專利名稱：一種農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉片轉(zhuǎn)化培育柑橘轉(zhuǎn)基因植株的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)領(lǐng)域。具體涉及ー種農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉片遺傳轉(zhuǎn)化培育柑橘轉(zhuǎn)基因植株的方法。
背景技術(shù)：
柑橘是我國的ー種重要果樹，在農(nóng)業(yè)結(jié)構(gòu)調(diào)整、農(nóng)民脫貧致富和出口創(chuàng)匯中具有重要的作用。近年來，我國柑橘產(chǎn)量和面積持續(xù)增長，居世界前列。但柑橘在發(fā)展過程中， 也受到很多生物和非生物逆境脅迫，因此培育抗逆品種對于柑橘產(chǎn)業(yè)持續(xù)穩(wěn)定發(fā)展至關(guān)重要。但作為多年生木本植物，柑橘生命周期長，樹體高大，遺傳背景復(fù)雜(基因高度雜合)、 童期長，最為關(guān)鍵的是大多數(shù)柑橘品種具有多胚特性，通過有性雜交很難獲得雜種?，F(xiàn)在的芽變選種也存在資源范圍狹窄及選種周期長、變異不確定性等問題?？傊?，采用常規(guī)的育種方法對柑橘進(jìn)行改良很難在短期內(nèi)達(dá)到預(yù)期目的，致使其遺傳育種進(jìn)展緩慢。近些年來，植物基因工程的開展及其在木本植物中的應(yīng)用為木本植物的遺傳改良帶來了無限生機(jī)。目前，柑橘遺傳轉(zhuǎn)化主要采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法和DNA直接導(dǎo)入法。農(nóng)桿菌介導(dǎo)法具有費(fèi)用低廉、操作簡便、重復(fù)性好以及轉(zhuǎn)化率相對較高等優(yōu)點(diǎn)，廣泛用于柑橘遺傳轉(zhuǎn)化。柑橘遺傳轉(zhuǎn)化第一例成功的報(bào)道是Hi daka等(Hi daka T，Omura M，Ugaki M.Agrobacterium-mediated transiormat ion and regenerat ion of Citrus spp. from suspension cells. Japan Journal of Breeding，1990，40 :199-207)的工作，他們首次用農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法獲得華盛頓臍橙轉(zhuǎn)基因植株。自此以后，柑橘遺傳轉(zhuǎn)化取得了長足的進(jìn)展。很多實(shí)驗(yàn)室均將農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法用于柑橘遺傳改良，證實(shí)了遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)在柑橘品種改良中應(yīng)用的可行性，從而加快了柑橘遺傳轉(zhuǎn)化研究的前進(jìn)步伐。迄今為止，已成功實(shí)現(xiàn)遺傳轉(zhuǎn)化的柑橘種類較多，包括柚類、甜橙、酸橙、檸檬和來檬類等，其中轉(zhuǎn)化最多的是甜橙，但寬皮柑橘類相對較少(如溫州蜜柑、紅橘、焦柑或櫳柑等)。此外，柑橘近緣植物(如枳及其雜種)也已經(jīng)轉(zhuǎn)化成功。當(dāng)前柑橘遺傳轉(zhuǎn)化的目的主要有第一，提高抗性，包括抗病(潰瘍病、黃龍病)和非生物逆境(干旱、高鹽、低溫、氧化脅迫等)；第二，縮短童期，利用開花相關(guān)的基因轉(zhuǎn)化多年生柑橘成功地得到在一年左右就能開花的轉(zhuǎn)基因植株；第三，提升品質(zhì)，主要有無核、著色及熟期等(李健，楊昌鵬。柑橘遺傳轉(zhuǎn)化育種研究進(jìn)展，安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，38 (3) :1209-1211)。利用于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的柑橘遺傳轉(zhuǎn)化受體組織有(外植體)有愈傷組織、上胚軸、下胚軸、子葉，用于DNA直接導(dǎo)入的受體主要是原生質(zhì)體，通過這些受體轉(zhuǎn)化均已得到轉(zhuǎn)基因植株。植物的離體葉片取材簡單，并且可以提供大量的轉(zhuǎn)化材料，是ー種理想的轉(zhuǎn)化受體。但是，迄今為止，國內(nèi)外均未見到利用葉片作為外植體開展柑橘遺傳轉(zhuǎn)化獲得轉(zhuǎn)基因植株的報(bào)道
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，利用離體培養(yǎng)的柑橘無菌苗葉片為轉(zhuǎn)化受體，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)獲得轉(zhuǎn)基因柑橘植株，為柑橘種質(zhì)創(chuàng)新和品種分子設(shè)計(jì)育種提供技術(shù)平臺。本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的ー種利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉片轉(zhuǎn)化培育轉(zhuǎn)基因柑橘植株的方法，其步驟包括遺傳轉(zhuǎn)化，用離體無菌苗葉片作為遺傳轉(zhuǎn)化的受體材料，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)將GFP報(bào)告基因?qū)胧荏w，利用卡那霉素作為選擇劑對轉(zhuǎn)化后的受體材料進(jìn)行篩選，通過載體上的基因設(shè)計(jì)特異引物進(jìn)行PCR和GFP熒光觀察檢測篩選得到轉(zhuǎn)基因柑橘植株。具體地，本發(fā)明的方法如下1)在離體條件下播種柑橘種子于MS培養(yǎng)基上(附加8g/L的瓊脂)獲得無菌苗 (詳見實(shí)施例1)。2)將步驟1)的柑橘無菌苗葉片切成Icm2的方塊，每個小方塊用刀刻傷造成傷ロ， 置于OD6tltl為0. 2-1農(nóng)桿菌菌液中浸泡10分鐘(每2-3分鐘搖動一次)；將侵染后的葉片依次轉(zhuǎn)移至共培養(yǎng)培養(yǎng)基、選擇培養(yǎng)基、生芽培養(yǎng)基和生根培養(yǎng)基上培養(yǎng)，篩選獲得侯選轉(zhuǎn)基因植株；其中所述共培養(yǎng)的步驟包括，取出農(nóng)桿菌侵染過的葉片，用無菌濾紙上吸干，接入共培養(yǎng)培養(yǎng)基(MT 培養(yǎng)基 +0. lmg/L NAA+0. 5mg/L BA+0. 5mg/L KT+25mg/L 乙酰丁香酮， 附加蔗糖30g/L，瓊脂8g/L，pH5.8)中；在沈士 1°C黑暗條件下培養(yǎng)3d ；其中所述的選擇培養(yǎng)步驟包括，將共培養(yǎng)后的葉片在添加有200mg/L頭孢霉素(Cefotaxime)的無菌水中洗3_4次，用無菌濾紙上吸干后接入選擇培養(yǎng)基(MT培養(yǎng)基 +0. lmg/LNAA+0. 5mg/L6_芐基氨基嘌呤(6_BA)+0. 5mg/L 細(xì)胞激動素(KT)+50mg/L 卡那霉素 +250mg/L Cefotaxime，附加蔗糖30g/L，瓊脂8g/L，pH 5.8)上，在黑暗條件下培養(yǎng)4周，然后轉(zhuǎn)入光照條件(45μπκ)1 HT2s-1)下培養(yǎng)誘導(dǎo)不定芽，每隔3-4周更換一次新鮮的選擇培養(yǎng)基直至不定芽的分化。其中所述芽伸長培養(yǎng)步驟包括，將分化培養(yǎng)葉片上的芽長到1-1. 5cm吋，切下轉(zhuǎn)入芽伸長培養(yǎng)基(MT培養(yǎng)基+0. 2mg/L6-BA+0. 2mg/L萘乙酸(NAA)+0. 2mg/L赤霉素 (GA) +50mg/L 卡那霉素 +250mg/LCefotaxime，附加蔗糖 30g/L，瓊脂 8g/L)上；pH 5. 8，以促
進(jìn)芽進(jìn)一歩的伸長。其中所述生根培養(yǎng)步驟包括，將發(fā)育良好的芽切下，接入生根培養(yǎng)基(1/2MT培養(yǎng)基 +0. 5mg/L NAA+0. lmg/L 吲哚丁酸(IBA)，附加蔗糖 25g/L，0. 5g/L 活性碳，瓊脂 8g/L， PH 5. 8)。，對抗性植株進(jìn)行篩選，從而獲得候選轉(zhuǎn)基因抗性植株，3) PCR檢測候選轉(zhuǎn)基因植株，具體方法如下根據(jù)nptll選擇標(biāo)記基因和GFP報(bào)告基因的序列設(shè)計(jì)特異引物，擴(kuò)增nptll基因的引物序列如下正向引物，5，-TGCGCTGCGAATCGGGAGCG-3，
反向引物，5，-GAGGCTATTCGGCT-ATGACT-3，；PCR擴(kuò)增得到nptll基因特異DNA片段，其片段長度為740bp (見序列表SEQ ID NO 1)；擴(kuò)增nGFP基因的引物序列如下
正向引物，TGGCCAACACTTGTCA-CTAC-3，，反向引物，5，-AGGACCATGTGGTCTCTCTT-3，；PCR擴(kuò)增nptll基因特異DNA片段，片段長度為491bp (見序列表SEQ ID NO 2)。4)GFP瞬時表達(dá)觀察和PCR陽性植株GFP熒光觀察取部分轉(zhuǎn)化的外植體，在 Leica熒光顯微鏡(MZFLIII)下觀察；PCR檢測呈陽性的植株，也在同一種顯微鏡上觀察。本發(fā)明的積極效果是本發(fā)明是在國內(nèi)外首次利用葉片轉(zhuǎn)化獲得柑橘轉(zhuǎn)基因植株，為今后柑橘的遺傳改良如利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)培育抗逆(生物和非生物逆境)種質(zhì)資源提供了新的技術(shù)平臺。


圖1.本發(fā)明技術(shù)路線圖。圖2.是本發(fā)明應(yīng)用的一個報(bào)道的質(zhì)粒PPI121的物理圖譜。圖3.是本發(fā)明的實(shí)施例中葉片GFP瞬間表達(dá)檢測。圖4.是柑橘葉片外植體在不同培養(yǎng)基上的狀況。其中圖4A:柑橘葉片外植體在共培養(yǎng)基上生長情況；圖4B 柑橘葉片外植體在選擇培養(yǎng)基上由切ロ處長芽；圖4C 抗性芽在芽伸長培養(yǎng)基上；圖4D 在伸長培養(yǎng)基上増殖芽。圖5.抗性芽在生根培養(yǎng)基上生根情況。圖6.是葉片轉(zhuǎn)化再生的轉(zhuǎn)基因植株群體和盆栽植株；其中圖6A 獲得的轉(zhuǎn)基因植株群體，圖6B 盆栽轉(zhuǎn)基因植株。圖7.是本發(fā)明的實(shí)施例中PCR陽性株系的GFP熒光觀察及明場下觀察結(jié)果，其中圖7A =GFP熒光觀察結(jié)果，圖7B 明場下的觀察結(jié)果。圖8.是抗性植株在NPTII基因和GFP基因的PCR檢測結(jié)果。其中圖8A 是轉(zhuǎn)NPTII 基因PCR檢測結(jié)果；圖8B 轉(zhuǎn)GFP基因PCR檢測結(jié)果。圖9.卡那霉素對柑橘葉片成活率的影響。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例進(jìn)ー步定義本發(fā)明。根據(jù)以上的描述和這些實(shí)施例，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以確定本發(fā)明的基本特征，并且在不偏離本發(fā)明精神和范圍的情況下，可以對本發(fā)明作出各種改變和修改，以使其適用各種用途和條件。實(shí)施例11)外植體的準(zhǔn)備將柑橘品種伏令夏橙(ー個夏季成熟的常用栽培甜橙品種，來自華中農(nóng)業(yè)大學(xué)柑橘研究所果園)種子從果實(shí)中取出后，先用IM的氫氧化鈉溶液處理20分鐘，無菌水洗3次， 再用有效氯為2. 5%的次氯酸鈉溶液消毒5-20分鐘，將消毒后的柑橘種子播種在附加有 30g/L鹿糖禾ロ8g/L瓊月旨的MT (Murashige T and Tu cker DPH. Growth factor requirements of Citrus tissue culture. Proc. First Intl. Citrus Symp,1969,3 :1155-1161) Jfl^ffe 上(pH5.8)，光下(45 μ mo 1 πΓ、—1光照強(qiáng)度，每天光照時間16h)培養(yǎng)4_12周獲得無菌苗。
2)農(nóng)桿菌菌液的制備轉(zhuǎn)化前取一小管農(nóng)桿菌菌液用滅菌的接種針刮拭培養(yǎng)皿，劃線于含50mg/L卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基(培養(yǎng)基成分及配比5g/L Tryptone+10g/LNaCl+5g/L麥芽提取物 +50mg/L卡那霉素)上，28°C培養(yǎng)2天，使菌種復(fù)蘇并形成單菌落，此盤作為菌種盤。從菌種盤中挑取單菌落劃線涂滿新的LB固體培養(yǎng)基，觀で下培養(yǎng)2天，使農(nóng)桿菌増殖，然后用滅菌小刀將菌體收集到含25mg/L乙酰丁香酮的液體MT液體培養(yǎng)基(王關(guān)林等，植物基因工程第三版，2002版，科學(xué)出版社，北京)中，180-200r/min懸浮菌體，待菌液0D600值達(dá)0. 2-1 后進(jìn)行侵染。3)侵染將步驟1)中的柑橘無菌苗葉片切成Icm2的方塊，每個小方塊用手木刀片在葉背垂直主脈方向劃傷3-4刀后，置于步驟幻中的農(nóng)桿菌菌液中浸泡10分鐘，期間每 2-3分鐘搖動一次。4)共培養(yǎng)將步驟幻中葉片從農(nóng)桿菌液中取出，用無菌濾紙吸干，接入共培養(yǎng)培養(yǎng)基(成分及配比見表1)中；在沈士rc黑暗條件下培養(yǎng)3d。5)選擇培養(yǎng)將步驟4)中葉片轉(zhuǎn)入選擇培養(yǎng)基(成分見表1)上，先暗培養(yǎng)4周， 然后轉(zhuǎn)入光照條件(45μπι01 HT2s-1)進(jìn)行不定芽的誘導(dǎo)，此后，每隔3-4周換一次新鮮的選擇培養(yǎng)基直至不定芽分化。6)抗性芽進(jìn)ー步篩選及芽伸長培養(yǎng)將步驟幻中再生出小芽的葉片從培養(yǎng)基中取出，轉(zhuǎn)移至芽伸長培養(yǎng)基(見表1)中進(jìn)行抗性芽進(jìn)ー步篩選和促進(jìn)芽伸長。7)抗性苗的生根將步驟6)中經(jīng)過篩選后、苗高1-3厘米的抗性苗切下轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基(見表1)中進(jìn)行生根培養(yǎng)，從而獲得候選轉(zhuǎn)基因抗性植株。上述培養(yǎng)基按照報(bào)道的方法滅菌，即在高壓蒸汽121°C下滅菌20min，備用。8)抗性植株的PCR檢測將步驟7)中抗性植株進(jìn)行PCR檢測，利用報(bào)道的PCR 分子鑒定技術(shù)(具體程序參見梁國棟主編，最新分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技木，科學(xué)出版社， 2001)，同時參照 Liu 等(Liu JH, Pang XM, Cheng YJ, Meng HJ, and Deng X X. Molecular characterization οι the nuclear ana cytoplasmic genomes of mtergeneric diploid plants from cell fusion between Microcitrus papuana and rough lemon. Plant Cell R印，2002，21 :327-332.)報(bào)道的提取總DNA的方法，根據(jù)選擇標(biāo)記基因(基因nptll，登錄號:gi 11842446)和報(bào)告基因(GFP，登錄號AF485783. 1)的序列資料設(shè)計(jì)特異引物其中克隆nptll基因的引物序列為正向引物，5，-TGCGCTGCGAATCGGGAGCG-3，反向引物，5，-GAGGCTATTCGGCT-ATGACT-3，；PCR擴(kuò)增nptll基因的特異DNA片段，其片段長度為740bp (見SEQ ID NO :1所
示)°擴(kuò)增GFP基因的引物序列為正向引物，TGGCCAACACTTGTCA-CTAC-3，，反向引物，5，-AGGACCATGTGGTCTCTCTT-3，；PCR擴(kuò)增GFP基因得到特異DNA片段，其片段長度為491bp (見SEQ ID NO :2所
示)°PCR循環(huán)反應(yīng)參數(shù)94°C變性4分鐘，然后依次在94°C變性40秒，55°C復(fù)性40秒， 72°C延伸40秒，循環(huán)30次后在72°C保溫5分鐘。
PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在含溴化乙錠的0. 8%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳檢測，紫外熒光下觀察結(jié)果并照相。9)GFP熒光觀察對在農(nóng)桿菌侵染后的葉片及PCR檢測呈陽性的株系進(jìn)行GFP熒光觀察。熒光觀察在Leica熒光顯微鏡(MZFLIII)下完成，具有480/40nm激發(fā)光濾片、505nm LP雙色束分離器和510nm LP阻斷濾片。表1本發(fā)明用于柑橘葉片轉(zhuǎn)基因植株培育的各類培養(yǎng)基配方
培養(yǎng)基類型_配方_
無菌苗培養(yǎng)基 MT 培養(yǎng)基+0.3mg/L6-BA+0.05mg/LNAA;瓊脂 8g/L; pH5.8 共培養(yǎng)培養(yǎng)基 MT 培養(yǎng)基+0.1 mg/L NAA+0.5 mg/L 6-ΒΛ+0.5 mg/L KT+25 mg/L 乙酰丁
香酮+蔗糖30g/L;瓊脂8g/L; pH5.8 選擇培養(yǎng)基 MT 培養(yǎng)基+0.1 mg/LNAA+0.5 mg/L6-BA+0.5 mg/LKT+50 mg/L 卡那霉素
+250 mg/L Cefotaxime+蔗糖 30g/L, pH5.8 芽伸長培養(yǎng)基 MT培養(yǎng)基+0.2 111§/し6-8八+0.2111§/1^八八+ 0.2111§/^赤霉素(GA) + 50 mg/L 卡那霉素+250 mg/L Cefotaxime +蔗糖 30g/L，pH5.8 __生根培養(yǎng)基_1/2MT 培養(yǎng)基+0.5 mg/L _NAA+0.1 mg/L+IBA +蔗糖 25g/L; pH5.8實(shí)施例2 柑橘葉片轉(zhuǎn)化獲得轉(zhuǎn)基因植株1、轉(zhuǎn)化受體材料及培養(yǎng)方法在中國湖北省武漢市華中農(nóng)業(yè)大學(xué)國家柑橘育種中心采集伏令夏甜橙果實(shí)，種子從果實(shí)中取出后，用IM氫氧化鈉處理20分鐘，無菌水洗3次，再用有效氯為2. 5%的次氯酸鈉溶液消毒5-20分鐘，無菌水洗2-3次，播種在附加有30g/L蔗糖和8g/L瓊脂的 MT(Murashige T, Tucker D P H. Growth factor requirements of Citrus tissue culture. Proc. First Intl. Citrus Symp, 1969,3 :1155-1161)培養(yǎng)基(pH5. 8)上，在光下培養(yǎng)4-12周獲得無菌苗。除特別說明外，本發(fā)明的培養(yǎng)基成分如表1所示。培養(yǎng)基按常規(guī)方法滅菌。2、轉(zhuǎn)化載體材料及培養(yǎng)方法包含報(bào)道質(zhì)粒pBI121(見Genbank，基因登錄號AF485783. 1，該質(zhì)粒的物理圖譜參見附圖2)的根癌農(nóng)桿菌菌株為EHA105由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)作物遺傳改良國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室郭文武教授惠贈，該質(zhì)粒攜帯GFP報(bào)告基因和NPTII選擇基因。(1)菌株的活化從-70°C冰箱取出所保存的菌種，用接種環(huán)劃取后直接劃平板，平板為LB培養(yǎng)基 (成分蛋白胨10g/L ；酵母浸膏5g/L ；氯化鈉10g/L ；瓊脂粉13g/L ；補(bǔ)足蒸餾水至IL ；調(diào) pH至7. 0-7. 2 (王關(guān)林和方宏筠，1998)，培養(yǎng)農(nóng)桿菌時附加卡那霉素(Kan) 50mg/L。將平板放入觀で溫箱毎，培養(yǎng)至單菌落產(chǎn)生。(2)菌株的保存將平板放入4°C冰箱保存，每半個月活化一次。若要在-70°C下保存，則從平板上挑單菌落于附加相應(yīng)100mg/L Kan的液體LB培養(yǎng)基中，放入恒溫?fù)u床上觀で150rpm/min 搖菌至OD6qq = 1. 0，在己滅菌的1. 5mLEppendorf管中加入0. 85mL農(nóng)桿菌菌液和0. 15mL甘油，放入冰箱長期保存。3、農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法1)轉(zhuǎn)化受體準(zhǔn)備取上述培養(yǎng)的柑橘無菌苗葉片切成Icm2的方塊，每個小方塊用手術(shù)刀片在葉背垂直主脈方向劃傷3-4刀后，作為轉(zhuǎn)化受體用于侵染。2)菌液的制備從菌種盤中挑取單菌落劃線涂滿新的LB固體培養(yǎng)基，28°C下培養(yǎng) 2天，使農(nóng)桿菌増殖，然后用滅菌小刀將菌體收集到含25mg/L乙酰丁香酮的液體MT液體培養(yǎng)基中，180-200r/min懸浮菌體，待菌液0D600值達(dá)0. 2-1后進(jìn)行侵染。3)侵染將步驟1)中葉片置于2)中的農(nóng)桿菌菌液中浸泡lOmin。4)共培養(yǎng)將步驟3)中葉片取出并用無菌濾紙吸去表面多余的菌液，葉背面向下接入共培養(yǎng)培養(yǎng)基(成分見表1)中，沈士1で條件下黑暗培養(yǎng)3天。5)選擇培養(yǎng)將步驟4)的葉片轉(zhuǎn)入選擇培養(yǎng)基(成分見表1)上，先暗培養(yǎng)4周， 然后轉(zhuǎn)至光照條件下(45μπι01 HT2s-1)進(jìn)行不定芽的誘導(dǎo)。此后，每隔3-4周更換一次新鮮選擇培養(yǎng)基直至不定芽分化6)抗性芽進(jìn)ー步篩選及芽伸長培養(yǎng)將步驟幻中再生出小芽的葉片從培養(yǎng)基中取出，轉(zhuǎn)移至芽伸長培養(yǎng)基(成分見表1)中進(jìn)行抗性芽進(jìn)ー步篩選和促進(jìn)芽伸長。7)抗性苗的生根將步驟6)中經(jīng)過篩選后、苗高1-3厘米抗性苗切下轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基(成分見表1)中進(jìn)行生根培養(yǎng)，獲得候選轉(zhuǎn)基因抗性植株。轉(zhuǎn)化中設(shè)接種未經(jīng)農(nóng)桿菌侵染的葉片和經(jīng)農(nóng)桿菌侵染但不加選擇兩種處理作對照。3、GFP基因瞬間表達(dá)觀察取共培養(yǎng)過的葉片，用無菌濾紙吸干表面液體后，然后置于ー干凈的載玻片上，在 Leica熒光顯微鏡(MZFLIII)下觀察熒光，該顯微鏡具有480/40nm激發(fā)光濾片、505nm LP 雙色束分離器和510nm LP阻斷濾片。GFP瞬間表達(dá)情況見圖3。圖3表明，在葉片上能看到GFP熒光，因此，從瞬間表達(dá)的結(jié)果看來，葉片轉(zhuǎn)化能有瞬間表達(dá)。4、植株再生放置于選擇培養(yǎng)基上的葉片(圖4A)在培養(yǎng)一段時間后，在切ロ片先出現(xiàn)凸起，隨著時間的延長，凸起繼續(xù)長大直至成芽(圖4B)，部分芽在選擇培養(yǎng)基上生長一段時間后會慢慢死去，而具有抗性的芽則存活下來并不斷長大(圖4B)，在選擇培養(yǎng)基上生長(多長時間？)后轉(zhuǎn)入伸長培養(yǎng)基(多長時間？)后，芽就會逐漸生長正常(圖4C)，將一部分芽切下后再轉(zhuǎn)入新鮮芽伸長培養(yǎng)基會有大量的芽増殖(圖4D)。將3厘米左右的芽切下，轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基(成分見表1)，1個月左右就能形成完整的根(圖幻。等植株有2-3條根時，揭開試管蓋進(jìn)行馴化，然后移入小塑料杯中，置于溫室中培養(yǎng)(圖6A)，等生長正常后，移入更大體積的容器中生長(圖6B)。5、對在選擇培養(yǎng)基上再生抗性植株的GFP觀察隨機(jī)選取部分在選擇培養(yǎng)基上繼代多次的抗性植株，觀察GFP熒光，所用方法同 GFP瞬間表達(dá)。其中一個植株的熒光觀察如圖7所示，從圖7可以看出，在明場視野中的植株(圖7A)在UV激發(fā)下可以清楚地看到植株中有綠色熒光，但熒光分布并不是在整個植株是均勻的(圖7B)。6、轉(zhuǎn)基因植株的PCR檢測
參照Liu 等(Liu J H, Pang X M, Cheng Y J，Meng H J, and Deng X X. Molecular characterization of the nuclear and cytoplasmic genomes of intergeneric diploid plants from cell fusion between Microcitrus papuana and rough lemon. Plant Cell R印，2002，21 :327-332.)報(bào)道提取葉片總DNA的方法，提取轉(zhuǎn)化后再生植株和未轉(zhuǎn)化植株的葉片總DNA。根據(jù)選擇標(biāo)記基因(nptll)和報(bào)告基因GFP的序列設(shè)計(jì)引物如下的引物序列。擴(kuò)增nptll基因的引物序列為正向引物，5，-TGCGCTGCGAATCGGGAGCG-3，反向引物，5，-GAGGCTATTCGGCT-ATGACT-3，。擴(kuò)增GFP基因引物的序列如下為正向引物，TGGCCAACACTTGTCA-CTAC-3，，反向引物，5，-AGGACCATGTGGTCTCTCTT-3，；
0099]反應(yīng)體系為
0100]去離子水19μ1;
0101]dNTP (2mM)0. 5 μ 1 ；
0102]Primerl(IOmM)0.5ul ；
0103]Primer2(IOmM)0.5 μ 1 ；
0104]IOXBuffer2. 5 μ 1 ；
0105]Taq 酶(5U/L)1 μ 1 ；
0106]模板 DNA (20ng/ μ 1)1 μ 1 ；
0107]總體積25μ1;PCR循環(huán)反應(yīng)參數(shù)94°C變性4分鐘，然后依次在94°C變性40秒，55°C復(fù)性40秒， 72°C延伸40秒，循環(huán)30次后在72°C保溫5分鐘。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在含溴化乙錠的0. 8%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳檢測，紫外熒光下觀察結(jié)果并照相。將轉(zhuǎn)化葉片再生植株和未轉(zhuǎn)化植株中提取植物基因組DNA作為模板，以農(nóng)桿菌質(zhì)粒DNA作為陽性對照，以未轉(zhuǎn)化的無菌苗DNA作為陰性對照，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果如圖8所示，質(zhì)粒DNA擴(kuò)增出現(xiàn)預(yù)期大小的片段，未轉(zhuǎn)化的植株基因組未出現(xiàn)PCR特異擴(kuò)增片段，轉(zhuǎn)基因植株經(jīng)PCR擴(kuò)增，均得到與質(zhì)粒DNA擴(kuò)增產(chǎn)物大小一樣的片段，其中NPTII基因片段大小為740bp (見序列表SEQ ID NO :1，圖8A)，GFP基因片段大小為491bp (見序列表SEQ ID NO 2,圖 8B)。實(shí)施例2 對比試驗(yàn)的實(shí)施例1、伏令夏橙葉片對卡那霉素的敏感性比較本實(shí)施例所用質(zhì)粒為pBI121(華中農(nóng)業(yè)大學(xué)作物遺傳改良國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室郭文武惠贈)，該質(zhì)粒攜帯有選擇標(biāo)記基因?yàn)閚ptll，對卡那霉素具有抗性。由于伏令夏橙葉片用于轉(zhuǎn)化以前未見報(bào)道，對較適合的用于轉(zhuǎn)化選擇壓力的卡那霉素濃度并沒有報(bào)道，因此， 本發(fā)明將未轉(zhuǎn)化的無菌苗葉片、試管苗分別接入含不同濃度的卡那霉素的培養(yǎng)基中，觀察并統(tǒng)計(jì)不同濃度的選擇劑對不同外植體生長的影響，以確定不同外植體在不同選擇劑中相應(yīng)的選擇濃度。以伏令夏橙無菌苗葉片為外植體，確定卡那霉素對其再生的影響，以選擇相應(yīng)的卡那霉素選擇壓力用于轉(zhuǎn)化。將Icm2大小的小葉片接種于附加不同濃度卡那霉素的葉片再生培養(yǎng)基(MT 培養(yǎng)基 +0. lmg/LNAA+0. 5mg/L BAP+0. 5mg/L KT+ 蔗糖 30g/L+ 瓊脂 8g/L，pH5. 8)上，設(shè)0、50、100、200和250mg/L五種卡那霉素濃度梯度(卡那霉素過濾滅菌后加入培養(yǎng)基至相應(yīng)濃度)。每15天更換一次新鮮培養(yǎng)基，60天后統(tǒng)計(jì)外植體的褐化率，計(jì)算成活率。本發(fā)明中發(fā)現(xiàn)，伏令夏橙葉片接種在含有卡那霉素的培養(yǎng)基上，生長會受到抑制。成活率隨卡那霉素濃度增大而逐漸降低，當(dāng)有50mg/L卡那霉素存在時，成活率就由對照的100%降低到60%左右，100mg/L和200mg/L卡那霉素存在時的成活率分別為40%和30%左右(圖9)。為了保證有較大數(shù)量的陽性轉(zhuǎn)化子，因此本發(fā)明的選擇培養(yǎng)基中卡那霉素的最適濃度為50mg/L。2、葉齡對農(nóng)桿菌侵染后GFP瞬間表達(dá)、再生率和轉(zhuǎn)化效率的影響取生長不同時間(1、2、3、4個月)的葉片作為外植體，在相同轉(zhuǎn)化條件下進(jìn)行農(nóng)桿菌侵染試驗(yàn)，經(jīng)共培養(yǎng)、脫菌培養(yǎng)，每15天換一次脫菌培養(yǎng)基，觀察葉齡對農(nóng)桿菌侵染后GFP瞬間表達(dá)的影響；2個月后統(tǒng)計(jì)抗性芽再生比例，計(jì)算轉(zhuǎn)化效率(GFP觀察有熒光的外植體數(shù)量* 100/總的轉(zhuǎn)化外植體數(shù))。本實(shí)施例中將葉片用OD值為0. 6的根癌農(nóng)桿菌菌液進(jìn)行侵染試驗(yàn)，共培養(yǎng)3天后，用無菌蒸餾水洗凈表面菌體，用無菌濾紙吸干，接入脫菌培養(yǎng)基中。然后，對葉片GFP瞬間表達(dá)情況進(jìn)行觀察，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，葉齡對瞬間表達(dá)影響較大(表2)。從表2中可以看出，3個月葉齡的葉片轉(zhuǎn)化后，能觀察到GFP熒光的葉片點(diǎn)34. 43%,而且此類葉片的再生頻率也最高。1-2個月的葉片轉(zhuǎn)化后，有GFP熒光的葉片所占比例和再生頻率均最低，因此，本實(shí)施例中將播種后自第一片真葉出現(xiàn)后3個月的葉片用于最終轉(zhuǎn)化。
表2、葉齡對農(nóng)桿菌侵染后GFP瞬間表達(dá)、再生率和和轉(zhuǎn)化效率的影響
權(quán)利要求
1.ー種利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的柑橘葉片轉(zhuǎn)化培育轉(zhuǎn)基因植株的方法，其步驟包括遺傳轉(zhuǎn)化及植株鑒定，其特征在于，采用離體柑橘無菌苗葉片作為遺傳轉(zhuǎn)化的受體材料，經(jīng)農(nóng)桿菌侵染、共培養(yǎng)、恢復(fù)培養(yǎng)、選擇和生根培養(yǎng)，將GFP報(bào)告基因?qū)胧荏w，利用卡那霉素作為選擇劑對轉(zhuǎn)化后的受體細(xì)胞進(jìn)行篩選，通過GFP熒光觀察和PCR檢測篩選得到轉(zhuǎn)基因植株；其步驟如下1)將柑橘種子在離體培養(yǎng)基上播種，獲得柑橘無菌苗葉片；2)將步驟1)的無菌苗葉片用刀刻傷，置于OD6tltl為0.2 1的農(nóng)桿菌菌液中浸泡10分鐘；將侵染過的葉片接入共培養(yǎng)培養(yǎng)基中，在26士 1°C黑暗條件下培養(yǎng)3天；3)侵染將步驟1)中的柑橘無菌苗葉片切成Icm2的方塊，每個小方塊用手術(shù)刀片在葉背垂直主脈方向劃傷3-4刀后，置于步驟幻中的農(nóng)桿菌菌液中浸泡10分鐘，期間每2-3分鐘搖動一次；4)共培養(yǎng)將步驟幻中葉片從農(nóng)桿菌液中取出，用無菌濾紙吸干，接入共培養(yǎng)培養(yǎng)基中；在沈士 1°C黑暗條件下培養(yǎng)3d;5)選擇培養(yǎng)將步驟4)中葉片轉(zhuǎn)入選擇培養(yǎng)基上，先暗培養(yǎng)4周，然后轉(zhuǎn)入光照條件 (45 μ Hi0InT2s-1)進(jìn)行不定芽的誘導(dǎo)，此后，每隔3-4周換一次新鮮的選擇培養(yǎng)基直至不定芽分化；6)抗性芽進(jìn)ー步篩選及芽伸長培養(yǎng)將步驟幻中再生出小芽的葉片從選擇培養(yǎng)基中取出，將其轉(zhuǎn)移至芽伸長培養(yǎng)基中進(jìn)行抗性芽進(jìn)ー步篩選和促進(jìn)芽伸長；7)抗性苗的生根將步驟6)中苗高為1-3厘米的抗性苗切下轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中進(jìn)行生根培養(yǎng)，從而獲得候選轉(zhuǎn)基因抗性植株。8)對候選轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行PCR檢測，對檢測為陽性的株系進(jìn)行GFP熒光觀察，驗(yàn)證獲得轉(zhuǎn)基因植株；培養(yǎng)基的組分及其配比如下離體培養(yǎng)基MS培養(yǎng)基的無機(jī)鹽大量成分和無機(jī)鹽微量成分，8g/L瓊脂；pH 5. 8 ；共培養(yǎng)培養(yǎng)基MT培養(yǎng)基+0. lmg/L萘乙酸+0. 5mg/L 6-芐基氨基嘌呤+0. 5mg/L細(xì)胞激動素+25mg/L乙酰丁香酮；蔗糖30g/L ；瓊脂8g/L ；pH 5. 8 ；選擇培養(yǎng)基MT培養(yǎng)基+0. lmg/L萘乙酸+0. 5mg/L 6-芐基氨基嘌呤+0. 5mg/L細(xì)胞激動素+50mg/L卡那霉素+250mg/L頭孢霉素；蔗糖30g/L ；瓊脂8g/L ；pH 5. 8 ；芽伸長培養(yǎng)基MT培養(yǎng)基+0. 2mg/L 6-芐基氨基嘌呤+0. 2mg/L萘乙酸+0. 2mg/L赤霉素+50mg/L卡那霉素+250mg/L頭孢霉素；蔗糖30g/L ；瓊脂8g/L ；pH 5. 8生根培養(yǎng)基1/2MT培養(yǎng)基+0. 5mg/L萘乙酸+0. lmg/L吲哚丁酸；蔗糖25g/L ；0. 5g/L 活性碳；瓊脂8g/L ；pH 5.8。
2.權(quán)利要求1所述的方法在培育柑橘轉(zhuǎn)基因植株上的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明屬于植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明涉及柑橘轉(zhuǎn)基因植株的培育方法。公開了一種利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)，以柑橘試管苗葉片為外植體培育轉(zhuǎn)基因柑橘植株的方法，其步驟包括遺傳轉(zhuǎn)化、篩選再生、PCR檢測和GFP熒光觀察。其特征在于，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)將GFP報(bào)告基因?qū)胧荏w柑橘葉片，對影響葉片轉(zhuǎn)化的不同因素進(jìn)行篩選，利用卡那霉素作為選擇劑，對轉(zhuǎn)化后的受體細(xì)胞進(jìn)行篩選，通過PCR檢測，GFP熒光檢測等輔助方法篩選得到轉(zhuǎn)基因柑橘植株。本發(fā)明為柑橘遺傳轉(zhuǎn)化創(chuàng)新種質(zhì)資源提供了新的技術(shù)平臺。
文檔編號G01N21/64GK102586317SQ201110004838
公開日2012年7月18日 申請日期2011年1月10日 優(yōu)先權(quán)日2011年1月10日
發(fā)明者付行政, 劉繼紅, 艾山 申請人:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)