本發(fā)明涉及意大利青霉(penicilliumitalicum)的遺傳轉(zhuǎn)化方法，屬于遺傳轉(zhuǎn)化領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
：柑橘類水果以其獨特的香氣和味道，在日常銷售的水果中非常受歡迎并在營養(yǎng)供給和促進健康等方面發(fā)揮重要作用。意大利青霉在柑橘的采后貯藏、運輸期間引起大批量的果實腐爛，給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)帶來巨大的經(jīng)濟損失。通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)，可對意大利青霉的特定基因的功能進行探索，從而進一步探究意大利青霉的致病機理、更有效的防治該病害。跟癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化是目前應(yīng)用最為廣泛的遺傳轉(zhuǎn)化方法。根癌農(nóng)桿菌是一種特殊的植物病原菌，能夠通過位于ti質(zhì)粒上的t-dna經(jīng)iv型分泌系統(tǒng)轉(zhuǎn)移到宿主上，t-dna上的基因編碼酶可以影響植物生長調(diào)節(jié)劑的產(chǎn)生，并且它們的表達導(dǎo)致植物細胞的不受控制的生長，形成冠狀腫瘤。根癌農(nóng)桿菌的這種dna轉(zhuǎn)移能力可用于真菌的轉(zhuǎn)化，為此使用二元載體系統(tǒng)，即含有24bp邊界重復(fù)的目的dna的雙元載體和含有對dna轉(zhuǎn)移十分重要vir區(qū)域(毒力區(qū)域)的ti質(zhì)粒。vir區(qū)編碼的蛋白質(zhì)參與t-dna的形成和轉(zhuǎn)運。酚類化合物如乙酰丁香酮，可誘導(dǎo)農(nóng)桿菌vir區(qū)基因的活化和表達。農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化有著以下優(yōu)點：(1)轉(zhuǎn)化效率相比其他方法來說顯著提高；(2)該方法可以適用于大多數(shù)的真菌，包括一些頑抗的真菌；(3)農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化可以使用多種起始材料，除原生質(zhì)體之外，還可以使用較易獲得的分生孢子、菌絲體、子實體，從而避免了原生質(zhì)體提取的繁瑣過程；(4)農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化的單拷貝數(shù)較高；(5)農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化的遺傳穩(wěn)定性比較高。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的之一是提供根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的意大利青霉遺傳轉(zhuǎn)化方法。本發(fā)明的上述目的是通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)的：一種根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的意大利青霉遺傳轉(zhuǎn)化方法，包括以下步驟：1)以潮霉素b抗性基因作為篩選標記，以pacc的上、下游序列作為同源臂，敲除意大利青霉的pacc基因，構(gòu)建含有潮霉素b抗性基因的基因敲除載體pacc3300；2)將步驟1)的基因敲除載體pacc3300轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌感受態(tài)細胞，得到含有敲除載體的根癌農(nóng)桿菌；3)將含有敲除載體的根癌農(nóng)桿菌在含有50ug/ml卡那霉素的lb培養(yǎng)基上擴大培養(yǎng)至od600為0.8，然后再轉(zhuǎn)入含有誘導(dǎo)劑的im培養(yǎng)基培養(yǎng)至od600為0.5，得到根癌農(nóng)桿菌菌液；4)將萌發(fā)的意大利青霉制成濃度為1x105/ml的孢子懸浮液；5)將步驟2)的根癌農(nóng)桿菌菌液與步驟3)的意大利青霉孢子懸浮液按1:1的體積比混合，在帶有承載膜的co-im固體培養(yǎng)基上共培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度25℃，培養(yǎng)時間36h，最后轉(zhuǎn)入含有50ug/ml的潮霉素b和200ug/ml的頭孢霉素的pda培養(yǎng)基中進行抗性培養(yǎng)，篩選獲得轉(zhuǎn)化子，所述pacc基因的核苷酸序列如seqidno：1所示，所述潮霉素b的核苷酸序列如seqidno:2所示。本發(fā)明為了測試野生型意大利青霉對篩選基因潮霉素b的敏感性，開展了意大利青霉對潮霉素b敏感性實驗，結(jié)果表明潮霉素b>5ug/ml時，可完全抑制意大利青霉的生長，因此可以使用潮霉素b作為篩選標記。本發(fā)明為了探究能介導(dǎo)意大利青霉轉(zhuǎn)化的根癌農(nóng)桿菌類型，使用agl-1和gv3101作為農(nóng)桿菌原料，經(jīng)為實驗，農(nóng)桿菌agl-1介導(dǎo)轉(zhuǎn)化得到了許多轉(zhuǎn)化子而gv3101并沒有得到轉(zhuǎn)化子，因此所述的用于介導(dǎo)意大利青霉的根癌農(nóng)桿菌為agl-1。本發(fā)明為了探究意大利青霉孢子懸浮液的濃度對轉(zhuǎn)化的效率，所述的孢子懸浮液的濃度為1x104-1x107cfu/ml，進行轉(zhuǎn)化實驗，更為優(yōu)選的是1x105cfu/ml。本發(fā)明為了探究共培養(yǎng)的溫度對意大利青霉轉(zhuǎn)化的影響，所述的共培養(yǎng)溫度為22℃，25℃和28℃，更優(yōu)選的是25℃。本發(fā)明為了探究im預(yù)誘導(dǎo)農(nóng)桿菌時乙酰丁香酮的影響，所述的方式為不加乙酰丁香酮和添加乙酰丁香酮，更優(yōu)選的是添加乙酰丁香酮。本發(fā)明為了探究共培養(yǎng)的時間對意大利青霉轉(zhuǎn)化的影響，所述的共培養(yǎng)時間為12h，24h，36h和48h，更優(yōu)選的是36h。本發(fā)明對上述方法獲得的轉(zhuǎn)化子的遺傳穩(wěn)定性進行了隨機抽取，提dna進行pcr驗證，結(jié)果表明該方法可穩(wěn)定遺傳。本研究對上述方法獲得的轉(zhuǎn)化子進行驗證，結(jié)果表明利用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化，成功的實現(xiàn)了pacc基因的敲除，并且成功的將外源的dna片段轉(zhuǎn)化到意大利青霉中。本發(fā)明利用所建立的根癌農(nóng)桿菌接到的意大利青霉遺傳轉(zhuǎn)化方法并應(yīng)用所構(gòu)建的同源重組基因敲除原理，成功的建立了一個小型的意大利青霉t-dna隨機插入突變體庫，其中有兩個突變株有著敲除基因的特性。本研究與現(xiàn)有的技術(shù)相比具有以下有益效果：本研究利用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法，操作簡單，轉(zhuǎn)化率高并且轉(zhuǎn)化穩(wěn)定，成功實現(xiàn)了意大利青霉的高效遺傳轉(zhuǎn)化，使得意大利青霉中進行同源敲除、過表達、異源表達成為可能，為基因工程手段對該菌株進行遺傳改良，探究其侵染柑橘的致病機理奠定基礎(chǔ)。附圖說明圖1：敲除載體的構(gòu)建示意圖。圖2：根癌農(nóng)桿菌類型對轉(zhuǎn)化的影響。圖3：意大利青霉孢子濃度對轉(zhuǎn)化效率的影響。圖4：共培養(yǎng)溫度對轉(zhuǎn)化效率的影響圖5：共培養(yǎng)時間對轉(zhuǎn)化效率的影響。圖6：添加乙酰丁香酮對轉(zhuǎn)化的影響。圖7：不同的承載膜對轉(zhuǎn)化的影響。圖8：檢驗轉(zhuǎn)化子的遺傳穩(wěn)定性。具體實施方式下面通過實施例對本發(fā)明進行詳細地說明。1.實驗材料1.1菌株及載體根癌農(nóng)桿菌gv3101、根癌農(nóng)桿菌agl-1、大腸桿菌dh5αpmd19-t載體、質(zhì)粒pskh、質(zhì)粒pcambia3300用于構(gòu)建敲除載體pacc33001.2培養(yǎng)基土豆葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(pda)：馬鈴薯200g，煮沸后取濾液加入蔗糖10g，瓊脂20g，用于意大利青霉的培養(yǎng)。牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基(lb)：胰蛋白胨10g，酵母浸粉5g，nacl10g，用naoh調(diào)ph至7.4，加ddh2o至1l。牛肉蛋白胨固體培養(yǎng)基(lba)：在lb培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上加20g瓊脂表1培養(yǎng)基成分表注：葡萄糖、as及mes需過濾除菌。2.敲除載體的構(gòu)建2.1敲除盒的構(gòu)建以提取的野生型意大利青霉基因組dna為模板，引物up-f/up-r為引物對，擴增pacc基因的上游序列作為5’utr，帶有kpnⅰ酶切位點，以及與抗性基因互補的序列；down-f/down-r為引物對，擴增pacc基因的下游序列作為3’utr，帶有xhoⅰ酶切位點以及與抗性基因互補的序列；以質(zhì)粒pskh為模板，hygb-f/hygb-r為引物對，擴增潮霉素b抗性基因，具體引物如表2所示。表2引物序列表引物/primers序列5’-3’/sequences5’-3’up-fggggtaccccacctcgggatgatgacaagcup-rcaatatcatcttctgtcgaccgccgtagtagaaggggtathygb-fgtcgacagaagatgatattghygb-rctagaaagaaggattacctcdown-fgaggtaatccttctttctagggagtcttttatcccacattacgdown-rccgctcgagcggtcgcgtggagaacgtgtat將5’utr膠回收產(chǎn)物、hygb抗性基因以及3’utr膠回收產(chǎn)物以摩爾比1:2:1(dna總量不少于800ng)加入至融合體系，不添加引物，使用extaq酶進行三個片段的融合，融合pcr程序如下：以融合產(chǎn)物為模板，引物up-f和引物down-r為引物對進行常規(guī)pcr擴增融合片段。擴增產(chǎn)物用1％瓊脂糖凝膠電泳檢測，確定目的片段，并膠回收。2.2敲除載體的構(gòu)建將敲除盒的融合片段，按照pmd19-t載體的說明書連接至t載體，按照大腸桿菌dh5α說明書所述步驟轉(zhuǎn)化至大腸桿菌dh5α。用kpn1和xho1雙酶切質(zhì)粒，并回收融合片段；同樣將pcambia3300用kpn1和xho1雙酶切后回收大片段，t4連接酶16℃過夜連接兩個膠回收片段，得到敲除載體pacc3300，示意圖如圖1所示。3.農(nóng)桿菌介導(dǎo)意大利青霉轉(zhuǎn)化體系的建立3.1.意大利青霉對潮霉素b的敏感性檢測不同的菌株對潮霉素b的敏感程度不一，為了篩選轉(zhuǎn)化子，需要對潮霉素b的濃度進行篩選，篩選方法如下：(1)將意大利青霉菌株接種至pda培養(yǎng)基上，于25℃條件下培養(yǎng)2-3d，使其產(chǎn)孢，用無菌水收集孢子于1.5ml離心管中，通過血球計數(shù)板對意大利青霉的孢子進行計數(shù)，并將最后濃度稀釋至1x106、1x107cfu/ml；(2)在24孔細胞板中加入含不同濃度潮霉素的pda培養(yǎng)基3ml，濃度依次為：0mg/ml、2.5mg/ml、5mg/ml、10mg/ml、20mg/ml、30mg/ml、40mg/ml、50mg/ml；(3)將1x106、1x107cfu/ml的意大利青霉孢子懸浮液10ul，接種于添加了pda培養(yǎng)基的24孔細胞板上，25℃培養(yǎng)，觀察孢子生長情況。3.2.根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)意大利青霉轉(zhuǎn)化3.2.1意大利青霉孢子懸浮液的制備(1)意大利青霉接種于pda斜面培養(yǎng)基，25℃培養(yǎng)3d后；(2)用無菌水刮洗青霉菌孢子，以3層無菌的擦鏡紙過濾，血球板計數(shù)孢子數(shù)，離心，收集孢子，備用；(3)將孢子懸浮液用無菌水稀釋至1x105cfu/ml。3.2.2農(nóng)桿菌的誘導(dǎo)(1)將含有敲除載體的農(nóng)桿菌在含有卡那霉素的lb固體培養(yǎng)基上劃線，28℃培養(yǎng)2d；(2)挑選單菌落于8ml含卡那霉素的lb液體培養(yǎng)基中，28℃，180r/min震蕩培養(yǎng)至od600為0.8；(3)5000r/min離心5min收集農(nóng)桿菌菌體；(4)用5mlim培養(yǎng)基將菌體重懸浮至od600為0.25，28℃，180r/min震蕩培養(yǎng)至od600在0.5左右。3.2.3共培養(yǎng)(1)誘導(dǎo)后的農(nóng)桿菌與意大利青霉孢子懸浮液1:1混合；(2)涂布至鋪有無菌玻璃紙的co-im平板上；(3)25℃培養(yǎng)36h-48h。3.2.4轉(zhuǎn)化子的篩選(1)共培養(yǎng)后，將玻璃紙揭其，轉(zhuǎn)至孔的無菌培養(yǎng)皿中，然后在培養(yǎng)皿中加入含有濃度為50ug/ml的潮霉素b溶液和濃度為200ug/ml的頭孢霉素的pda培養(yǎng)基；(2)28℃培養(yǎng)，從第三d開始觀察，將長出的但菌落轉(zhuǎn)移至含有50ug/ml潮霉素b的pda培養(yǎng)基上；(3)若能繼續(xù)生長，則為陽性轉(zhuǎn)化子，保存并提dna驗證。4.不同的根癌農(nóng)桿菌類型對轉(zhuǎn)化的影響可用于絲狀真菌轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌菌株有很多種，常用的有：agl-1、eha105、gv3101、lba4404等，研究表明，不同的農(nóng)桿菌種類對不同真菌的轉(zhuǎn)化效率并不相同。本實驗使用實驗室已有的農(nóng)桿菌gv3101，以及廣泛用于轉(zhuǎn)化青霉菌的agl-1，將構(gòu)建好的敲除載體pacc3300分別轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌菌株gv3101和agl-1，進行轉(zhuǎn)化實驗，其余條件保持一致，通過比較轉(zhuǎn)化后長出的轉(zhuǎn)化子的數(shù)量，探究這兩種農(nóng)桿菌種類對農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化意大利青霉效率的影響。結(jié)果如圖2所示：a為用agl-1轉(zhuǎn)化，b為用gv3101轉(zhuǎn)化。用agl-1轉(zhuǎn)化得到了數(shù)個轉(zhuǎn)化子，而用gv3101進行轉(zhuǎn)化并未得到轉(zhuǎn)化子，最終用于介導(dǎo)意大利青霉轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌種類為agl-1。5.意大利青霉孢子濃度對轉(zhuǎn)化影響對轉(zhuǎn)化效率造成巨大影響的是轉(zhuǎn)化時使用的真菌材料的初始量，為了避免真菌或者根癌農(nóng)桿菌的生長背景過高引起的低轉(zhuǎn)化效率，應(yīng)該對農(nóng)桿菌和真菌濃度之間的配比進行摸索。本實驗將農(nóng)桿菌的濃度控制在od600＝0.8，使用不同的意大利青霉孢子懸浮液濃度與農(nóng)桿菌1:1混合，以確定不同的意大利青霉孢子懸浮液對轉(zhuǎn)化效率的影響，以及對后續(xù)篩選實驗的影響，設(shè)置的意大利青霉孢子懸浮液濃度為1x104、1x105、1x106、1x107cfu/ml，分別為圖3中的a、b、c、d。如圖3所示，當意大利青霉孢子懸浮液的濃度為1x104cfu/ml時，只長出了兩個轉(zhuǎn)化子；懸浮液的濃度為1x105cfu/ml時，長出了數(shù)十個轉(zhuǎn)化子；而當懸浮液的濃度達到106cfu/ml及以上時，雖然長出來很多的轉(zhuǎn)化子，但卻不好挑選單菌落。故農(nóng)桿菌介導(dǎo)意大利青霉轉(zhuǎn)化體系最終選定的孢子濃度是105cfu/ml。6.不同共培養(yǎng)溫度對轉(zhuǎn)化的影響轉(zhuǎn)化過程中的關(guān)鍵因素是共培養(yǎng)的溫度，研究表明，較低的溫度(20℃-25℃)有益于根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)移其t-dna，選擇共培養(yǎng)溫度時應(yīng)該集中考慮農(nóng)桿菌適宜轉(zhuǎn)化的溫度以及受體真菌的最適生長溫度，以避免農(nóng)桿菌或真菌的高背景生長。本實驗設(shè)置不同的共培養(yǎng)溫度，分別為22℃、25℃和28℃，其余條件同保持一致，進行轉(zhuǎn)化實驗，通過比較不同共培養(yǎng)溫度條件下轉(zhuǎn)化子的個數(shù)研究不同的共培養(yǎng)溫度對轉(zhuǎn)化子的影響，以篩選出最佳的共培養(yǎng)溫度。結(jié)果如圖4所示，a、b、c分別為共培養(yǎng)溫度22℃、25℃、28℃。22℃時，轉(zhuǎn)板時，玻璃紙上的菌落較少，最終得到的轉(zhuǎn)化子的個數(shù)也比較少；25℃時，農(nóng)桿菌與意大利青霉菌的生長速度相當，長出了較多的單菌落轉(zhuǎn)化子；而在28℃時，得到的轉(zhuǎn)化子個數(shù)相比25℃較少，推測原因是農(nóng)桿菌在最適生長溫度生長，抑制了意大利青霉菌的生長。綜上所述，本實驗最終確定的共培養(yǎng)溫度為25℃。7.不同共培養(yǎng)時間對轉(zhuǎn)化的影響意大利青霉和根癌農(nóng)桿菌的共培養(yǎng)時間對農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化的影響同樣不可忽視，共培養(yǎng)時間過長，會導(dǎo)致非轉(zhuǎn)化子背景過重，不便于后續(xù)的篩選實驗；而共培養(yǎng)時間過短，會導(dǎo)致農(nóng)桿菌未完成t-dna轉(zhuǎn)移，嚴重影響轉(zhuǎn)化效率。本實驗根據(jù)意大利青霉的生長速率，設(shè)置不同的共培養(yǎng)時間，分別為24h，36h和48h，其余條件保持一致。如圖5所示：a、b、c、d分別為共培養(yǎng)時間12h、24h、36h、48h。共培養(yǎng)12h、24h時，意大利青霉和菌絲均未得到廣泛生長，而共培養(yǎng)48h時，均生長過旺，這說明36h是共培養(yǎng)較為合適的時間，隨后將玻璃紙掀起轉(zhuǎn)至含有潮霉素b和頭孢霉素的pda培養(yǎng)基這一步驟也證明了這一個觀點，共培養(yǎng)12h時無轉(zhuǎn)化子長出，24h時轉(zhuǎn)化子個數(shù)不超過三個，而時間達到48h時，雖長出了大量的轉(zhuǎn)化子，但在操作過程中由于菌絲生長過于旺盛，在玻璃紙上倒培養(yǎng)基時容易將菌絲沖起，影響后續(xù)實驗。綜上所述，本實驗最終確定的共培養(yǎng)溫度為36h。8.添加乙酰丁香酮對轉(zhuǎn)化的影響共培養(yǎng)期間乙酰丁香酮作為誘導(dǎo)劑的加入對轉(zhuǎn)化是必須的，但在根癌農(nóng)桿菌的預(yù)誘導(dǎo)期間乙酰丁香酮是否加入也可能會對轉(zhuǎn)化效率造成影響。本實驗在誘導(dǎo)農(nóng)桿菌時，設(shè)置了不加as和加as的兩個對照，as的濃度為200umol/l，其余條件保持一致。如圖6所示，a為預(yù)誘導(dǎo)時不添加as，b為預(yù)誘導(dǎo)時添加as。預(yù)誘導(dǎo)時不添加as的平板上只長出幾個轉(zhuǎn)化子，而添加了as的長出了數(shù)十個轉(zhuǎn)化子，這說明，預(yù)誘導(dǎo)時as的添加極大的影響意大利青霉的轉(zhuǎn)化效率。9.不同的過濾膜對轉(zhuǎn)化的影響承載膜的種類同樣對轉(zhuǎn)化效率有影響，常用的材料有玻璃紙、微孔濾膜以及pvdf過濾器、尼龍膜、硝酸纖維素膜等。本實驗選用了較易得到的微孔濾膜和玻璃紙，探究承載膜對農(nóng)桿菌介導(dǎo)意大利青霉轉(zhuǎn)化的影響。其余條件保持一致。如圖7所示：a為使用微孔濾膜作為承載材料，b為使用玻璃紙作為承載材料。使用微孔濾膜作為承載膜材料時，轉(zhuǎn)板后只長出了8個轉(zhuǎn)化子；而用玻璃紙的則長出了很多轉(zhuǎn)化子。玻璃紙作為意大利青霉的轉(zhuǎn)化的承載膜材料，轉(zhuǎn)化效率比微孔濾膜高，為較優(yōu)材料。10.檢驗轉(zhuǎn)化子的遺傳穩(wěn)定性挑選長出的單菌落，在含有50ug/ml潮霉素b的pda培養(yǎng)基上培養(yǎng)，能繼續(xù)長出的轉(zhuǎn)化子即為陽性轉(zhuǎn)化子。將陽性轉(zhuǎn)化子在無潮霉素b抗性的pda培養(yǎng)基上連續(xù)傳代培養(yǎng)，再轉(zhuǎn)移至含有50ug/ml潮霉素b的pda培養(yǎng)基上，觀察轉(zhuǎn)化子在潮霉素b抗性平板上是否能繼續(xù)生長，繼續(xù)生長的轉(zhuǎn)化子提取dna，驗證是否為所需轉(zhuǎn)化子。如圖8所示，泳道1-3為隨機挑選的轉(zhuǎn)化子，泳道4為野生型意大利青霉，圖中抗性基因的條帶大小在2000bp，與預(yù)期的2.1kb相符合，而野生型對照并未出現(xiàn)條帶證明了該擴增實驗的可信度，得出結(jié)論：該轉(zhuǎn)化體系所得的轉(zhuǎn)化子較為穩(wěn)定。11.轉(zhuǎn)化子驗證將陽性轉(zhuǎn)化子在鋪有玻璃紙的、不含抗生素的pda培養(yǎng)基上涂布培養(yǎng)，長出后保存，并pcr驗證轉(zhuǎn)化子。按照以下步驟對轉(zhuǎn)化子的dna進行提?。?1)刮取平板面積1/3的菌絲體于無菌2ml離心管內(nèi)，加入800ul65℃預(yù)熱的ctab；(2)超聲5min后在65℃水浴30min，每十分鐘上下?lián)u晃混勻，冷卻至室溫；(3)每管加入tris酚/氯仿(1:1)溶液至近滿，充分混勻，12000rpm室溫離心10min，取上清液400ul于無菌1.5ml離心管中；(4)加入等體積的氯仿溶液，混勻，12000rpm離心10min，取上清液300ul于無菌1.5ml離心管中；(5)加入1/10體積3mol/lnaac，0.6倍體積的異丙醇以沉淀dna，震蕩混勻后-20℃放置1h以上；(6)12000rpm離心10min，棄上清，用500ul75％乙醇吹吸洗滌沉淀，12000rpm離心5min，棄上清；(7)重復(fù)步驟(6)，室溫蒸發(fā)75％乙醇；(8)加滅菌蒸餾水20ul，37℃水浴至沉淀溶解。以上述提取的轉(zhuǎn)化子dna為模板，使用easytaq常規(guī)擴增敲除目的基因pacc以及潮霉素b抗性基因。電泳檢測，同時滿足目的基因無條帶、抗性基因有條帶的轉(zhuǎn)化子則為敲除突變子；有抗性基因條帶的則為隨機插入轉(zhuǎn)化子，可用于構(gòu)建突變體庫。<110>華中農(nóng)業(yè)大學<120>一種根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的意大利青霉遺傳轉(zhuǎn)化方法<160>2<210>1<211>1977<212>dna<213>意大利青霉pacc基因<400>1atgtcggaaaatcataccccttctactacggcgaccttgcctgcgcctgtttctgaaccggcaccgattcaagcaacccctactccatccgcctcggtcacagcgactgccgccgccgccaccgcggcggtgaacagcccatccatgaatggcgccggtgagcagttgccttgtcagtgggtcggatgcactgagaagtctcctacggccgagtctctatatgtaagcttgatcaattaacttcaatacgaaagaagagatgctaatgattactgtttaggagcatgtttgtgagcgccacgttggacgcaaaagcaccaacaacctcaacctgacctgtcagtggggcacttgcaacaccacaacagtcaaacgtgatcatatcacttcccacatccgcgttcatgtaccactcaagcctcacaagtgcgacttctgcgggaaggctttcaagcgtccccaggatttgaagaagcatgtcaagactcatgccgacgactccgagatccgctcccccgaacccggcatgaagcatcctgatatgatgttcccccaaaaccctaagggttatgctgctgccacacattacttcgagagccctatcaatggtatcaatggccaatattcacacgcgccgcccccgcagtactaccagccacaccctccacctcaggctgctaacccgcattcctatggcaatgtatactatgccctgagtcaaggacaagagggaggccacccctatgatcgtaagcgcggatatgacgcgttgaacgagttttttggcgacctgaagcgtcgccagttcgaccctaattcctatgctgcggtcggccaacgtctgcttggtctgcaggcccttcagcttcccttcctcaatggccccgtgcctgaatatcagcaaatgcccgcctctgttgcggtcggcggtggcggtggtggttacagtcctggcggttctcagccacctggctaccaccttccccccatgtcaaatgtccggactaagaacgatttgatcaacatcgatcagttcctcgagcaaatgcagaacactatctacgaaagtgatgagaatgtggctgctgctggcgttgcccagcccggcgcgcattacgtgcatggtggcatgaactaccgcgccacccactctcccccaacccagctcccgccaagccacgttactgcaaccgcctcaacccccatgggggctgcttccgcccactccccctcggtcggcaccccggctctgaccccgccttccagcgcacagtcatacacttccaaccgctctcctatctccatgcaccacgctcaccgcgtgtctcctccccatgagagcggcccgggtatgtaccctcgcttgccgtcggccactgtcgccgacagcatgtccgcaggctacccgaccacctccggtgccgcaccgccctctaccctgagtggtgcgtatgaccacgatgatcgtcgccgctacactggtggtaccttgcaacgcgcccggccggccgagcgtgctgccaccgaggaccgcatggacatctcccaggatagcaagcatgacggcgagcgcactcccaccaaggcagctcacatctctgagagcctaattgaccccgctctatcgggtacttcggaggatcctgaccaggaggcagtcaagcgtactgcgcaagcggccaccgaagtcgccgagcgggatgtcaacgttcctgggttgagaaggtccgtcttcttgagaacctgcgtcgcctggtttcagaattgctcgaggctggtactgatgaatatggagtgcagagctcctcggcttctcctactcccggacttgatgccatggagggagttgagactgccagtcgtgctgcttctgagcagcccagggaagaggccaagtctccaagtgagggagtcttttatcccacattacgtggtgtggatgaggatgaggatggggactccaaaatgcctgagtaa<210>2<211>2204<212>dna<213>潮霉素b抗性基因<400>2cgacggccagtgccaagcttgcatgcctgcaggtcgacagaagatgatattgaaggagcactttttgggcttggctggagctagtggaggtcaacaatgaatgcctattttggtttagtcgtccaggcggtgagcacaaaatttgtgtcgtttgacaagatggttcatttaggcaactggtcagatcagccccacttgtagcagtagcggcggcgctcgaagtgtgactcttattagcagacaggaacgaggacattattatcatctgctgcttggtgcacgataacttggtgcgtttgtcaagcaaggtaagtgaacgacccggtcataccttcttaagttcgcccttcctccctttatttcagattcaatctgacttacctattctacccaagcatcgatatgaaaaagcctgaactcaccgcgacgtctgtcgagaagtttctgatcgaaaagttcgacagcgtctccgacctgatgcagctctcggagggcgaagaatctcgtgctttcagcttcgatgtaggagggcgtggatatgtcctgcgggtaaatagctgcgccgatggtttctacaaagatcgttatgtttatcggcactttgcatcggccgcgctcccgattccggaagtgcttgacattggggaattcagcgagagcctgacctattgcatctcccgccgtgcacagggtgtcacgttgcaagacctgcctgaaaccgaactgcccgctgttctgcagccggtcgcggaggccatggatgcgatcgctgcggccgatcttagccagacgagcgggttcggcccattcggaccgcaaggaatcggtcaatacactacatggcgtgatttcatatgcgcgattgctgatccccatgtgtatcactggcaaactgtgatggacgacaccgtcagtgcgtccgtcgcgcaggctctcgatgagctgatgctttgggccgaggactgccccgaagtccggcacctcgtgcacgcggatttcggctccaacaatgtcctgacggacaatggccgcataacagcggtcattgactggagcgaggcgatgttcggggattcccaatacgaggtcgccaacatcttcttctggaggccgtggttggcttgtatggagcagcagacgcgctacttcgagcggaggcatccggagcttgcaggatcgccgcggctccgggcgtatatgctccgcattggtcttgaccaactctatcagagcttggttgacggcaatttcgatgatgcagcttgggcgcagggtcgatgcgacgcaatcgtccgattcggagccgggactgtcgggcgtacacaaatcgcccgcagaagcgcggccgtctggaccgatggctgtgtagaagtactcgccgatagtggaaaccgacgccccagcactcgtccgagggcaaaggaatagagtagatgccgaccgggatccacttaacgttactgaaatcatcaaacagcttgacgaatctggatataagatcgttggtgtcgatgtcagctccggagttgagacaaatggtgttcaggatctcgataagatacgttcatttgtccaagcagcaaagagtgccttctagtgatttaatagctccatgtcaacaagaataaaacgcgtttcgggtttacctcttccagatacagctcatctgcaatgcattaatgcattggacctcgcaaccctagtacgcccttcaggctccggcgaagcagaagaatagcttagcagagtctattttcattttcgggagacgagatcaagcagatcaacggtcgtcaagagacctacgagactgaggaatccgctcttggctccacgcgactatatatttgtctctaattgtactttgacatgctcctcttctttactctgatagcttgactatgaaaattccgtcaccagcccctgggttcgcaaagataattgcactgtttcttccttgaactctcaagcctacaggacacacattcatcgtaggtataaacctcgaaaatcattcctactaagatgggtatacaatagtaaccatggttgcctagtgaatgctccgtaacacccaatacgccggccgaaacttttttacaactctcctatgagtcgtttacccagaatgcacaggtacacttgtttagaggtaatccttctttctagaggatccccgggtaccgagctcgaattcgtaatca當前第1頁12