本發(fā)明涉及藥物化學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種苯并噻唑衍生物，包括這些衍生物制備方法以及在抗炎領(lǐng)域的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

隨著老齡化、城市化的不斷擴(kuò)張及生活環(huán)境的不斷變化，很多與環(huán)境、年齡相關(guān)的疾病在世界范圍內(nèi)日益成為一個(gè)嚴(yán)重的健康問(wèn)題。這些疾病包括癌癥、炎癥、老年癡呆癥、組賽性肺病、心臟病、糖尿病及帕金森病等，而如何有效的預(yù)防與治療這些疾病是全世界都在關(guān)注的課題。

氧化應(yīng)激(oxidativestress)直接或者間接地?fù)p傷細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)、脂質(zhì)等大分子物質(zhì)的生理功能，被認(rèn)為與腫瘤、炎癥、帕金森病和老年癡呆癥等。nrf2(核因子e2相關(guān)因子2)是細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)中的關(guān)鍵因子，受keap1(keleh樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白-1)蛋白的調(diào)控(freeradic.biol.med.2004,36,1208)，通過(guò)抗氧化反應(yīng)原件are(抗氧化反應(yīng)元件)相互作用，調(diào)節(jié)抗氧化蛋白和ii相解毒酶的表達(dá)，如nad(p)h:醌氧化還原酶(nad(p)h:quinineoxidoreductase1,nqo1)，血紅素加氧1(hemoxygenase-1,ho-1)等。大量研究表明，在正常條件下nrf2與其抑制蛋白keap1結(jié)合，存在于細(xì)胞中。發(fā)生氧化應(yīng)激時(shí)，keap1的半胱氨酸殘基被修飾，構(gòu)象改變后導(dǎo)致nrf2蛋白釋放，進(jìn)入細(xì)胞核中與are結(jié)合，促進(jìn)靶基因的表達(dá)，從而發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)作用。病理?xiàng)l件下，機(jī)體無(wú)法上keap1-nrf2解離。而nrf2蛋白可以經(jīng)泛素化降解，不能入核誘導(dǎo)抗氧化基因的表達(dá)，導(dǎo)致疾病的發(fā)生(med.res.rev.2012,32,687)。

過(guò)去30多年中多個(gè)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)展了大量工作，從天然化合物或人工合成化合物庫(kù)中篩選nrf2小分子激動(dòng)劑，通過(guò)化學(xué)小分子模擬正常機(jī)體修飾keap1的半胱氨酸殘基的生物過(guò)程，釋放nrf2使其入核，發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)作用。nrf2激活劑已經(jīng)被用于治療炎性相關(guān)疾病，如富馬酸二甲酯已經(jīng)被fda批準(zhǔn)用于治療多發(fā)性硬化癥，cddo-me正在開(kāi)張治療肺動(dòng)脈高壓的二期臨床。另外，一些具有抗炎活性的天然產(chǎn)物和類(lèi)天然產(chǎn)物(姜黃素、白藜蘆醇和查爾酮等)也已經(jīng)被證實(shí)可激活nrf2(專(zhuān)利公布號(hào)：cn105566241a)。但令人遺憾的是，長(zhǎng)時(shí)間使用共價(jià)結(jié)合修飾keap1蛋白，持續(xù)激活nrf2會(huì)引起較大的細(xì)胞毒性，易導(dǎo)致癌變發(fā)生。

近年來(lái)，設(shè)計(jì)直接抑制keap1-nrf2蛋白質(zhì)相互作用的小分子成為了發(fā)現(xiàn)keap1-nrf2-are通路調(diào)節(jié)的一個(gè)新策略(curr.top.med.chem.2007,7,972)。目前，肽類(lèi)keap1-nrf2相互作用抑制劑的細(xì)胞滲透能力限制其應(yīng)用(org.biomol.chem.,2013,11,3553；bioorg.med.chem.lett.2013,23,3029)；非肽類(lèi)小分子keap1-nrf2結(jié)合抑制劑成為該領(lǐng)域研究熱點(diǎn)。目前已有多個(gè)制藥公司及高校都在開(kāi)展此方面的研究，并報(bào)道了一系列keap1-nrf2相互作用的小分子直接抑制劑(medchemcomm.,2014,5,93；chemmedchem.,2014,9,699；j.med.chem.,2014,57,1121；j.med.chem.,2016,59,3991)，在治療腫瘤、炎癥、抗帕金森病及抗老年癡呆癥藥物研發(fā)方面顯示出極強(qiáng)的應(yīng)用前景。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明公開(kāi)一種如式i所示的苯并噻唑衍生物，其制備方法及其醫(yī)療用途。初步活性測(cè)試證明本發(fā)明化合物具有良好的keap1-nrf2蛋白蛋白相互作用抑制活性，可干擾keap1-nrf2的結(jié)合，從而激活nrf2，具有潛在的抗炎活性，可用于治療眾多與炎癥相關(guān)的疾病，如腫瘤、帕金森病、老年癡呆癥、慢性阻塞性肺疾病、動(dòng)脈粥硬化、慢性腎病疾病、糖尿病或類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。

本發(fā)明的化合物，(e)-烯丙基-(2-(2-(苯并[d]噻唑-2)-2-腈乙烯基)-5-(二乙基氨基)苯基)碳酸酯(式i)，結(jié)構(gòu)式如下：

本發(fā)明還公開(kāi)了式i化合物的制備方法，如下：

1)式1化合物的合成步驟中，所采用的堿優(yōu)選三乙胺、二乙胺、碳酸鈉、碳酸氫鈉、碳酸氫鉀、碳酸鉀、碳酸銫、二甲基氨基吡啶、吡啶或1,8-二氮雜二環(huán)十一碳-7-烯；溶劑優(yōu)選甲醇、乙醇、n,n-二甲基甲酰胺、二甲亞砜、1,4-二氧六環(huán)和乙腈中的一種或幾種；該反應(yīng)溫度為0℃～80℃，反應(yīng)時(shí)間為1～24小時(shí)。

2)式1化合物到式i化合物的合成步驟中，堿優(yōu)選三乙胺、二乙胺、二甲基氨基吡啶、吡啶或1,8-二氮雜二環(huán)十一碳-7-烯；溶劑優(yōu)選二氯甲烷、丙酮、n,n-二甲基甲酰胺、1,4-二氧六環(huán)、二甲亞砜和乙腈中的一種或幾種；該反應(yīng)溫度為-10℃～80℃，反應(yīng)時(shí)間為1～24小時(shí)。

本發(fā)明基于nrf2-keap1蛋白蛋白相互作用，發(fā)現(xiàn)了一種具有良好藥理活性的苯并噻唑衍生物。該化合物在基于熒光偏振的keap1-nrf2蛋白蛋白相互作用抑制實(shí)驗(yàn)中，表現(xiàn)出的活性?xún)?yōu)于陽(yáng)性對(duì)照s47(j.med.chem.2014,57,1121)。在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，該化合物可使大鼠心肌細(xì)胞nrf2入核，并使抗氧化因子ho-1、nqo1水平上調(diào)，同時(shí)抑制lps誘導(dǎo)的炎性因子tnf-α，il-1β，il-6水平的上調(diào)。因此，該化合物有望作為先導(dǎo)化合物，進(jìn)一步開(kāi)發(fā)為抗炎藥物，在制備預(yù)防和/或治療腫瘤、炎癥、帕金森病及老年癡呆癥的藥物中具有潛在的應(yīng)用前景。

附圖說(shuō)明

圖1表面等離子共振實(shí)驗(yàn)測(cè)定化合物對(duì)keap1蛋白的親和力圖；

圖2凝膠電泳圖；

圖3共聚焦顯微鏡下觀察各組細(xì)胞中nrf2定位圖；

圖4化合物促進(jìn)ho-1、nq01的mrna水平上調(diào)圖；

圖5化合物抑制脂多糖(lps)誘導(dǎo)的炎性因子tnf-a、il-1β、il-6mrna水平上調(diào)圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明。

實(shí)施例1：式1化合物的制備

將3.5g苯并噻唑-2-乙腈和3.9g4-(二乙胺基)水楊醛溶于120ml甲醇溶液中，氮?dú)獗Ｗo(hù)，隨后1ml三乙胺，室溫?cái)嚢?2小時(shí)。之后將反應(yīng)液濃縮，殘余物經(jīng)柱層析純化后得到5.5g黃色固體化合物式1，產(chǎn)率79％。¹hnmr(600mhz,cdcl3)δ8.01(1h,d,j＝6hz),7.90(1h,d,j＝6hz),7.47(1h,dd,j＝6,6hz),7.35(1h,dd,j＝6,6hz),7.29(1h,d,j＝6hz),6.48(1h,d,j＝6hz),6.40(1h,s),3.42(4h,t,j＝6hz),1.22(6h,t,j＝6hz).¹³cnmr(150mhz,cdcl3)δ156.1,151.6,142.2,137.2,130.9,130.2,126.2,124.8,122.6,122.4,121.7,121.4,111.0,108.2,97.1,96.9,45.3,12.7.esi-msm/z:350.1[m+h]⁺.

實(shí)施例2：式i化合物的制備

將700mg式1化合物溶于20ml二氯甲烷中，冰浴至0℃，加入424mg三光氣和1ml三乙胺。待反應(yīng)進(jìn)行1小時(shí)，加入166mg烯丙醇，攪拌12小時(shí)。反應(yīng)液減壓濃縮，殘余物經(jīng)柱層析純化后得到220mg黃色固體化合物式i，產(chǎn)率25％。¹hnmr(400mhz,cdcl3)δ8.82(1h,s),8.02(1h,d,j＝8hz),7.92(1h,d,j＝8hz),7.51-7.35(3h,m),6.63(1h,d,j＝12hz),6.14-6.07(1h,m),6.48(1h,s),5.48(1h,d,j＝8hz),5.31(1h,d,j＝8hz),4.86(2h,shz),3.45(4h,q,j＝8.0hz),1.24(6h,t,j＝7.0hz).¹³cnmr(100mhz,cdcl3)δ161.5,159.6,155.8,153.1,152.4,151.9,139.8,137.0,132.7,130.8,126.1,124.5,122.3,121.6,118.2,114.2,109.9,108.6,97.0,67.0,45.1,12.7.esi-msm/z:434.8[m+h]⁺.

實(shí)施例3：熒光偏振法測(cè)定化合物對(duì)keap1-nrf2蛋白結(jié)合抑制活性

熒光偏振法測(cè)定keap1-nrf2蛋白結(jié)合抑制活性將熒光探針(fitc–βala–deetgef–oh)溶解于緩沖液(10mmhepes,ph7.4,3.4mmedta,150mmnacl,0.005％tween-20)稀釋至10nm，加入到梯度稀釋的keap1蛋白中，室溫避光孵育30分鐘，熒光各向異性值用spectramaxm5e酶標(biāo)儀讀取(ex:485nm,em:535nm)。蛋白結(jié)合常數(shù)根據(jù)熒光各向異性值用mathematica7(wolframresearchinc.)擬合得到。具體公式如下：

實(shí)驗(yàn)對(duì)待測(cè)化合物進(jìn)行單濃度(100μm)，以化合物s47(j.med.chem.2014,57,1121)作為對(duì)照化合物，抑制率為

然后將化合物溶解于dmso用緩沖液(10mmhepes，ph7.4,3.4mmedta,150mmnacl,0.005％tween–20)稀釋至需要濃度(1％dmso)，20μl化合物加入到60μl含有10nm熒光探針(fitc–βala–deetgef–oh)，400nm的keap1蛋白的溶液中，室溫避光孵育1小時(shí)。熒光各向異性值用biotecksynergy2酶標(biāo)儀讀取(ex:485nm,em:535nm)。蛋白結(jié)合常數(shù)根據(jù)熒光各向異性值用mathematica7(wolframresearchinc.)擬合得到。具體公式如下：

其中a＝kd1+kd2+lst+lt-rt；b＝(lt-rt)kd1+(lst-rt)kd2+kd1kd2；c＝-kd1kd2rt；

公式中，q值是熒光探針的與最高蛋白濃度下結(jié)合后的熒光強(qiáng)度和自由狀態(tài)的熒光強(qiáng)度的比值，fsb為熒光探針結(jié)合部分，ab和af分別為結(jié)合和自由狀態(tài)下的探針的各向異性值，kd1是探針的蛋白結(jié)合常數(shù),lst為探針濃度，rt為蛋白濃度，kd2為化合物的蛋白結(jié)合抑制常數(shù)。

測(cè)試結(jié)果式i化合物在100μm濃度下對(duì)keap1-nrf2蛋白蛋白相互作用的抑制率為81.25％，其蛋白結(jié)合抑制常數(shù)kd2值為5.1μm，略?xún)?yōu)于陽(yáng)性對(duì)照s47(kd2值為7.6μm)。

實(shí)施例4：表面等離子共振實(shí)驗(yàn)測(cè)定化合物對(duì)keap1蛋白的親和力

計(jì)算配體偶聯(lián)水平：1.5×rl＝10440ru；預(yù)富集(phscouting)，選擇合適的偶聯(lián)ph及配體濃度：將配體稀釋于不同ph的10mmnaac中(配體終濃度約為25-50μg/ml)，流經(jīng)空白芯片表面，測(cè)試靜電吸附的效果；偶聯(lián)配體(immobilization)：先用空白芯片靜電吸附測(cè)試預(yù)富集能力，再用edc、nhs處理以活化芯片表面，然后進(jìn)樣配體，偶聯(lián)600s，最終采用ethanolamine封閉芯片表面。

配制dmso濃度范圍為4.5％-5.8％的系列校正溶液，分別在全部分析物之前、全部分析物之后、和每30個(gè)分析物之后進(jìn)樣校正溶液，用于校正分析物中dmso的濃度誤差。

將分析物的儲(chǔ)備液，用工作緩沖液逐級(jí)遞減稀釋成系列濃度(0、250、500、1000、2000、4000、8000、16000、32000、64000nm。采用kinetics/affinity程序進(jìn)樣，樣品以流速30μl/min，進(jìn)樣120s，解離120s。

得到的數(shù)據(jù)用采用biacoret200evaluationsoftware進(jìn)行分析。計(jì)算溶劑dmso濃度校正曲線，選擇適當(dāng)?shù)臐舛确秶徒Y(jié)合曲線，扣除參比通道及零濃度，采用穩(wěn)態(tài)模型進(jìn)行擬合分析，獲得親和力數(shù)值及參數(shù)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1所示，化合物與keap1蛋白的親和常數(shù)為48.1.μm。

report

parameters

實(shí)施例5：化合物促進(jìn)nrf2向細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)移

將大鼠心肌細(xì)胞h9c2細(xì)胞種植在小皿中，分別用4μm、8μm以及16μm化合物處理細(xì)胞6h，將處理好的對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞吸棄培養(yǎng)液，用1×pbs清洗一次，加入1ml預(yù)冷1×pbs，用細(xì)胞刮子刮下細(xì)胞，用移液槍將細(xì)胞加入預(yù)冷的離心管中4℃、1000rpm離心5min，吸盡上清，留下細(xì)胞沉淀備用；利用試劑盒分別提取細(xì)胞核蛋白和非細(xì)胞核蛋白；取10μl提取的細(xì)胞漿蛋白樣品及5μl細(xì)胞核蛋白樣品到eppendorf管內(nèi)，加ddh2o補(bǔ)足10μl，利用bca測(cè)蛋白濃度；制作分離膠12％，濃縮膠5％；100℃蛋白樣品變性5min，每個(gè)樣品上樣12μg；60v進(jìn)膠，120v恒壓跑膠；用轉(zhuǎn)移槽80v/160ma恒流轉(zhuǎn)膜，2.5h；tbst配制的5％脫脂牛奶室溫封閉1.5h；棄掉奶粉用tbst沖洗干凈后，用tbst配制的5％的bsa溶液按1:1000的比例稀釋一抗，pvdf膜4℃孵育過(guò)夜；tbst洗膜，3次，每次5min；用tbst配制的5％的脫脂牛奶溶液將二抗按1:5000的比例稀釋?zhuān)覝胤跤?h；用tbst洗膜，3次，每次5min；使用化學(xué)發(fā)光儀用milipore底物顯膜，用imagej分析凝膠電泳圖并定量。結(jié)果顯示8μm、16μm化合物使細(xì)胞核內(nèi)nrf2水平顯著上調(diào)(圖2所示)。

另一方面，用8μm化合物處理h9c2細(xì)胞6h，吸棄培養(yǎng)液，pbs清洗一遍，細(xì)胞經(jīng)固定，封閉后，加入nrf2一抗四度過(guò)夜，二抗孵育37度孵育1小時(shí)，dapi復(fù)染細(xì)胞核，共聚焦顯微鏡下觀察各組細(xì)胞中nrf2定位在對(duì)照組中，nrf2主要位于細(xì)胞質(zhì)中，8μm的化合物處理細(xì)胞6h，細(xì)胞核中的nrf2顯著增多(圖3所示)。

實(shí)施例6：化合物使ho-1、nq01mrna水平上調(diào)

nrf2入核能夠激活下游抗氧化元件，因此，我們進(jìn)一步利用rt-pcr分析了化合物是否能夠激活下游抗氧化元件ho-1以及nq01。將h9c2細(xì)胞種植在小皿中，8μm化合物分別處理h9c2細(xì)胞2h、4h以及6h，trizol裂解細(xì)胞，提取細(xì)胞內(nèi)rna，反轉(zhuǎn)為dna，利用實(shí)時(shí)定量pcr儀分析，分析ho-1、nq01水平。結(jié)果如圖4所示，化合物處理細(xì)胞2h、4h以及6h均顯著上調(diào)ho-1以及nq01的mrna水平。

實(shí)施例7：化合物抑制脂多糖(lps)誘導(dǎo)的炎性因子tnf-a、il-1β、il-6mrna水平上調(diào)。

將h9c2細(xì)胞種植在小皿中，利用1μg/ml的lps刺激h9c2細(xì)胞建立炎癥模型，8μm化合物與脂多糖共處理h9c2細(xì)胞6h，trizol裂解細(xì)胞，提取細(xì)胞內(nèi)rna，反轉(zhuǎn)為dna，利用實(shí)時(shí)定量pcr儀分析。結(jié)果如圖5所示，8μm的化合物處理細(xì)胞6h能夠顯著抑制lps誘導(dǎo)的炎性因子tnf-a、il-1β、il-6mrna水平上調(diào)。