本發(fā)明屬于微生物發(fā)酵技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種利用空氣壓力脈動(dòng)固體發(fā)酵生產(chǎn)γ-聚谷氨酸的方法。

背景技術(shù)：

γ-聚谷氨酸是由l-谷氨酸、d-谷氨酸通過(guò)γ-酰胺鍵結(jié)合形成的一種高分子氨基酸聚合物，具有極佳的成膜性、成纖維性、阻氧性、可塑性、保濕性和可生物降解等獨(dú)特理化和生物學(xué)特性，因而具有增稠、乳化、凝膠、成膜、保濕等功能，是一種新型的對(duì)人體和環(huán)境無(wú)毒害的生物相容性天然高分子化合物。

微生物發(fā)酵法是目前生產(chǎn)γ-聚谷氨酸主要方法，基本過(guò)程是選用能大量產(chǎn)生γ-聚谷氨酸的菌種（如枯草桿菌、地衣芽孢桿菌），為其提供合適的生長(zhǎng)環(huán)境，滿足其發(fā)酵過(guò)程的營(yíng)養(yǎng)條件，從而在發(fā)酵基質(zhì)中生產(chǎn)γ-聚谷氨酸，然后對(duì)發(fā)酵基質(zhì)進(jìn)行提取，經(jīng)分離純化得到γ-聚谷氨酸產(chǎn)品。微生物發(fā)酵過(guò)程條件溫和，最終得到的γ-聚谷氨酸產(chǎn)品純度較高。

微生物發(fā)酵方式又分為液體發(fā)酵和固體發(fā)酵。在固體發(fā)酵過(guò)程中的發(fā)酵基質(zhì)一直處于靜止?fàn)顟B(tài)的發(fā)酵方式稱為常規(guī)靜態(tài)固體發(fā)酵，其發(fā)酵基質(zhì)為攪拌均勻的混合物料，為菌種提供發(fā)酵過(guò)程中所需要的營(yíng)養(yǎng)來(lái)源，如氮源、碳源、水、無(wú)機(jī)物等。常規(guī)靜態(tài)固體發(fā)酵的操作流程簡(jiǎn)單，產(chǎn)品產(chǎn)量高、成本低，主要反映在以下幾個(gè)方面：一、發(fā)酵基質(zhì)可以是農(nóng)業(yè)殘?jiān)试铣杀镜?；二、發(fā)酵菌種的生長(zhǎng)狀態(tài)更接近于自然狀態(tài)；三、發(fā)酵過(guò)程少有廢料產(chǎn)生，對(duì)環(huán)境污染小。常規(guī)靜態(tài)固體發(fā)酵雖然有許多優(yōu)點(diǎn)，但也因?yàn)槠渥陨淼陌l(fā)酵性質(zhì)、發(fā)酵過(guò)程中傳熱傳質(zhì)不均勻、基料的溫度和濕度較難掌控等原因，導(dǎo)致其發(fā)酵周期長(zhǎng)、產(chǎn)量低、效率低，這些使得常規(guī)靜態(tài)發(fā)酵在發(fā)展過(guò)程當(dāng)中受到相當(dāng)大的限制。正因?yàn)槌Ｒ?guī)靜態(tài)固體發(fā)酵還有諸多問題沒有解決，發(fā)展新型生物反應(yīng)器及其發(fā)酵工藝已成為研究熱點(diǎn)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于：針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，而提供一種利用空氣壓力脈動(dòng)固體發(fā)酵生產(chǎn)γ-聚谷氨酸的方法，以縮短發(fā)酵周期，提高γ-聚谷氨酸產(chǎn)量。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

一種利用空氣壓力脈動(dòng)固體發(fā)酵生產(chǎn)γ-聚谷氨酸的方法，包括以下步驟：

（1）種子液的制備：將枯草芽孢桿菌斜面菌種接種于已滅菌冷卻的液體種子培養(yǎng)基中，在30~40℃的搖瓶中培養(yǎng)18~36h，即得枯草芽孢桿菌種子液；根據(jù)接種的需要，該種子液可通過(guò)發(fā)酵罐擴(kuò)大培養(yǎng)為二級(jí)種子液或三級(jí)種子液；

（2）固體發(fā)酵培養(yǎng)基的制備：將固體基料與營(yíng)養(yǎng)液按照1:0.8~1:1.4的質(zhì)量比分別投入壓力脈動(dòng)固體發(fā)酵罐中并進(jìn)行攪拌，攪拌均勻后，開啟高溫水蒸氣，在120~125℃的條件下進(jìn)行高溫滅菌處理，處理時(shí)間為30~60min，即得固體發(fā)酵培養(yǎng)基；

（3）接種培養(yǎng)：開啟冷卻水和攪拌，當(dāng)壓力脈動(dòng)固體發(fā)酵罐的罐溫降至30~40℃時(shí)，將枯草芽孢桿菌種子液按發(fā)酵培養(yǎng)基重量的1%~6%的接種量接入壓力脈動(dòng)固體發(fā)酵罐并進(jìn)行攪拌，攪拌均勻后，在通風(fēng)比、壓力脈動(dòng)固體發(fā)酵罐的攪拌轉(zhuǎn)速和壓力脈動(dòng)固體發(fā)酵罐的罐溫分別為0.1~0.8(v/v)、1~10r/min和30~40℃的條件下，進(jìn)行空氣壓力脈動(dòng)刺激培養(yǎng)14~28h。之后取消空氣壓力脈動(dòng)設(shè)置，在壓力脈動(dòng)固體發(fā)酵罐的通風(fēng)比、表壓、罐溫和攪拌轉(zhuǎn)速分別為0.1~0.6(v/v)、0.01~0.05mpa、30~40℃和1~10r/min的條件下繼續(xù)通風(fēng)培養(yǎng)8~20h，即得固體培養(yǎng)物；

（4）產(chǎn)物的提取純化：將步驟（3）所得的固體培養(yǎng)物取出，并往其中加入其重量的5~20倍的蒸餾水或去離子水，加熱至90~100℃，攪拌并保溫0.5~1h，再對(duì)其進(jìn)行過(guò)濾處理，最后將濾液經(jīng)活性炭脫色、醇析、冷凍干燥等程序制得γ-聚谷氨酸。

其中，在步驟（3）接種培養(yǎng)過(guò)程中，前期采用了空氣壓力脈動(dòng)，其所帶來(lái)的有益效果是：

1）壓力脈動(dòng)讓基料間隙的空氣對(duì)流擴(kuò)散，增加基料之間的濕度和溫度的均勻度，還促進(jìn)co2和o2的交換；

2）發(fā)酵過(guò)程中反應(yīng)器內(nèi)的壓力一直大于外界的壓力，有效阻止了外界雜菌的進(jìn)入，防止發(fā)酵基料受到污染；

3）在泄壓操作中，因突然快速排氣，顆粒間的氣相因減壓膨脹，對(duì)固體顆粒起松動(dòng)作用，不但使供氧充足，而且為菌體的大量繁殖擴(kuò)充了空間，所以發(fā)酵料層內(nèi)外菌體都十分豐滿；

4）當(dāng)空氣壓力處于脈動(dòng)狀態(tài)（即周期性的加壓與釋壓）時(shí)，微生物細(xì)胞通過(guò)細(xì)胞膜與周圍基質(zhì)之間發(fā)生物質(zhì)、能量、信息交換，對(duì)發(fā)酵菌種的生命活動(dòng)產(chǎn)生有利的影響，使原料轉(zhuǎn)化率提高，發(fā)酵時(shí)間縮短。

另外，在步驟（3）接種培養(yǎng)過(guò)程中，后期取消壓力脈動(dòng)并采用常規(guī)通風(fēng)發(fā)酵，是為了不讓微生物過(guò)度生長(zhǎng)而消耗谷氨酸及降解γ-聚谷氨酸作為營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，從而實(shí)現(xiàn)谷氨酸原料盡量向目標(biāo)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化的目的。

作為本發(fā)明所述的利用空氣壓力脈動(dòng)固體發(fā)酵生產(chǎn)γ-聚谷氨酸的方法的一種改進(jìn)，所述固體基料由大豆粉和麩皮組成，所述大豆粉和所述麩皮的質(zhì)量比例為0.1:1~1:1。

作為本發(fā)明所述的利用空氣壓力脈動(dòng)固體發(fā)酵生產(chǎn)γ-聚谷氨酸的方法的一種改進(jìn)，所述營(yíng)養(yǎng)液的組成為：葡萄糖或蔗糖30~60g/l、谷氨酸鈉10~50g/l、檸檬酸10~30g/l、k2hpo41g/l、nh4cl7g/l、fecl3?6h2o0.04g/l、mgso4?7h2o0.5g/l、cacl2?2h2o0.2g/l、mnso4?h2o0.1g/l，其余為水。

作為本發(fā)明所述的利用空氣壓力脈動(dòng)固體發(fā)酵生產(chǎn)γ-聚谷氨酸的方法的一種改進(jìn)，所述營(yíng)養(yǎng)液的ph值通過(guò)濃度為10%的naoh溶液調(diào)節(jié)為6.5~7.5。

作為本發(fā)明所述的利用空氣壓力脈動(dòng)固體發(fā)酵生產(chǎn)γ-聚谷氨酸的方法的一種改進(jìn)，在步驟（2）中，所述固體發(fā)酵培養(yǎng)基的體積為壓力脈動(dòng)固體發(fā)酵罐容積的20%~60%。

作為本發(fā)明所述的利用空氣壓力脈動(dòng)固體發(fā)酵生產(chǎn)γ-聚谷氨酸的方法的一種改進(jìn)，在步驟（3）中，所述空氣壓力脈動(dòng)的氣壓上限為0.1~0.3mpa，所述空氣壓力脈動(dòng)的氣壓下限為0.01~0.05mpa。氣壓上限和氣壓下限的壓力值均是表壓。

作為本發(fā)明所述的利用空氣壓力脈動(dòng)固體發(fā)酵生產(chǎn)γ-聚谷氨酸的方法的一種改進(jìn)，在步驟（3）中，所述空氣壓力脈動(dòng)的脈動(dòng)周期為10~120min。

作為本發(fā)明所述的利用空氣壓力脈動(dòng)固體發(fā)酵生產(chǎn)γ-聚谷氨酸的方法的一種改進(jìn)，在步驟（4）中，所述過(guò)濾處理為先用100目篩網(wǎng)過(guò)濾，再用1~50μm濾袋式過(guò)濾器精濾。

相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明具有以下有益效果：

1）本發(fā)明中枯草桿菌的生長(zhǎng)繁殖速度遠(yuǎn)高于常規(guī)靜態(tài)固體發(fā)酵工藝，其最終生物量約為常規(guī)靜態(tài)固體發(fā)酵的4~6倍，而且由于微生物數(shù)量的優(yōu)勢(shì)，使其發(fā)酵過(guò)程更為劇烈，對(duì)底物的利用也更加徹底；

2）本發(fā)明的發(fā)酵周期為22~48h，γ-聚谷氨酸產(chǎn)量為100~120g/kg基質(zhì)，比常規(guī)靜態(tài)固體發(fā)酵工藝縮短發(fā)酵周期10~16h，產(chǎn)量提高30~50%，效率高、操作簡(jiǎn)單、有良好的應(yīng)用前景；

3）本發(fā)明中的發(fā)酵培養(yǎng)物還可應(yīng)用于用其他行業(yè)，如提取納豆激酶，或直接用作菌肥等。

具體實(shí)施方式

下面將結(jié)合具體實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明及其有益效果作進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明，但是，本發(fā)明的具體實(shí)施方式并不局限于此。

實(shí)施例1

本實(shí)施例提供一種利用空氣壓力脈動(dòng)固體發(fā)酵生產(chǎn)γ-聚谷氨酸的方法，包括以下步驟：

（1）種子液的制備：將枯草芽孢桿菌斜面菌種接種于已滅菌冷卻的液態(tài)種子培養(yǎng)基中，并在37℃的搖瓶培養(yǎng)24h，即得枯草芽孢桿菌種子液；其中，液態(tài)種子培養(yǎng)基的組成為：蛋白胨10g/l，牛肉膏5g/l，nacl10g/l，ph值為7.0，其余為水；

（2）固體發(fā)酵培養(yǎng)基的制備：先將30g葡萄糖、25g谷氨酸鈉、15g檸檬酸、0.5gk2hpo4、3.5gnh4cl、0.02gfecl3?6h2o、0.25gmgso4?7h2o、0.1gcacl2?2h2o和0.05gmnso4?h2o加水溶解至500ml，再用10%的naoh溶液調(diào)節(jié)其ph值為7.0，即得營(yíng)養(yǎng)液；然后將該營(yíng)養(yǎng)液投入5l的壓力脈動(dòng)固體發(fā)酵罐中，再加入210g大豆粉和210g麩皮作為固體基料，將其攪拌均勻，最后通入高溫水蒸氣于121℃的條件下滅菌45min；

（3）接種培養(yǎng)：開啟冷卻水和攪拌，當(dāng)壓力脈動(dòng)固體發(fā)酵罐的罐溫降至30~40℃時(shí)，將枯草芽孢桿菌種子液按固體發(fā)酵培養(yǎng)基重量的3%接種量接入壓力脈動(dòng)固體發(fā)酵罐，在通風(fēng)比為0.3~0.5(v/v)、壓力脈動(dòng)固體發(fā)酵罐的攪拌轉(zhuǎn)速為10r/min和壓力脈動(dòng)固體發(fā)酵罐的罐溫為37℃的條件下，進(jìn)行壓力脈動(dòng)刺激培養(yǎng)16h，該過(guò)程中，空氣壓力脈動(dòng)的氣壓上限值為0.25mpa（表壓），空氣壓力脈動(dòng)的氣壓下限為0.015mpa（表壓），空氣壓力脈動(dòng)的脈動(dòng)周期為10~30min。之后取消壓力脈動(dòng)設(shè)置，在通風(fēng)比為0.2(v/v)、壓力脈動(dòng)固體發(fā)酵罐的罐溫為37℃、罐壓為0.015mpa（表壓）、攪拌轉(zhuǎn)速為8r/min的條件下繼續(xù)通風(fēng)培養(yǎng)18h，即得固體培養(yǎng)物；

（4）產(chǎn)物的提取純化：將固體培養(yǎng)物取出，加入其重量的10倍的蒸餾水或去離子水，加熱至95℃，攪拌并保溫1h，然后用100目篩網(wǎng)過(guò)濾，再用1~50μm濾袋式過(guò)濾器精濾，最后將濾液經(jīng)活性炭脫色、醇析、冷凍干燥等程序制得γ-聚谷氨酸。

本實(shí)施例所制備的γ-聚谷氨酸的產(chǎn)量為105~110g/kg培養(yǎng)基，發(fā)酵周期為34h。

實(shí)施例2

本實(shí)施例提供一種利用空氣壓力脈動(dòng)固體發(fā)酵生產(chǎn)γ-聚谷氨酸的方法，包括以下步驟：

（1）種子液的制備：將枯草芽孢桿菌斜面菌種接種于已滅菌冷卻的液態(tài)種子培養(yǎng)基中，并在38℃的搖瓶培養(yǎng)20h，即得枯草芽孢桿菌種子液；其中，液態(tài)種子培養(yǎng)基的組成為：蛋白胨8g/l，牛肉膏4g/l，nacl8g/l，ph值為6.5，其余為水；

（2）固體發(fā)酵培養(yǎng)基的制備：先將25g葡萄糖、20g谷氨酸鈉、10g檸檬酸、0.5gk2hpo4、3.5gnh4cl、0.02gfecl3?6h2o、0.25gmgso4?7h2o、0.1gcacl2?2h2o和0.05gmnso4?h2o加水溶解至500ml，再用10%的naoh溶液調(diào)節(jié)其ph值為6.5，即得營(yíng)養(yǎng)液；然后將該營(yíng)養(yǎng)液投入5l的壓力脈動(dòng)固體發(fā)酵罐中，再加入150g大豆粉和300g麩皮作為固體基料，將其攪拌均勻，最后通入高溫水蒸氣于120℃的條件下滅菌50min；

（3）接種培養(yǎng)：開啟冷卻水和攪拌，當(dāng)壓力脈動(dòng)固體發(fā)酵罐的罐溫降至30~40℃時(shí)，將枯草芽孢桿菌種子液按固體發(fā)酵培養(yǎng)基重量的5%接種量接入壓力脈動(dòng)固體發(fā)酵罐，在通風(fēng)比為0.1~0.3(v/v)、壓力脈動(dòng)固體發(fā)酵罐的攪拌轉(zhuǎn)速為5r/min和壓力脈動(dòng)固體發(fā)酵罐的罐溫為38℃的條件下，進(jìn)行壓力脈動(dòng)刺激培養(yǎng)14h，該過(guò)程中，空氣壓力脈動(dòng)的氣壓上限值為0.3mpa（表壓），空氣壓力脈動(dòng)的氣壓下限為0.01mpa（表壓），空氣壓力脈動(dòng)的脈動(dòng)周期為30~50min。之后取消壓力脈動(dòng)設(shè)置，在通風(fēng)比為0.1(v/v)、壓力脈動(dòng)固體發(fā)酵罐的罐溫為38℃、罐壓為0.02mpa（表壓）、攪拌轉(zhuǎn)速為5r/min的條件下繼續(xù)通風(fēng)培養(yǎng)16h，即得固體培養(yǎng)物；

（4）產(chǎn)物的提取純化：將固體培養(yǎng)物取出，加入其重量的5倍的蒸餾水或去離子水，加熱至90℃，攪拌并保溫1h，然后用100目篩網(wǎng)過(guò)濾，再用1~50μm濾袋式過(guò)濾器精濾，最后將濾液經(jīng)活性炭脫色、醇析、冷凍干燥等程序制得γ-聚谷氨酸。

本實(shí)施例所制備的γ-聚谷氨酸的產(chǎn)量為103~108g/kg培養(yǎng)基，發(fā)酵周期為30h。

實(shí)施例3

本實(shí)施例提供一種利用空氣壓力脈動(dòng)固體發(fā)酵生產(chǎn)γ-聚谷氨酸的方法，包括以下步驟：

（1）種子液的制備：將枯草芽孢桿菌斜面菌種接種于已滅菌冷卻的液態(tài)種子培養(yǎng)基中，并在30℃的搖瓶培養(yǎng)36h，即得枯草芽孢桿菌種子液；其中，液態(tài)種子培養(yǎng)基的組成為：蛋白胨12g/l，牛肉膏6g/l，nacl12g/l，ph值為7.5，其余為水；

（2）固體發(fā)酵培養(yǎng)基的制備：先將20g葡萄糖、18g谷氨酸鈉、12g檸檬酸、0.5gk2hpo4、3.5gnh4cl、0.02gfecl3?6h2o、0.25gmgso4?7h2o、0.1gcacl2?2h2o和0.05gmnso4?h2o加水溶解至500ml，再用10%的naoh溶液調(diào)節(jié)其ph值為7.5，即得營(yíng)養(yǎng)液；然后將該營(yíng)養(yǎng)液投入5l的壓力脈動(dòng)固體發(fā)酵罐中，再加入200g大豆粉和300g麩皮作為固體基料，將其攪拌均勻，最后通入高溫水蒸氣于122℃的條件下滅菌40min；

（3）接種培養(yǎng)：開啟冷卻水和攪拌，當(dāng)壓力脈動(dòng)固體發(fā)酵罐的罐溫降至30~40℃時(shí)，將枯草芽孢桿菌種子液按固體發(fā)酵培養(yǎng)基重量的4%接種量接入壓力脈動(dòng)固體發(fā)酵罐，在通風(fēng)比為0.5~0.8(v/v)、壓力脈動(dòng)固體發(fā)酵罐的攪拌轉(zhuǎn)速為8r/min和壓力脈動(dòng)固體發(fā)酵罐的罐溫為35℃的條件下，進(jìn)行壓力脈動(dòng)刺激培養(yǎng)18h，該過(guò)程中，空氣壓力脈動(dòng)的氣壓上限值為0.20mpa（表壓），空氣壓力脈動(dòng)的氣壓下限為0.02mpa（表壓），空氣壓力脈動(dòng)的脈動(dòng)周期為20~30min。之后取消壓力脈動(dòng)設(shè)置，在通風(fēng)比為0.3(v/v)、壓力脈動(dòng)固體發(fā)酵罐的罐溫為35℃、罐壓為0.025mpa（表壓）、攪拌轉(zhuǎn)速為10r/min的條件下繼續(xù)通風(fēng)培養(yǎng)18h，即得固體培養(yǎng)物；

（4）產(chǎn)物的提取純化：將固體培養(yǎng)物取出，加入其重量的15倍的蒸餾水或去離子水，加熱至100℃，攪拌并保溫0.5h，然后用100目篩網(wǎng)過(guò)濾，再用1~50μm濾袋式過(guò)濾器精濾，最后將濾液經(jīng)活性炭脫色、醇析、冷凍干燥等程序制得γ-聚谷氨酸。

本實(shí)施例所制備的γ-聚谷氨酸的產(chǎn)量為110~115g/kg培養(yǎng)基，發(fā)酵周期為36h。

根據(jù)上述說(shuō)明書的揭示和教導(dǎo)，本發(fā)明所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員還能夠?qū)ι鲜鰧?shí)施方式進(jìn)行變更和修改。因此，本發(fā)明并不局限于上述的具體實(shí)施方式，凡是本領(lǐng)域技術(shù)人員在本發(fā)明的基礎(chǔ)上所作出的任何顯而易見的改進(jìn)、替換或變型均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。此外，盡管本說(shuō)明書中使用了一些特定的術(shù)語(yǔ)，但這些術(shù)語(yǔ)只是為了方便說(shuō)明，并不對(duì)本發(fā)明構(gòu)成任何限制。