的rt-pcr引物，包括引物akvm1和引物akvm2，它們分別具有以下堿基序列：

引物akvm15′-atgattattacaattctcaacat-3′，

引物akvm25′-gctaaaaggatgaattggt-3′。

用于檢測(cè)新型竹鼠源阿卡斑病毒的rt-pcr試劑盒，該試劑盒含有引物akvm1和引物akvm2，它們分別具有以下堿基序列：

引物akvm15′-atgattattacaattctcaacat-3′，

引物akvm25′-gctaaaaggatgaattggt-3′。

引物akvm1和引物akvm2的摩爾比為1∶1。

引物akvm1和引物akvm2的濃度均為10μm。

該試劑盒還含有以下試劑：rna提取試劑、pcr擴(kuò)增試劑、新型竹鼠源阿卡斑病毒陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照。

rna提取試劑為axygen體液病毒dna/rna小量試劑盒，pcr擴(kuò)增試劑為一步法rt-pcr試劑盒。

新型竹鼠源阿卡斑病毒陽(yáng)性對(duì)照為新型竹鼠源阿卡斑病毒糖蛋白m基因片段cdna的質(zhì)粒，陰性對(duì)照為新型竹鼠源阿卡斑病毒陰性的昆明小鼠血清。

針對(duì)新型竹鼠源阿卡斑病毒檢測(cè)和診斷的缺乏有效可靠技術(shù)的問題，發(fā)明人設(shè)計(jì)并制備了用于檢測(cè)新型竹鼠源阿卡斑病毒的pcr引物，包括引物akvm1和引物akvm2，它們分別具有序列表中seq.id.no.1和seq.id.no.2的堿基序列。據(jù)此，發(fā)明人還制備了相應(yīng)的rt-pcr試劑盒并建立相應(yīng)的pcr檢測(cè)方法，該試劑盒含有引物akvm1和引物akvm2、rna提取試劑、pcr擴(kuò)增試劑、新型竹鼠源阿卡斑病毒陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照。實(shí)驗(yàn)表明，本發(fā)明具有特異、敏感、快速、簡(jiǎn)便的特點(diǎn)，彌補(bǔ)了目前臨床上檢測(cè)該病毒的技術(shù)空缺，可作為養(yǎng)殖場(chǎng)、基層實(shí)驗(yàn)室等場(chǎng)所開展快速檢測(cè)的良好方法。

附圖說(shuō)明

圖1是本發(fā)明pcr檢測(cè)方法退火溫度檢測(cè)結(jié)果圖，圖中：1.ddh20；2.53℃；3.57℃；4.60℃；m：dl2000dna分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

圖2是本發(fā)明pcr檢測(cè)方法特異性試驗(yàn)結(jié)果圖，圖中：1.新型竹鼠源阿卡斑病毒；2.ddh2o；3.竹鼠內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒；4.新型竹鼠源阿卡斑病毒；5.竹鼠細(xì)小病毒；6.竹鼠乳酸脫氫酶升高病毒；m：dl2000dna分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

圖3是本發(fā)明pcr檢測(cè)方法敏感性試驗(yàn)結(jié)果圖，圖中：1.cdna濃度為23ng/μl；2-5.10^-1～10^-4倍比稀釋模板；m：dl2000dna分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

圖4是本發(fā)明pcr檢測(cè)方法的臨床檢測(cè)結(jié)果圖，圖中：1.正常竹鼠腦組織對(duì)照；2.ddh2o；3-8.分別為發(fā)病竹鼠的腦、心、肝、脾、肺、腎；m：dl2000dna分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1引物設(shè)計(jì)

根據(jù)前期病毒宏基因組學(xué)測(cè)序結(jié)果得到的新型竹鼠源阿卡斑病毒全基因序列(該病毒包含小(s)基因片段(編碼核蛋白)、中(m)基因片段(編碼糖蛋白)、大(l)基因片段(編碼轉(zhuǎn)錄酶和復(fù)制酶)，其序列分別為seq.id.no.7、seq.id.no.8、seq.id.no.9)的保守區(qū)域設(shè)計(jì)引物，得到一對(duì)位于核蛋白基因的引物akvs1和akvs2以及一對(duì)位于糖蛋白基因的引物akvm1和akvm2，送深圳華大基因合成，用depc處理水溶解，-20℃保存。

表1引物序列

分別用引物akvs1和akvs2及akvm1和akvm2擴(kuò)增新型竹鼠源阿卡斑病毒陽(yáng)性樣品，初步篩選引物的特異性及穩(wěn)定性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：引物akvs1和akvs2能擴(kuò)增出非特異目的條帶，且非特異條帶非常明顯，已影響結(jié)果判定。故被淘汰。

實(shí)施例2rt-pcr反應(yīng)體系與反應(yīng)程序的建立

1、rna模板制備

均勻剪取發(fā)病竹鼠的心、肝、脾、肺、腎等組織與抽濾除菌dmem按體積比1∶5的比例研磨制成病料懸液，分裝到1.5mlep管內(nèi)，經(jīng)3次凍融后，將病料懸液8000rpm4℃離心5min，取上清200μl，同時(shí)等量吸取陽(yáng)性對(duì)照與陰性對(duì)照(見實(shí)施例6)并編號(hào)。按照axygen體液病毒dna/rna小量試劑盒提取模板rna，產(chǎn)物直接用于rt-pcr反應(yīng)或置于-80℃保存。

2、rt-pcr擴(kuò)增反應(yīng)

按pcr反應(yīng)體系(見表2)配制反應(yīng)混合物放入takarart-pcr儀，rt-pcr反應(yīng)程序：反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：50℃30min；預(yù)變性：94℃4min；變性：94℃30sec；退火：57℃45sec；延伸：72℃1min；共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；延伸：72℃5min。反應(yīng)結(jié)束后，取rt-pcr產(chǎn)物5μl點(diǎn)樣于1％瓊脂糖凝膠加樣孔內(nèi)(含0.5μg/ml溴化乙錠)電泳進(jìn)行鑒定，如電泳結(jié)果在816bp處出現(xiàn)擴(kuò)增條帶，同時(shí)陰、陽(yáng)性成立，即表明待檢樣品中有新型竹鼠源阿卡斑病毒。

表2rt-pcr反應(yīng)液組份

實(shí)施例3pcr檢測(cè)方法退火溫度確定

用提取好的樣品rna做模板，設(shè)置不同的退火溫度，然后其他條件均設(shè)置成相同進(jìn)行rt-pcr，rt-pcr完成后取產(chǎn)物5μl點(diǎn)樣于1％瓊脂糖凝膠加樣孔內(nèi)(含0.5μg/ml溴化乙錠)。電泳后的凝膠于紫外分析儀下觀察結(jié)果，已確定其最佳退火溫度，結(jié)果顯示退火溫度從53℃-60℃，pcr產(chǎn)物結(jié)果均很特異(圖1)，最終確定本檢測(cè)方法的退火溫度設(shè)為57℃。

實(shí)施例4特異性實(shí)驗(yàn)

用前述已建立的pcr方法，分別提取新型竹鼠源阿卡斑病毒、竹鼠圓環(huán)病毒、竹鼠細(xì)小病毒、竹鼠內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒、竹鼠乳酸脫氫酶升高病毒核酸。按表2的體系配制反應(yīng)液，按照實(shí)施例2的方法進(jìn)行特異性試驗(yàn)。結(jié)果顯示只有竹鼠源阿卡斑病毒能進(jìn)行特異性擴(kuò)增，其它病毒不能擴(kuò)增出目的條帶(圖2)。結(jié)果表明，本發(fā)明檢測(cè)方法具有很高的特異性。

實(shí)施例5靈敏度實(shí)驗(yàn)

用蛋白質(zhì)核酸測(cè)定儀測(cè)定了模板cdna濃度為23ng/μl，對(duì)模板cdna進(jìn)行10倍倍比稀釋然后進(jìn)行pcr，35個(gè)pcr循環(huán)后，檢測(cè)該方法的敏感性，最終測(cè)定該方法的最低檢測(cè)量為23pg(圖3)。

實(shí)施例6試劑盒組裝

根據(jù)以上實(shí)施例的研究結(jié)果，組裝檢測(cè)試劑盒以方便使用。

1、引物為akvm1和akvm2，濃度均為10μm。

2、rna提取試劑：使用總rna純化試劑為axygen體液病毒dna/rna小量試劑盒。

3、pcr擴(kuò)增試劑：天根生物公司生產(chǎn)的病毒檢測(cè)用一步法rt-pcr試劑盒(目錄號(hào)：sd102)。

4、新型竹鼠源阿卡斑病毒陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照

陽(yáng)性對(duì)照：將需擴(kuò)增的糖蛋白基因的目的序列(seq.id.no.5)經(jīng)rt-pcr擴(kuò)增并克隆進(jìn)pmd-18t，構(gòu)成并測(cè)序驗(yàn)證100％同源，最后制備目的片段重組質(zhì)粒pmd-m1，在含氨芐青霉素的lb細(xì)菌培養(yǎng)液中進(jìn)行培養(yǎng)，收獲菌液提取質(zhì)粒作為陽(yáng)性對(duì)照。

陰性對(duì)照：無(wú)菌采集的阿卡斑病毒陰性的昆明小鼠血清。

實(shí)施例7臨床應(yīng)用

對(duì)臨床上疑似新型竹鼠源阿卡斑病毒的病鼠進(jìn)行解剖采樣檢測(cè)，使用前述試劑盒按照本發(fā)明的pcr檢測(cè)方法進(jìn)行。結(jié)果顯示，臨床檢測(cè)樣品擴(kuò)增出816bp的特異性帶，為新型竹鼠源阿卡斑病毒陽(yáng)性(圖4)。

sequencelisting

<110>廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所

<120>用于檢測(cè)新型竹鼠源阿卡斑病毒的引物及其試劑盒

<130>用于檢測(cè)新型竹鼠源阿卡斑病毒的引物及其試劑盒

<160>9

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